韋榮干 葉秋容 周敏燕 黎 莉 黃佳珍 韋黎黎 莫祥蘭 黃謨婉

(廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院1 病理科，2 呼吸內(nèi)科，南寧市 530021，電子郵箱：weironggan@163.com)

細(xì)胞學(xué)檢查是診斷肺癌的主要方法之一，但肺癌的細(xì)胞學(xué)分型與組織學(xué)分型結(jié)果不盡一致，臨床實(shí)踐中可因活檢取材不滿意(如取材不到位、壞死組織多、腫瘤細(xì)胞少、組織擠壓變形等)，造成診斷困難或不能分類，進(jìn)而延誤治療[1]。細(xì)胞學(xué)如能準(zhǔn)確地診斷和分型既可以彌補(bǔ)活檢的不足，又避免了再次取材的麻煩，也給一些晚期不適合手術(shù)的肺癌患者提供治療的依據(jù)。良好的細(xì)胞涂片是細(xì)胞學(xué)檢查的根本，其對(duì)診斷的準(zhǔn)確性和及時(shí)性至關(guān)重要。傳統(tǒng)細(xì)胞涂片由于受到涂片厚薄不一，血液、黏液、炎癥細(xì)胞干擾，涂片固定不及時(shí)等諸多因素的影響，較難對(duì)肺癌進(jìn)行診斷分型[2]。隨著液基細(xì)胞學(xué)的引入，細(xì)胞學(xué)的診斷水平有了較大的提高[3]，有文獻(xiàn)報(bào)道，應(yīng)用液基細(xì)胞制片進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)染色(immunocytochemistry,ICC)輔助細(xì)胞學(xué)診斷肺癌的效果良好，但商品化的液基耗材成本較高，限制了其在細(xì)胞學(xué)診斷上的應(yīng)用。本文采用自配液基保存液(以下簡(jiǎn)稱“保存液”)保存纖維支氣管鏡(以下簡(jiǎn)稱“纖支鏡”)刷檢和沖洗液的細(xì)胞學(xué)標(biāo)本，液基制片后行ICC輔助細(xì)胞學(xué)診斷，并探討該技術(shù)在肺癌細(xì)胞分型中的應(yīng)用效果，以尋找一種經(jīng)濟(jì)實(shí)用、簡(jiǎn)單方便、效果理想、適合普及推廣的液基制片方法，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 資料 收集2013年6月至2014年7月我院纖支鏡室送檢的74份刷檢和沖洗液標(biāo)本，細(xì)胞學(xué)診斷均為肺癌，其中包含62例非小細(xì)胞癌和12例未能鑒別為低分化鱗癌、低分化腺癌或小細(xì)胞癌的肺癌標(biāo)本，其中60例得到明確的組織學(xué)肺癌分型結(jié)果(10例鱗癌、47例腺癌和3例小細(xì)胞癌)?；颊吣挲g31～89歲，中位年齡58歲；男46例，女28例。所有患者在纖支鏡檢查前均未進(jìn)行放療和化療，細(xì)胞學(xué)診斷和組織學(xué)診斷由不同的醫(yī)師獨(dú)立完成。

1.2 主要試劑和設(shè)備 非小細(xì)胞癌采用抗體p63(p63基因)(批號(hào)：130506365E,140513365E)、細(xì)胞角蛋白(cytokeratin，CK)5/6(批號(hào)：130518276C,140420276C)、CK7(批號(hào)：130513166C,140402166C)和甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1(thyroid transcription factor 1，TTF-1)(批號(hào)：130217599C,140505599C)進(jìn)行鱗癌和腺癌的鑒別診斷，低分化鱗癌、低分化腺癌和小細(xì)胞癌采用抗體p63、CK5/6、CK7、TTF-1、突觸素(synaptophysin,Syn)(批號(hào)：130418171B,140410171B)和神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(neural cell adhesion molecule,NCAM)56(又稱CD56)(批號(hào)：130525256C,140417256C)進(jìn)行鑒別診斷。以上抗體和本研究所用的免疫組化試劑盒(批號(hào)：1305069903,1404289903)均購(gòu)自福州邁新公司。保存液的成分包含磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉和乙醇，將三者混溶后室溫保存?zhèn)溆?。離心制片機(jī)(型號(hào)：BDY-YJ)由武漢博達(dá)康激光電子設(shè)備有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 液基細(xì)胞制片：纖支鏡刷檢和沖洗液標(biāo)本離體后均立即置于25 mL保存液中保存并送檢。標(biāo)本以1 500 r/min離心10 min，棄上清液，按沉淀量加入適量的10%二硫代蘇糖醇(按10 ∶1比例)，充分搖勻至黏液完全溶解，加入30 mL保存液后震蕩3 min以清洗標(biāo)本，1 500 r/min離心10 min，棄上清液并用保存液重懸標(biāo)本沉淀制成濃度約20%的懸液，用離心制片法制成細(xì)胞涂片1張，剩余懸液保存于4℃冰箱。細(xì)胞涂片濕固定于95%乙醇15 min后進(jìn)行巴氏染色，行細(xì)胞學(xué)診斷。對(duì)不能確定類型的含癌細(xì)胞標(biāo)本，用離心制片法制作細(xì)胞涂片，涂片晾干后置于4℃丙酮中固定1 h，取出晾干后放入-20℃冰箱保存，用于ICC進(jìn)行肺癌分型，ICC的具體操作步驟參照試劑說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.2 ICC分組：將細(xì)胞學(xué)診斷為非小細(xì)胞癌的但有明確組織學(xué)診斷的53例患者標(biāo)本歸為Ⅰ組,分別標(biāo)記抗體p63、CK5/6、CK7和TTF-1。將7例未能鑒別為低分化鱗癌、低分化腺癌或小細(xì)胞癌的分化較差但有明確組織學(xué)診斷的癌細(xì)胞標(biāo)本歸入Ⅱ組，分別標(biāo)記抗體p63、CK5/6、CK7、TTF-1、Syn和CD56。

1.3.3 ICC陽(yáng)性判斷：抗體在癌細(xì)胞著色部位：CK7、CK5/6著色于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜，Syn著色于細(xì)胞質(zhì)，CD56著色于細(xì)胞膜，TTF-1和p63著色于細(xì)胞核。按著色強(qiáng)度判斷，未著色0分，淺黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分。按著色細(xì)胞數(shù)量判斷，癌細(xì)胞著色細(xì)胞數(shù)0%～5%為0分，著色細(xì)胞數(shù)6%～10%為1分，著色細(xì)胞數(shù)11%～25%為2分，著色細(xì)胞數(shù)>25%為3分。染色強(qiáng)度與陽(yáng)性細(xì)胞百分比的乘積，0分為陰性(-)，1～3分為弱陽(yáng)性(+)，4～6分為中度陽(yáng)性(++)，7～9分為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)(百分比)表示，組間比較采用卡方檢驗(yàn)或Fisher確切概率法，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。細(xì)胞學(xué)診斷與組織學(xué)診斷結(jié)果的一致性分析采用Kappa值檢驗(yàn)，以Kappa值<0.4為一致性較差，0.4≤Kappa值≤0.7為一致性中等，Kappa值>0.7為一致性高。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞學(xué)+ICC檢查與組織學(xué)對(duì)肺癌分型的一致性 以組織學(xué)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，60例經(jīng)組織學(xué)檢查已明確肺癌分型的標(biāo)本中(10例鱗癌、47例腺癌和3例小細(xì)胞癌，其中Ⅰ組鱗癌8例、腺癌45例，Ⅱ組鱗癌2例、腺癌2例、小細(xì)胞癌3例)，細(xì)胞學(xué)+ICC分型結(jié)果如下：Ⅰ組診斷鱗癌8例、腺癌40例，5例因所選抗體全陰性未能進(jìn)一步分類；Ⅱ組診斷鱗癌3例、腺癌2例、小細(xì)胞癌2例。Kappa一致性檢驗(yàn)結(jié)果顯示Kappa值=0.762，說(shuō)明用保存液保存纖支鏡刷檢和沖洗液標(biāo)本，可較好保存細(xì)胞抗原，使細(xì)胞學(xué)聯(lián)合相關(guān)抗體對(duì)肺癌分型的結(jié)果與組織學(xué)分型的一致性較高。細(xì)胞學(xué)+ICC肺癌分型與組織學(xué)分型的比較見表1。

表1 細(xì)胞學(xué)+ICC分型結(jié)果與組織學(xué)的比較(n)

2.2 不同免疫細(xì)胞標(biāo)志物在肺癌分型中的應(yīng)用價(jià)值 以組織學(xué)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，60例經(jīng)組織學(xué)檢查已明確肺癌分型的標(biāo)本(10例鱗癌、47例腺癌和3例小細(xì)胞癌)中，經(jīng)ICC檢測(cè)p63、CK5/6對(duì)鱗癌的敏感度分別為80.0%和100.0%，CK7、TTF-1對(duì)腺癌的敏感度分別為85.1%和63.8%。在ICCⅡ組中，組織學(xué)診斷為小細(xì)胞癌的3例患者，ICC檢測(cè)中Syn和CD56陽(yáng)性各2例，敏感度均為66.7%。各抗體與組織學(xué)對(duì)肺癌分型結(jié)果見表2～表5，各抗體對(duì)肺癌分型的結(jié)果見圖1。

圖1 各抗體對(duì)肺癌分型的結(jié)果

注：① CK5/6對(duì)肺鱗癌的分型[(+++),EnVision法,×400]；② p63對(duì)肺鱗癌的分型[(+++),EnVision法,×400]；③ CK7對(duì)肺腺癌的分型[(+++),EnVision法,×400]；④ TTF-1對(duì)肺腺癌的分型[(+++),EnVision法,×400]；⑤ Syn對(duì)肺小細(xì)胞癌的分型[(+++),EnVision法,×400]；⑥ CD56對(duì)肺小細(xì)胞癌的分型[(+++),EnVision法,×400]。

表2 p63的ICC檢測(cè)與組織學(xué)診斷肺鱗癌的結(jié)果比較(n)

表3 CK5/6的ICC檢測(cè)與組織學(xué)診斷肺鱗癌的結(jié)果比較(n)

表4 CK7的ICC檢測(cè)與組織學(xué)診斷肺腺癌的結(jié)果比較(n)

表5 TTF-1的ICC檢測(cè)與組織學(xué)診斷肺腺癌的結(jié)果比較(n)

3 討 論

細(xì)胞涂片巴氏染色對(duì)部分非角化型鱗癌與腺癌的鑒別，以及對(duì)低分化癌或分化較差的癌細(xì)胞的分型比較困難，加上傳統(tǒng)細(xì)胞涂片存在厚薄不均、細(xì)胞不集中、ICC染色時(shí)細(xì)胞易脫落等問(wèn)題，均不利于ICC在細(xì)胞學(xué)診斷上的應(yīng)用，導(dǎo)致細(xì)胞學(xué)診斷時(shí)難以對(duì)疾病類型進(jìn)行分型[4]。液基細(xì)胞涂片克服了傳統(tǒng)涂片的上述弊病，同時(shí)剩余標(biāo)本可以置于保存液中備用，有利于后續(xù)用于細(xì)胞學(xué)的其他檢測(cè)。本研究應(yīng)用自配液基保存液制作細(xì)胞涂片，在整個(gè)ICC過(guò)程中沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞脫落現(xiàn)象，陽(yáng)性著色定位準(zhǔn)確，無(wú)非特異性著色。

肺癌的靶向治療要求病理診斷做到分型明確，免疫組化在肺癌分型中扮演著重要的角色[5]。研究顯示，p63、CK5/6對(duì)肺鱗癌有較高的敏感性和特異性，而CK7、TTF-1則對(duì)肺腺癌有較高的敏感性和特異性[6-7]，CK7、TTF-1可以聯(lián)合其他抗體鑒別肺腺癌的原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性[8]。Syn、CD56是神經(jīng)內(nèi)分泌癌免疫組化常用的標(biāo)記物，文獻(xiàn)報(bào)道，Syn、CD56對(duì)纖支鏡活檢標(biāo)本小細(xì)胞癌的陽(yáng)性率分別為48.4%和100%[9]。本研究選用p63、CK5/6、CK7、TTF-1對(duì)細(xì)胞學(xué)診斷為非小細(xì)胞癌的標(biāo)本進(jìn)行肺癌分型，選用Syn和CD56對(duì)小細(xì)胞癌進(jìn)行鑒別，結(jié)果顯示，p63、CK5/6對(duì)鱗癌的敏感度，CK7、TTF-1對(duì)腺癌的敏感度均較高，Syn和CD56對(duì)3例小細(xì)胞癌也顯示出良好的敏感性，與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似[10-11]。同時(shí)本研究中ICC對(duì)肺癌的分型結(jié)果與組織學(xué)分型的一致性較高(Kappa值=0.761 6)。提示保存液保存纖支鏡刷檢和沖洗液標(biāo)本，對(duì)細(xì)胞抗原的保存較好，可用于ICC檢測(cè)，結(jié)合相關(guān)抗體的表達(dá)，可提高細(xì)胞學(xué)診斷肺癌的水平。

本研究結(jié)果還顯示，p63、CK7和TTF-1的敏感性較組織學(xué)偏低，可能與下列因素有關(guān)：(1)纖支鏡細(xì)胞學(xué)取材時(shí)得到的腫瘤細(xì)胞數(shù)量較少；(2)脫落的腫瘤細(xì)胞其抗原的丟失程度可能較活檢組織多；(3)細(xì)胞涂片ICC核抗體需穿透細(xì)胞膜才能和核抗原相結(jié)合，而組織切片核抗體可直接與核抗原結(jié)合。

綜上所述，ICC可以為肺癌分型提供更多的客觀依據(jù)，良好的細(xì)胞保存和固定既是ICC質(zhì)量保證的先決條件，又是做出正確診斷的基礎(chǔ)。自配液基保存液保存纖支鏡刷檢和沖洗液細(xì)胞標(biāo)本后行液基制片再進(jìn)行ICC檢測(cè)，其對(duì)肺癌的分型結(jié)果與組織病理學(xué)診斷的一致性較高。與成本較高的商品化液基耗材相比，自配液基保存液費(fèi)用低，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定，且操作簡(jiǎn)便，可進(jìn)行普及和推廣，但其對(duì)細(xì)胞抗原保存的效果是否優(yōu)于商品化液基保存液，還有待研究。