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鏈霉蛋白酶消化時長對氣液相培養(yǎng)原代小鼠氣道上皮細(xì)胞的影響

2019-07-10 08:17高璇徐菲許先榮
浙江醫(yī)學(xué) 2019年13期
關(guān)鍵詞:原代蛋白酶孵育

高璇 徐菲 許先榮

氣道上皮是呼吸系統(tǒng)的一部分,與外界環(huán)境直接接觸,是機(jī)體與外界環(huán)境的屏障,能保護(hù)機(jī)體免受各種吸入性損害,如化學(xué)因子、污染性微粒、病原體等[1]。體外培養(yǎng)原代小鼠氣道上皮細(xì)胞(mouse tracheal epithelium cell,MTEC)建立體外模型,在呼吸系統(tǒng)疾病研究中具有重要意義。相關(guān)實驗證明,氣液相(ALI)方法能培養(yǎng)出正?;?、高質(zhì)量、具有黏膜纖毛分化能力的不同物種的原代氣道上皮細(xì)胞,包括MTEC[1-2]。培養(yǎng)MTEC對氣道上皮細(xì)胞生長、分化過程的觀察,以氣道上皮細(xì)胞為基礎(chǔ)的研究等具有重要意義。因此,建立高效、可靠的MTEC培養(yǎng)方法十分重要[3]。目前比較成熟的方法是利用消化酶鏈霉蛋白酶將氣道上皮細(xì)胞從小鼠氣管內(nèi)皮消化分離,并在富含特殊生長因子(如胰島素、表皮生長因子等)的培養(yǎng)基中增殖,最終在ALI分化成為MTEC[4-7]。消化酶消化時長會影響目標(biāo)細(xì)胞的產(chǎn)量、細(xì)胞活力、雜質(zhì)細(xì)胞數(shù)量等,因此選擇合適的消化時長很有必要。本文將介紹一種培養(yǎng)原代MTEC的方法,并通過一系列實驗確定合適的消化酶消化時長,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 周齡5~8周的無特定病原體(SPF)級雄性小鼠32只,購自上海斯萊克實驗動物公司。所有小鼠在SPF級條件下養(yǎng)育,所有實驗步驟遵守中國動物研究委員會關(guān)于實驗動物的倫理規(guī)定。

1.2 培養(yǎng)基 (1)采集培養(yǎng)基:含有左旋谷酰胺(LGlutamine,E15-817,美國 PAA公司)的 Ham’s F-12培養(yǎng)基,添加青霉素 100IU/ml、鏈霉素 100IU/ml。(2)消化培養(yǎng)基:采集培養(yǎng)基加入10U/ml鏈霉蛋白酶(P5147,美國 Sigma-Aldrich 公司)、0.01mol/L CaCl2、0.5mg/ml粗胰腺DNA酶Ⅰ(DN25,美國Sigma-Aldrich公司)、10mg/ml牛血清白蛋白(中國BIOSHARP公司)。(3)孵育培養(yǎng)基:含有左旋谷氨酰胺的 DMEM/Ham’s F-12(1∶1)培養(yǎng)基,添加青霉素 100IU/ml、鏈霉素 100IU/ml、10%FBS(美國PAA公司)。(4)基礎(chǔ)培養(yǎng)基:由BEBM基礎(chǔ)培養(yǎng)基(LONZA,Switzerland)與高糖左旋谷酰胺DMEM按1∶1比例配置,并添加青霉素100IU/ml、鏈霉素100IU/ml、5%FBS,每500ml混合培養(yǎng)基中加入一份SingleQuotsTMKit(瑞士LONZA公司)。(5)分化培養(yǎng)基:不添加FBS的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。

1.3 包被半滲透基底膜 將Ⅳ型人胎盤膠原(美國Sigma-Aldrich公司)溶于蒸餾水制備的0.2%冰乙酸溶液中,配制成膠原濃度1mg/ml的混合液;再以蒸餾水稀釋至50μg/ml?;诪榘霛B透膜的細(xì)胞培養(yǎng)嵌入小室(24孔板,孔徑0.4μm,透明PET膜,美國BD公司)置入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,每個小室加入100μl膠原混合液進(jìn)行包被。將細(xì)胞培養(yǎng)板放入孵育箱中過夜,棄去殘余液體,紫外線照射至少30min滅菌,使用前用無菌PBS溶液沖洗3次。

1.4 分離原代MTEC 將小鼠分成4組,均予過量戊巴比妥鈉處死,浸泡在75%乙醇溶液中10min,置于無菌操作臺上。在無菌條件下,剪開小鼠胸部皮膚,充分暴露頸部。輕柔地去除周圍組織,將氣管分離完全。分別在主氣管至支氣管分叉處、甲狀軟骨上端剪斷氣管,取得氣管。將氣管置于冷的無菌采集培養(yǎng)基中[3,8-9]。再將氣管轉(zhuǎn)移至冷的無菌PBS溶液中,仔細(xì)去除氣管上附著的其他組織,置于新的、冷的無菌采集培養(yǎng)基中。將氣管縱向剪開,轉(zhuǎn)移至含有新鮮配置的消化培養(yǎng)基的試管中(6~10支試管/2ml培養(yǎng)基)。輕柔地上下顛倒試管數(shù)次,確保氣管中的氣體被完全排出。將試管保持豎直,置于4℃條件下進(jìn)行消化;根據(jù)分組不同,分別消化 6、12、18、24h。

1.5 采集MTEC 將試管輕柔地上下顛倒10次,使氣管分散;加入占總體積10%的FBS后,再次輕柔地上下顛倒15次,以分散氣道上皮細(xì)胞。將混合液收集至一支新的試管中,再向裝有氣管的試管中加入8ml含10%FBS的采集培養(yǎng)基,再次輕柔地顛倒試管20~30次,以獲得更多氣道上皮細(xì)胞,同時再次收集該混合液。重復(fù)上述步驟2次后,將所有混合液收集至同一個試管中,棄去氣管。將混合液在500g、4℃的條件下離心10min,小心棄去上清液,將底部細(xì)胞團(tuán)以2ml孵育培養(yǎng)基重懸。將細(xì)胞懸液移至6cm組織培養(yǎng)皿中,在37℃孵育箱中孵育2h以去除非上皮細(xì)胞。輕柔地旋轉(zhuǎn)、晃動培養(yǎng)皿數(shù)次,收集上清液至新的試管中。在500g、4℃的條件下再次離心5min,小心去除上清液,將底部細(xì)胞團(tuán)以100μl/支氣管的基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸,使用細(xì)胞計數(shù)器對4組獲得的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行計數(shù)。以上實驗步驟重復(fù)2次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測 4組小鼠獲得的細(xì)胞分別用洗滌緩沖液(美國BD公司)洗滌,7-AAD生存力染色液(美國eBioscience公司)染色5min,再使用流式細(xì)胞儀(美國BD公司)進(jìn)行細(xì)胞信號通路分析,以上實驗步驟重復(fù)2次。陽性標(biāo)記通常表示細(xì)胞處于已死亡或無存活力的狀態(tài),細(xì)胞存活率=陰性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.7 MTEC孵育 將分離的細(xì)胞配制成密度為每150μl基礎(chǔ)培養(yǎng)基1×105個細(xì)胞的細(xì)胞懸液,加入已包被好的嵌入小室中;小室外的培養(yǎng)板底部加入600μl基礎(chǔ)培養(yǎng)基。將細(xì)胞在37℃、5%CO2的孵育箱中孵育72h。小心吸棄小室內(nèi)外舊的培養(yǎng)基、未貼壁的細(xì)胞及其他殘片,更換新的培養(yǎng)基,以后每2d更換1次培養(yǎng)基。

1.8 ALI條件下誘導(dǎo)MTEC分化 第4~5天,細(xì)胞增殖且相互貼合。此時使用上皮伏歐表(EVOM2,美國WPI公司)測量Rt值,判斷細(xì)胞是否貼合。若Rt值>1000Ωcm2,表示細(xì)胞已貼合,可建立ALI培養(yǎng)環(huán)境[10]。將小室內(nèi)外舊的培養(yǎng)基吸棄,僅在小室外側(cè)加入新鮮的分化培養(yǎng)基,同時保持細(xì)胞層表面干燥。每2d更換1次新的分化培養(yǎng)基,并用溫的PBS輕柔地沖洗上層細(xì)胞層表面。在建立ALI培養(yǎng)條件的7~10d,細(xì)胞將呈現(xiàn)出鵝卵石樣外觀。

1.9 免疫組化染色 在建立ALI培養(yǎng)條件后第14天,采用免疫組化染色技術(shù)對MTEC分化情況進(jìn)行分析。利用胰蛋白酶/乙二胺四乙酸將細(xì)胞從小室基底膜上消化、分離,經(jīng)PBS洗滌后,稀釋至特定濃度,在蓋玻片上鋪板。待蓋玻片干燥后,4%多聚甲醛固定細(xì)胞,用封閉液封閉細(xì)胞上的非特異性抗體,再以抗細(xì)胞角蛋白抗體Cytokeratin 18 RabMAb(美國EPITOMICS公司)標(biāo)記細(xì)胞;孵育二抗后,先后用DAB、蘇木精染色,在顯微鏡下觀察,細(xì)胞質(zhì)棕色、細(xì)胞核紫色的細(xì)胞為陽性細(xì)胞,細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞核未被染色的細(xì)胞為陰性細(xì)胞。

1.10 氣道上皮細(xì)胞的鑒定 小鼠近端氣道上皮細(xì)胞主要由纖毛上皮細(xì)胞構(gòu)成,還包括杯狀細(xì)胞、基底細(xì)胞等,上皮下存在的主要細(xì)胞為成纖維細(xì)胞等[11]。上皮細(xì)胞能特定表達(dá)角蛋白,而成纖維細(xì)胞中不含有角蛋白,不能被抗細(xì)胞角蛋白抗體標(biāo)記[12]。通過抗細(xì)胞角蛋白抗體標(biāo)記的免疫組化對細(xì)胞進(jìn)行鑒定,陽性細(xì)胞鑒定為上皮細(xì)胞,陰性細(xì)胞為非上皮細(xì)胞[13]。將染色細(xì)胞置于顯微鏡下進(jìn)行觀察并計數(shù),隨機(jī)并獨(dú)立選取至少20個顯微鏡下視野,分別計數(shù)陽性及陰性細(xì)胞數(shù),細(xì)胞純度=陽性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 鏈霉蛋白酶消化不同時長獲得的細(xì)胞數(shù) 鏈霉蛋白酶消化 6、12、18、24h,分別獲得細(xì)胞(0.57±0.03)、(1.05±0.22)、(1.13±0.22)、(1.28±0.39)×105個,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 鏈霉蛋白酶消化不同時長細(xì)胞存活率比較 鏈霉蛋白酶消化 6、12、18、24h,細(xì)胞存活率分別為(97.65±2.26)%、(96.83±0.76)%、(93.46±2.32)%、(91.56±2.99)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);進(jìn)一步兩兩比較,6h組與12h組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但均明顯高于 18h組、24h組(均P<0.05),見圖 1。

圖1 MTEC經(jīng)鏈霉蛋白酶消化6、12、18、24h后的流式細(xì)胞圖

圖2 鏈霉蛋白酶消化6、12、18、24h細(xì)胞免疫組化染色結(jié)果(×200)

2.2 鏈霉蛋白酶消化不同時長細(xì)胞純度比較 經(jīng)抗細(xì)胞角蛋白抗體標(biāo)記后,表現(xiàn)為特殊染色的細(xì)胞,即上皮細(xì)胞,見圖 2(插頁)。鏈霉蛋白酶消化 6、12、18、24h,細(xì)胞純度分別為(69.6±22.6)%、(90.4±5.1)%、(90.3±2.7)%、(88.7±1.9)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);進(jìn)一步兩兩比較,12h組、18h組細(xì)胞純度均>90%(滿足實驗要求[14]),兩組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),但均明顯高于6h組、24h組(均P<0.05)。

3 討論

氣道上皮為假復(fù)層纖毛柱狀上皮,主要由纖毛細(xì)胞、分泌黏液的杯狀細(xì)胞、無纖毛和分泌功能的未分化柱狀細(xì)胞和基底細(xì)胞等構(gòu)成,且僅有一層細(xì)胞[15-16]。由于培養(yǎng)原代氣道上皮細(xì)胞存在取材繁瑣、細(xì)胞量少、成活率低、細(xì)胞純度低、耗時長、易污染等問題,因此對于原代氣道上皮細(xì)胞培養(yǎng)的方法仍處于探索階段。

目前氣道上皮細(xì)胞主要的培養(yǎng)方法有組織塊貼壁法、機(jī)械刮刷法及酶消化法[15,17]。組織塊貼壁法在國內(nèi)應(yīng)用較多,但其對于組織塊的形狀、貼壁契合度以及培養(yǎng)孔中水分的要求都較高,大大降低了細(xì)胞培養(yǎng)的效率。機(jī)械刮刷法源自于臨床實踐中,即對患者行纖支鏡操作時取材,但此方法收集到的多為衰老、易脫落的氣道上皮細(xì)胞,且不適用于體型較小的實驗動物,目前應(yīng)用較少。目前國內(nèi)外比較推崇的是蛋白酶低溫消化法,這一方法對組織塊的形狀要求不高,對操作者培養(yǎng)過程中的操作熟練度、精細(xì)程度的要求較低,培養(yǎng)過程中所要求的酶濃度、消化時長等關(guān)鍵因素都是客觀可控的,當(dāng)掌握關(guān)鍵要素后,短期內(nèi)可大大提高培養(yǎng)效率。蛋白酶主要作用于氣道上皮下的基底膜,使上皮細(xì)胞從基底膜上脫落下來,但是低溫酶消化法對消化時長要求較高,若消化時長過短,脫落的上皮細(xì)胞數(shù)量過少;若消化時長過長,一方面會增加上皮細(xì)胞下成纖維細(xì)胞的脫落數(shù)量,另一方面蛋白酶會作用于已脫落的上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜,造成細(xì)胞活性降低,減少上皮細(xì)胞存活率[18]。因此,確定一個合適的消化時長對能否成功培養(yǎng)原代MTEC具有重要作用。

本實驗在You等[7]操作指南的基礎(chǔ)上進(jìn)行了修改,同時通過一系列實驗明確最合適的消化時長。本實驗結(jié)果顯示,鏈霉蛋白酶消化12、18h能達(dá)到較好的初始細(xì)胞數(shù)量和最終細(xì)胞純度,其中12h組的細(xì)胞活性更強(qiáng),且實驗所需時間更短。因此,ALI培養(yǎng)原代MTEC時,鏈霉蛋白酶消化12h是最佳選擇。

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