茹 毅 沈?qū)幯?倪 輝，2，3，4 陳艷紅，2，3，4 肖安風(fēng)，2，3，4*

（1 集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 福建廈門(mén)361021 2 福建省食品微生物與酶工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建廈門(mén)361021 3 福建省海洋功能食品工程技術(shù)研究中心 福建廈門(mén)361021 4 廈門(mén)市海洋功能食品重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福建廈門(mén)361021）

蝦青素（Astaxanthin），又名3，3，-二羥基-β羥β′-胡蘿卜素-4，4′-二酮，是一種具有超強(qiáng)抗氧化活性的類胡蘿卜素[1，2]。蝦青素可以有效抑制細(xì)胞的氧化損傷，降低機(jī)體的突變和癌變，同時(shí)還具有抗高血壓，預(yù)防心血管疾病，增強(qiáng)免疫，防紫外線輻射等諸多功效[3]。蝦青素在食品、飼料、保健品和醫(yī)藥等行業(yè)的應(yīng)用與日俱增，如日本將蝦青素與藍(lán)莓提取物組配，以強(qiáng)化對(duì)視力的保護(hù)效果[4]。美國(guó)Cyanotech 公司推出的Derma Astin（黛瑪）天然蝦青素膠囊具有抗衰老功能[4]。作為飼料添加劑的蝦青素促進(jìn)觀賞魚(yú)類的著色[5]等。

現(xiàn)在蝦青素的生產(chǎn)方法主要包括化學(xué)合成、天然提取以及生物合成。其中化學(xué)合成的蝦青素由于穩(wěn)定性、抗氧化活性以及安全性不如天然提取的蝦青素，所以應(yīng)用較少[6]。目前天然蝦青素來(lái)源主要是藻類和酵母，藻類有單細(xì)胞綠藻雨生紅球藻，酵母有法夫酵母。法夫酵母產(chǎn)蝦青素的相關(guān)研究包括菌種改良[7-9]，培養(yǎng)基優(yōu)化[7-9]以及蝦青素合成代謝調(diào)控[10-12]。Meyer 等[13]發(fā)現(xiàn)蝦青素的合成是生長(zhǎng)關(guān)聯(lián)型，平衡期時(shí)菌體濃度迅速下降，而細(xì)胞內(nèi)蝦青素含量上升。Liu 等[14]研究發(fā)現(xiàn)在酵母培養(yǎng)前期加入適量的H2O2，蝦青素的細(xì)胞產(chǎn)率和體積產(chǎn)率分別提高83%和65%。

研究表明蝦青素的合成與法夫酵母的代謝途徑的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)調(diào)控有關(guān)。Gu 等[15]發(fā)現(xiàn)添加0.2%的乙醇能有效提高蝦青素的產(chǎn)量，可能是由于提高了蝦青素合成過(guò)程的關(guān)鍵途徑——甲羥戊酸合成途徑中HMG-CoA 還原酶的活性。肖安風(fēng)等[16]發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)基中添加低濃度的乙酸鈉、乳酸鈉和檸檬酸（糖代謝產(chǎn)物），均能增強(qiáng)法夫酵母產(chǎn)蝦青素的能力。本實(shí)驗(yàn)室前期研究了葡萄糖濃度、添加乙醇及溶氧狀況對(duì)法夫酵母細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝副產(chǎn)物產(chǎn)生的影響及其與蝦青素合成之間的關(guān)系，并據(jù)此闡釋法夫酵母蝦青素合成的機(jī)理[12]。在此基礎(chǔ)上通過(guò)代謝通量分析方法，闡述乙醇促進(jìn)蝦青素的合成機(jī)理，然后利用代謝調(diào)控劑對(duì)法夫酵母蝦青素合成的代謝調(diào)控節(jié)點(diǎn)進(jìn)行發(fā)酵調(diào)控，從而達(dá)到促進(jìn)法夫酵母合成蝦青素的目的。

1 材料和方法

1.1 菌株

法夫酵母（Phaffia rhodozyma）JMU-MVP14 菌株：由出發(fā)菌株JMU-668 經(jīng)甲基磺酸乙酯誘變，再用0.5%的雙氧水結(jié)合紫外照射，產(chǎn)生自由基，從而淘汰低產(chǎn)菌株，最后選育得到菌株JMUMVP14[12]。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：4°Bx 麥汁，pH 6.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基（/L）：葡萄糖0.5 g，（NH4）2SO45 g，MgSO40.5 g，KH2PO42 g 采 用121 ℃滅 菌15 min；微量成分ZnSO4·7H2O 12 mg，CaCl210 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 8 mg，H3BO32.67 mg，MnCl22.67 mg，Na2MoO4·2H2O 1.07 mg，CuSO4·5H2O 0.8 mg，Co-Cl20.8 mg，KI 0.27 mg，肌醇66.67 mg，泛酸鈣2.67 mg，煙酸2.67 mg，VB62.67 mg，VB12.67 mg，對(duì)氨基苯甲酸0.53 mg，生物素0.13 mg，pH 6.0 mg，采用過(guò)濾除菌的方法。

1.3 法夫酵母發(fā)酵

取-70 ℃甘油管保存的菌種，在裝有4°麥汁培養(yǎng)基的斜面上劃線，22 ℃恒溫培養(yǎng)5 d。挑取斜面上的單菌落，接入250 mL 的搖瓶中，培養(yǎng)2～3 d，為1 代種子。轉(zhuǎn)接1 代種子到新配制的種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)2～3 d，將培養(yǎng)好的2 代種子按5%接種量接入裝有30 mL 發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL 搖瓶中，22 ℃，180 r/min 發(fā)酵5 d。

1.4 生物量的測(cè)定

干重法：將空的離心管于105 ℃干燥箱烘至恒重，稱重為M；取一定體積的發(fā)酵液（V）于恒重后的離心管中，離心兩次后得到菌體，于105 ℃干燥箱中烘干至恒重，稱重為N，得到菌體干重為（N- M）/V[17]。

1.5 總類胡蘿卜素含量測(cè)定

采用二甲基亞砜（DMSO）法破壁[18-19]。取5 mL發(fā)酵液，離心兩次后得到菌體。將菌體55 ℃下預(yù)熱5 min，加入2 mL 已預(yù)熱至75 ℃的二甲基亞砜，充分振蕩后加入5 mL 乙醇提取色素，離心后得到色素提取液，用乙醇定容10 mL。

采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)[20]。配制不同濃度梯度的蝦青素標(biāo)準(zhǔn)品，在波長(zhǎng)474 nm 處檢測(cè)，繪制出蝦青素標(biāo)準(zhǔn)曲線。在相同條件下測(cè)定發(fā)酵樣品，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品中蝦青素含量。

1.6 類胡蘿卜素成分的測(cè)定

使用Aglient 1200 高效液相色譜儀（G1315 DAD 檢測(cè)器）檢測(cè)，Nova-Pak C18 柱（3.9 mm×150 mm，4 μm），液相分析時(shí)控制流速1 mL/min，柱溫30 ℃，柱壓0～20 MPa，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長(zhǎng)474 nm[21]。

1.7 發(fā)酵液殘?zhí)堑臋z測(cè)

采用3，5-二硝基水楊酸法（DNS）[22]測(cè)定殘?zhí)菨舛?。? mL 發(fā)酵上清液稀釋至適宜濃度，加入0.6 mL DNS，沸水浴10 min 后立即冷卻，用蒸餾水定容5 mL，使用紫外分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為520 nm 處測(cè)定糖濃度。

1.8 發(fā)酵液乙醇含量的檢測(cè)

氣相色譜法測(cè)定發(fā)酵液中的乙醇[17]。

1.9 代謝通量分析

圖1 法夫酵母代謝網(wǎng)絡(luò)Fig.1 The metabolic reaction network of Phaffiarhodozyma

根據(jù)文獻(xiàn)[23]～[25]建立法夫酵母生物合成蝦青素的簡(jiǎn)化代謝網(wǎng)絡(luò)（圖1）。該代謝網(wǎng)絡(luò)主要是由糖酵解途徑（EMP）、磷酸戊糖途徑（HMP）、三磷酸循環(huán)（TCA）和代謝物積累等4 個(gè)部分組成。代謝流平衡模型的建立和代謝通量分布計(jì)算見(jiàn)文獻(xiàn)[23]～[25]。

2 結(jié)果與討論

2.1 代謝通量分析乙醇促進(jìn)蝦青素合成的機(jī)理

有研究表明法夫酵母由中心途徑經(jīng)異戊二烯合成蝦青素的代謝途徑[26]，然而，對(duì)蝦青素的合成機(jī)理及代謝調(diào)控機(jī)制研究不夠深入。法夫酵母具有復(fù)雜的代謝網(wǎng)絡(luò)，其合成蝦青素由多個(gè)代謝網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)所調(diào)控，每個(gè)節(jié)點(diǎn)的有益改造只能使蝦青素的產(chǎn)量得到少量提高。蝦青素產(chǎn)量的不斷提高，實(shí)際是各代謝調(diào)控節(jié)點(diǎn)有益改造并不斷累積的過(guò)程。要使法夫酵母的蝦青素產(chǎn)量不斷提高，就必須深入了解法夫酵母合成蝦青素的代謝調(diào)控機(jī)理，這是對(duì)法夫酵母的代謝流進(jìn)行理性改造，提高蝦青素發(fā)酵產(chǎn)量的關(guān)鍵。

由于法夫酵母JMU-MVP14 細(xì)胞代謝不產(chǎn)生乙醇，因此配制葡萄糖質(zhì)量濃度為20 g/L 的代謝通量分析培養(yǎng)基。在接種前，額外添加2 g/L 的乙醇作為試驗(yàn)組，以不加乙醇的培養(yǎng)條件作為對(duì)照組進(jìn)行代謝通量分析，考察乙醇對(duì)整個(gè)法夫酵母JMU-MVP14 代謝網(wǎng)絡(luò)的擾動(dòng)規(guī)律。根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)特性，分別在發(fā)酵對(duì)數(shù)期與穩(wěn)定期取樣，測(cè)定發(fā)酵參數(shù)后代入代謝通量的模型中進(jìn)行計(jì)算。法夫酵母JMU-MVP14 的發(fā)酵曲線如圖2所示。

圖2 法夫酵母JMU-MVP14 的發(fā)酵曲線Fig.2 Fermentation curve of Phaffiarhodozyma JMU-MVP14

從圖2可以看出，在代謝通量分析培養(yǎng)基中額外添加乙醇，能顯著提高法夫酵母JMU-MVP14菌株合成色素的能力。從生物量的變化曲線可知，法夫酵母JMU-MVP14 菌株在代謝通量培養(yǎng)基中生長(zhǎng)快速，生物量發(fā)酵至72 h 時(shí)達(dá)到最大值。以這一時(shí)間點(diǎn)為分割，之前是細(xì)胞生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，之后是生長(zhǎng)穩(wěn)定期。當(dāng)法夫酵母處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，能快速利用葡萄糖來(lái)合成新的細(xì)胞，而類胡蘿卜素的合成較為緩慢。進(jìn)入穩(wěn)定期后，菌體量基本不增加，而胞內(nèi)色素的合成卻持續(xù)進(jìn)行。從總類胡蘿卜素的產(chǎn)量曲線可以看出，乙醇對(duì)蝦青素產(chǎn)量的促進(jìn)作用在生長(zhǎng)穩(wěn)定期較為顯著。發(fā)酵至72 h，生物量達(dá)到最大值，而類胡蘿卜素還在以對(duì)數(shù)的趨勢(shì)積累。在此階段進(jìn)行代謝調(diào)控，將更有可能提高蝦青素的產(chǎn)量。取72～75 h 時(shí)間段的樣品進(jìn)行代謝通量分析，得到圖3。圖中斜杠右邊數(shù)據(jù)為代謝添加乙醇培養(yǎng)的試驗(yàn)組，斜杠左邊數(shù)據(jù)為不添加乙醇培養(yǎng)的對(duì)照組。

圖3 法夫酵母JMU-MVP14 菌株代謝通量分布圖（72～75 h）Table 3 Metabolic flux distribution of Phaffiarhodozyma JMU-MVP14 in the period of 72～75 h

法夫酵母JMU-MVP14 菌株在生長(zhǎng)的不同時(shí)期，各途徑的代謝通量存在較大差異。由圖1可知，r2和r3為進(jìn)入磷酸戊糖途徑的通量，主要產(chǎn)生5-磷酸核酮糖和NADPH，參與核酸的代謝并為細(xì)胞內(nèi)大分子物質(zhì)的合成提供還原力；r4為進(jìn)入糖酵解途徑的通量，主要產(chǎn)生丙酮酸及一些中間產(chǎn)物，參與其它途徑的代謝；r9則可用來(lái)表示進(jìn)入三羧酸循環(huán)的通量，能產(chǎn)生大量ATP 供細(xì)胞生長(zhǎng)所利用，其中間產(chǎn)物α-酮戊二酸還可參與氨基酸的代謝；r8為乙酰輔酶A 的通量，可作為三羧酸循環(huán)和蝦青素合成途徑的前體物；r12為從乙酰輔酶A合成蝦青素的通量。

Gu 等[15]研究發(fā)現(xiàn)，將乙醇添加到培養(yǎng)基中，能提高法夫酵母乙醇脫氫酶的活性。在乙醇脫氫酶的作用下，乙醇被氧化成乙醛，乙醛進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成乙酰輔酶A 進(jìn)入代謝網(wǎng)絡(luò)中被法夫酵母所利用。從法夫酵母JMU-MVP14 菌株代謝通量分布圖（72～75 h）對(duì)比圖3可知，添加乙醇后法夫酵母JMU-MVP14 菌株代謝網(wǎng)絡(luò)中流向蝦青素合成途徑的通量增加，是對(duì)照組通量的2.3 倍。而最終測(cè)定的蝦青素產(chǎn)量比對(duì)照組提高了21%。添加乙醇后除了增大丙酮酸、乙酰輔酶A 代謝節(jié)點(diǎn)處的通量外，還增大了α-酮戊二酸處的通量，使法夫酵母JMU-MVP14 菌株將更多的碳源流向TCA 循環(huán)而獲得大量ATP，同時(shí)α-酮戊二酸還可參與氨基酸的代謝合成蛋白質(zhì)。

2.2 α-酮戊二酸代謝節(jié)點(diǎn)的調(diào)控

細(xì)胞代謝過(guò)程中對(duì)α-酮戊二酸的利用通常有兩個(gè)方面：一是合成琥珀酰-CoA，參與TCA 循環(huán)；二是合成谷氨酸、脯氨酸、精氨酸等，參與蛋白質(zhì)的代謝。而細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成對(duì)蝦青素的積累有顯著的影響[27]。由上述試驗(yàn)可知，添加乙醇可以提高乙酰輔酶A 的代謝通量，同時(shí)使α-酮戊二酸增加，進(jìn)而提高蝦青素產(chǎn)量。結(jié)合代謝通量分析與關(guān)鍵代謝途徑的通量對(duì)比，推測(cè)α-酮戊二酸影響蝦青素的合成。為了驗(yàn)證推測(cè)，配制不同濃度的α-酮戊二酸，添加到法夫酵母的培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，研究α-酮戊二酸對(duì)蝦青素合成的影響。

培養(yǎng)環(huán)境中添加0.5 g/L 的α-酮戊二酸，有利于法夫酵母JMU-MVP14 細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)總類胡蘿卜素的合成，如圖4所示。然而，添加1 g/L 及以上質(zhì)量濃度時(shí)對(duì)類胡蘿卜素的合成不利。

通過(guò)高效液相分析法夫酵母JMU-MVP14 菌株的類胡蘿卜素成分和含量，從表1可知，細(xì)胞內(nèi)的主要色素是蝦青素，占總色素的83%左右。除此之外，還有β-隱黃質(zhì)和β-胡蘿卜素生成。當(dāng)培養(yǎng)液中添加α-酮戊二酸后明顯提高了細(xì)胞內(nèi)β-隱黃質(zhì)的含量，由8.8%提至18%～28%，而蝦青素與β-胡蘿卜素的比例有所下降，這可能是由于α-酮戊二酸影響蝦青素合成酶的活性，導(dǎo)致蝦青素在總色素中的比例下降。

圖4 不同α-酮戊二酸添加量對(duì)JMU-MVP14 發(fā)酵的影響Fig.4 The effect of α-ketoglutaric on fermentation of Phaffiarhodozyma JMU-MVP14

表1 α-酮戊二酸對(duì)法夫酵母JMU- MVP14 胞內(nèi)類胡蘿卜素比值的影響Table 1 The effect of α-ketoglutaric on endocellular carotenoid proportion of Phaffiarhodozyma JMU-MVP14

2.3 5-磷酸核酮糖代謝節(jié)點(diǎn)的調(diào)控

根據(jù)代謝通量分析，增強(qiáng)5-磷酸核酮糖代謝節(jié)點(diǎn)處的通量，即增強(qiáng)代謝網(wǎng)絡(luò)中HMP 途徑的碳流量，可能會(huì)提高蝦青素的產(chǎn)量。在乙醇添加試驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)HMP 途徑的通量值r2減小而TCA 循環(huán)的通量值r9增大，這與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道有所出入[25]，其原因可能是乙醇會(huì)抑制6-磷酸葡萄糖脫氫（G6PDH）酶的活性。G6PDH 是HMP 途徑的限速酶，若提高此酶的活性，則能有效提高HMP 途徑的通量。Lan 等[28]研究表明，適宜濃度的谷氨酸能提高G6PDH 的活性。在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加不同濃度的谷氨酸進(jìn)行法夫酵母搖瓶發(fā)酵。

谷氨酸對(duì)法夫酵母JMU-MVP14 生產(chǎn)蝦青素的促進(jìn)效果更為顯著。從圖5可知，添加0.5～3 g/L的谷氨酸能促進(jìn)蝦青素的合成，且隨著谷氨酸濃度的增大，得到的菌體量和色素產(chǎn)量越高。以3 g/L 谷氨酸添加量培養(yǎng)JMU-MVP14，最終收獲6.93 g/L 的菌體量，相應(yīng)總類胡蘿卜素的產(chǎn)量為67.88 mg/L，是對(duì)照組的1.7 倍。這是由于法夫酵母合成1 個(gè)蝦青素分子就需要消耗24 個(gè)NADPH，而胞內(nèi)大量NADPH 的來(lái)源是HMP 途徑。谷氨酸促進(jìn)HMP 途徑的通量后，將提供給蝦青素合成更多的NADPH 及能量。

JMU-MVP14 菌株在生產(chǎn)蝦青素的同時(shí)，還會(huì)合成β-胡蘿卜素、β-隱黃質(zhì)。如表2所示，通常情況下，JMU-MVP14 細(xì)胞內(nèi)蝦青素占總類胡蘿卜素的83.05%。當(dāng)其培養(yǎng)環(huán)境加入谷氨酸后，胞內(nèi)類胡蘿卜素的比例發(fā)生變化，β-隱黃質(zhì)從7.79%提至25%左右，而蝦青素和β-胡蘿卜的比例有所下降。由此可知，不同培養(yǎng)條件影響法夫酵母胞內(nèi)色素的比例。

圖5 不同谷氨酸添加量對(duì)JMU-MVP14 發(fā)酵的影響Fig.5 The effect of glutamic on fermentation of Phaffiarhodozyma JMU-MVP14

表2 谷氨酸對(duì)法夫酵母JMU-MVP14 胞內(nèi)類胡蘿卜素比值的影響Table 2 The effect of glutamic on endocellular carotenoid proportion of Phaffia rhodozyma JMU-MVP14

3 結(jié)論

利用代謝通量分析的方法，闡釋法夫酵母JMU-MVP14 生物合成蝦青素的調(diào)控機(jī)理并對(duì)代謝流進(jìn)行發(fā)酵調(diào)控。蝦青素合成試驗(yàn)結(jié)果表明：添加2 g/L 乙醇，能促進(jìn)丙酮酸、乙酰輔酶A 代謝節(jié)點(diǎn)的通量，從而增強(qiáng)流向蝦青素的代謝通量，蝦青素產(chǎn)量達(dá)到49.93 mg/L，與對(duì)照組相比提高了21%。根據(jù)代謝通量分析結(jié)果，發(fā)現(xiàn)添加乙醇使TCA 循環(huán)處的代謝通量值r9增大，使流向乙酰輔酶A 合成蝦青素的通量變少。另外，添加α-酮戊二酸會(huì)抑制法夫酵母合成蝦青素，當(dāng)添加濃度較高時(shí)出現(xiàn)強(qiáng)烈的抑制作用。添加α-酮戊二酸后顯著促進(jìn)法夫酵母JMU-MVP14 菌株細(xì)胞內(nèi)β-隱黃質(zhì)的合成量，比空白對(duì)照組提高18%～28%。谷氨酸作為HMP 途徑限速酶（G6PDH）的促進(jìn)劑，添加后，法夫酵母JMU-MVP14 的總類胡蘿卜素產(chǎn)量高達(dá)67.88 mg/L，是對(duì)照組的1.7 倍。