唐利紅 麻慶樂 盧德趙

動脈粥樣硬化病變處新生血管具有滲透性高、脆性大等特點，易使脂質(zhì)及各種炎細(xì)胞浸潤斑塊[1]。而新生血管僅由一層內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，易破裂并誘發(fā)斑塊內(nèi)出血，從而促進動脈粥樣硬化病變的發(fā)展[2]?？梢?，內(nèi)皮細(xì)胞新生血管致使斑塊不穩(wěn)定是動脈粥樣硬化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，而抑制血管新生是防治動脈粥樣硬化的策略之一[3-5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生、發(fā)展有著密切關(guān)系。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regu－lated protein 78kD，GRP78）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上重要的分子伴侶，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志蛋白。現(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，所有能激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的環(huán)境或化學(xué)因素都能相應(yīng)提高血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）mRNA及轉(zhuǎn)錄后水平，且GRP78 mRNA表達(dá)與VEGF mRNA表達(dá)一致，故推測GRP78表達(dá)與斑塊新生血管密切相關(guān)[6]。黃連素是一種異喹啉類生物堿，可從黃連、黃柏、三棵針等植物提取，具有穩(wěn)定斑塊、改善動脈粥樣硬化病變程度的作用[7-8]。本研究通過體外培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞，觀察GRP78在內(nèi)皮細(xì)胞新生血管中的表達(dá)及黃連素的干預(yù)作用，探討黃連素的抗動脈粥樣硬化作用及其可能機制，為動脈粥樣硬化的治療提供新靶點，為黃連素的臨床應(yīng)用提供實驗基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料 （1）細(xì)胞株：人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC），由浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院實驗室保存。（2）藥物與試劑：黃連素（AB271B，中國天津一方科技有限公司），F(xiàn)BS（1414876，以色列 Biological Industries公司），4-苯基丁酸（4-PBA，P21005，美國 Sigma公司），毒胡蘿卜素（TG，T9033，美國Sigma公司），GRP78抗體（11587-1-AP，中國武漢三鷹公司），VEGF抗體（A20150906104，中國Cloud-Clone Crop公司），缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）抗體（B3301，美國 Immuno Way公司），β-actin抗體（00211510，中國康為世紀(jì)生物公司）。（3）主要儀器：酶標(biāo)儀（Spectra Max 190，美國Molecular Devices公司），qRT-PCR儀（Step One Plus，美國 Applied Biosystems公司），半干轉(zhuǎn)膜儀（Trans-Blot Turbo，美國 Bio-RAD 公司），顯微鏡（BX53，日本OLYMPUS公司）。

1.2 方法

1.2.1 HUVEC培養(yǎng)與傳代 HUVEC接種于含10%無菌FBS、100U/ml青霉素和100U/ml鏈霉素的杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）高糖培養(yǎng)液中，置37℃、5%CO2、飽和濕度的恒溫培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，細(xì)胞為貼壁細(xì)胞，呈長梭狀。每天觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90%時，進行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，實驗使用對數(shù)生長期的HUVEC。

1.2.2 細(xì)胞增殖能力檢測 采用噻唑藍(lán)（MTT）法。取對數(shù)生長期HUVEC，0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103/ml，每孔 100μl接種于 96孔板中，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。用含 0、25、50、75、100、200μmol/L 黃連素的培養(yǎng)液培養(yǎng)24h，每組設(shè)6個復(fù)孔。在培養(yǎng)結(jié)束前4h，每孔加入 MTT（5mg/ml）溶液 20μl。培養(yǎng)結(jié)束后，棄上清液，每孔加入二甲基亞砜（DMSO）150μl溶解結(jié)晶物，用酶標(biāo)儀于490nm波長處測定吸光度，計算細(xì)胞相對存活率。

1.2.3 細(xì)胞分組 將處于對數(shù)生長期的HUVEC分為6組：對照組（正常培養(yǎng)的HUVEC），GRP78抑制劑4-PBA組（4-PBA 5mmol/L作用 24h），GRP78激動劑TG組（TG 300nmol/L作用 24h），黃連素低、中、高劑量組（TG 300nmol/L 聯(lián)合 50、75、100μmol/L 黃連素分別作用24h）。

1.2.4 細(xì)胞遷移能力檢測 采用劃痕法。取對數(shù)生長期HUVEC，0.25%胰酶消化，調(diào)整細(xì)胞密度為2.5×105/ml，每孔2ml接種于6孔板中，置細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿單層后棄原培養(yǎng)液。用200μl槍頭在6孔板底部單層細(xì)胞平行劃痕，PBS洗3次，按照實驗設(shè)計分別加入不含血清的含藥培養(yǎng)液，置細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24h后拍照，利用Image J軟件分析細(xì)胞間距離，即遷移距離。

1.2.5 細(xì)胞成血管能力檢測 采用體外Matrigel Matrix膠法。將各組處理好的HUVEC胰酶消化后，用無血清培養(yǎng)液重懸，調(diào)整細(xì)胞密度為2×105/ml，按每孔100μl細(xì)胞懸液的量接種于Matrix膠包被的96孔板，置細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育6h，鏡下觀察并拍照，利用Image-Pro plus 6.0軟件分析管腔數(shù)目。

1.2.6 VEGF、GRP78、HIF-1α mRNA表達(dá)的檢測 采用qRT-PCR法。Trizol法提取各組HUVEC中總RNA，紫外分光光度計測定總RNA的純度及濃度。根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，采用qRTPCR進行擴增，引物序列見表1。擴增條件：95℃預(yù)變性 5min；95℃變性 10s，60℃退火 30s，72℃延伸 5s，共擴增 40 個循環(huán)。計算公式 Ratio=2-ΔΔCT，ΔCT1=對照目的基因CT值-對照內(nèi)參基因CT值，ΔCT2=實驗組目的基因 CT 值-實驗組內(nèi)參基因 CT 值，ΔΔCT=ΔCT2-ΔCT1。代入公式計算Ratio，即mRNA相對表達(dá)量。

表 1 VEGF、GRP78、HIF-1α 引物序列

1.2.7 VEGF、GRP78、HIF-1α 蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot法。提取各組細(xì)胞總蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯（BCA）法測定蛋白濃度，取20μg蛋白上樣，調(diào)整樣品至相同濃度，與上樣緩沖液混合，100℃煮沸變性5min。經(jīng)5%濃縮膠和10%分離膠進行電泳分離后，半干轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜上；含5%脫脂奶粉的TBST室溫封閉2h，將膜轉(zhuǎn)入含一抗（β-actin 1∶3 000稀釋，VEGF、GRP78、HIF-1α 1∶1 000 稀釋） 的 TBST中，4℃孵育過夜。室溫下TBST洗膜4次，10min/次，將膜轉(zhuǎn)入含二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗1∶8 000稀釋）的TBST中，室溫孵育2h；室溫下TBST洗膜4次，10min/次。增強化學(xué)發(fā)光（ECL）顯色，化學(xué)發(fā)光成像儀曝光1～2min，掃描圖像并分析灰度，以目的蛋白/βactin的比值為蛋白相對表達(dá)量。

1.2.8 細(xì)胞內(nèi)GRP78的定位觀察 采用免疫熒光法。將細(xì)胞接在玻片上，放入6孔板中，在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞密度適中（60%～75%）；取出玻片，在 PBS（pH7.0）中蘸洗10次，吸干多余液體，放入每孔裝有2ml多聚甲醛的6孔板中，室溫固定10～15min；取出固定好的玻片，在PBS中蘸洗10次，放在干凈的載玻片上。在玻片上滴加相應(yīng)抗體4°C過夜。次日玻片在PBS中蘸洗20次，放在載玻片上，滴加熒光二抗，常溫避光放置1h。在PBS中蘸洗20次，封片。在熒光顯微鏡下觀察GRP78定位及表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計軟件。計量資料用表示，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度黃連素對細(xì)胞增殖能力的影響 與對照組（黃連素濃度為0）比較，黃連素濃度為25、50、75、100μmol/L組細(xì)胞相對存活率均略有下降，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P＞0.05）；黃連素濃度為200μmol/L組細(xì)胞相對存活率明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。因此，本實驗黃連素的處理劑量選擇50、75、100μmol/L。

圖1 不同濃度黃連素對細(xì)胞增殖能力的影響（與0μmol/L組比較，*P＜0.05）

2.2 黃連素對細(xì)胞遷移能力的影響 與對照組比較，4-PBA組細(xì)胞遷移距離明顯較短（P＜0.05）；TG組細(xì)胞遷移距離明顯較長（P＜0.05），24h時已遷移至接近匯合。與TG組比較，黃連素低、中、高劑量組細(xì)胞遷移距離明顯較短（均P＜0.05），說明黃連素能抑制TG誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移，見圖2。

圖2 黃連素對細(xì)胞遷移能力的影響（a：對照組；b：4-PBA組；c：TG組；d：黃連素低劑量組；e：黃連素中劑量組；f：黃連素高劑量組；與對照組比較，*P＜0.05；與 TG 組比較，△P＜0.05；×400）

2.3 黃連素對細(xì)胞成血管能力的影響 與對照組比較，4-PBA組管腔數(shù)目明顯減少（P＜0.05），4-PBA能抑制內(nèi)皮細(xì)胞血管生成；TG組管腔數(shù)目明顯增多（P＜0.05），TG可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成。與TG組比較，黃連素低、中、高劑量組管腔數(shù)目均明顯減少（均P＜0.05），說明黃連素能抑制TG誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞血管生成，且呈一定的濃度依賴性，見圖3。

2.4 黃連素對HUVEC中 VEGF、GRP78、HIF-1α mRNA表達(dá)的影響 與對照組比較，TG組HUVEC中VEGF、GRP78、HIF-1αmRNA相對表達(dá)量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與TG組比較，黃連素中、高劑量組 HUVEC 中 VEGF、GRP78、HIF-1α mRNA 相對表達(dá)量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖 4。

2.5 黃連素對HUVEC中VEGF、GRP78、HIF-1α 蛋白表達(dá)的影響 與對照組比較，TG組HUVEC中VEGF、GRP78、HIF-1α蛋白相對表達(dá)量均明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。與TG組比較，黃連素低、中、高劑量組HUVEC中VEGF、GRP78、HIF-1α蛋白相對表達(dá)量均明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖 5。

圖5 黃連素對HUVEC中VEGF、GRP78、HIF-1α 蛋白表達(dá)的影響（a：對照組；b：4-PBA組；c：TG組；d：黃連素低劑量組；e：黃連素中劑量組；f：黃連素高劑量組；與對照組比較，*P＜0.05；與 TG 組比較，△P＜0.05）

2.6 黃連素對細(xì)胞膜上GRP78表達(dá)的影響 熒光顯微鏡下觀察GRP78分布于內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上，TG刺激后細(xì)胞膜上GRP78高表達(dá)，而4-PBA（5mmol/L）及黃連素（50、75、100μmol/L）能明顯降低細(xì)胞膜上 GRP78表達(dá)，見圖 6（插頁）。

圖6 黃連素對細(xì)胞膜上GRP78表達(dá)的影響（a：對照組；b：4-PBA組；c：TG組；d：黃連素低劑量組；e：黃連素中劑量組；f：黃連素高劑量組；紅色信號代表GRP78，藍(lán)色信號代表細(xì)胞核，合成圖片可觀察GRP78在細(xì)胞膜上表達(dá)情況；×200）

3 討論

斑塊內(nèi)病理性新生血管是動脈粥樣硬化進展及不穩(wěn)定斑塊形成的關(guān)鍵之一，抗血管新生研究對于動脈粥樣硬化進展及不穩(wěn)定斑塊形成的防治具有重要意義。國內(nèi)外研究表明，抑制血管新生能夠延緩動脈粥樣硬化進程[9-12]。本研究應(yīng)用黃連素作為抗血管新生藥物，主要考慮到目前常規(guī)治療動脈粥樣硬化的他汀類藥物費用昂貴，且存在肝損傷、肌肉溶解等不良反應(yīng)。黃連素一直被傳統(tǒng)中醫(yī)用于治療腹瀉、痢疾、瘧疾等胃腸道感染性疾病[13]；近年來，多項基礎(chǔ)研究證實黃連素是一種機制完全不同于他汀類降脂作用的中藥單體[14-16]，可有效治療動脈粥樣硬化，且安全性高、價格低廉。因此，深入研究黃連素抗動脈粥樣硬化機制、拓展其臨床應(yīng)用具有積極意義。

動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)新生血管主要由外膜的滋養(yǎng)血管芽生而來，隨著斑塊內(nèi)炎癥反應(yīng)增強和斑塊體積增大，斑塊內(nèi)的新生血管數(shù)量逐漸增多，并逐漸向血管內(nèi)皮下生長[17-18]。新生血管的結(jié)構(gòu)不完善，管壁薄，內(nèi)皮細(xì)胞間連接不緊密[19]。新生血管的高滲透性會導(dǎo)致血液中脂質(zhì)、炎癥細(xì)胞和紅細(xì)胞從管腔中漏出，進入斑塊內(nèi)環(huán)境，加上血管易破裂使得斑塊內(nèi)出血的可能性增大，從而加重管腔狹窄[20]。本文通過體外血管生成實驗證實黃連素具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移及成血管能力。

為了揭示黃連素抗血管生成的作用機制，筆者探討了GRP78與血管新生的關(guān)系。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中極其豐富的分子伴侶蛋白，也被稱作免疫球蛋白重鏈結(jié)合蛋白，是啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時未折疊蛋白反應(yīng)（UPR）級聯(lián)合信號途徑[21]。越來越多研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對動脈粥樣硬化血管生成起著關(guān)鍵作用，在動脈粥樣硬化性疾病中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通過UPR系統(tǒng)中應(yīng)激信號跨膜感受蛋白相關(guān)的機制上調(diào)VEGF表達(dá)，從而促進血管生成。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時，GRP78可阻止未折疊蛋白合成及錯誤折疊蛋白聚集，促進其正確折疊，從而恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)[22]。那么，GRP78與血管新生的關(guān)系如何呢？Annat等[23]研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞受刺激后GRP78在細(xì)胞膜上的表達(dá)與血管新生有關(guān)。本實驗采用GRP78激動劑TG及抑制劑4-PBA干預(yù)HUVEC，發(fā)現(xiàn)TG能有效促進其遷移及管狀結(jié)構(gòu)形成，而4-PBA處理后效果相反，這證實GRP78可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞血管生成。VEGF是目前所發(fā)現(xiàn)的唯一特異性促進血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂的生長因子，是一種具有促進血管新生和組織修復(fù)的血管生成因子[24]。由于動脈粥樣硬化斑塊形成時，內(nèi)環(huán)境處于缺氧狀態(tài)，有氧代謝細(xì)胞中HIF-1α?xí)患せ钋也粩喾e累，并能穩(wěn)定表達(dá)蛋白，通過誘導(dǎo)VEGF表達(dá)，特異性地結(jié)合位于新生血管內(nèi)皮上的VEGF受體，促進內(nèi)皮細(xì)胞生長，形成新的血管管腔，以維持斑塊內(nèi)的氧供需平衡[25]。筆者進一步對HUVEC中VEGF、HIF-1α表達(dá)進行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)GRP78的表達(dá)與VEGF、HIF-1α的表達(dá)一致，說明GRP78誘導(dǎo)VEGF、HIF-1α表達(dá)的血管生成機制是一個獨立的機制。采用黃連素干預(yù)TG刺激后的HUVEC，VEGF、HIF-1α、GRP78表達(dá)均明顯下降，且細(xì)胞遷移、成血管能力均明顯減弱，這說明黃連素可能通過調(diào)控VEGF、HIF-1α、GRP78表達(dá)的機制從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞血管新生。同時，免疫熒光法觀察并證實了4-PBA及黃連素能明顯降低細(xì)胞膜上GRP78表達(dá)。

綜上所述，GRP78與內(nèi)皮細(xì)胞新生血管有關(guān)。GRP78激動劑TG可增加VEGF、GRP78、HIF-1α的mRNA和蛋白表達(dá)，增強細(xì)胞遷移、成血管能力；經(jīng)黃連素處理后，內(nèi)皮細(xì)胞中 VEGF、GRP78、HIF-1α 的 mRNA 和蛋白表達(dá)量降低，細(xì)胞遷移、成血管能力減弱。黃連素可能通過抑制GRP78表達(dá)從而抑制內(nèi)皮細(xì)胞血管新生。