吳云濤 唐晨野 郭曉 王驍

丹參酮類化合物又稱總丹參酮，是從唇形科植物丹參干燥的根和根莖中提取的一大類脂溶性菲醌類化合物。丹參酮ⅡA是其中含量最多的成分，具有抗心律失常、縮小心肌梗死面積、改善心肌耗氧量、改善微循環(huán)、抗肝纖維化、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞及誘導(dǎo)干細(xì)胞分化等作用[1]。近年來研究表明，丹參酮ⅡA對(duì)多種腫瘤細(xì)胞，如胃癌、前列腺癌、肝癌、肺癌、結(jié)腸癌和卵巢癌等，均具有良好的抗腫瘤活性[2-7]。本研究旨在觀察丹參酮ⅡA對(duì)人膀胱癌J82細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移等生物學(xué)特性的影響，為丹參酮ⅡA用于膀胱癌治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株及試劑 人膀胱癌J82細(xì)胞株（中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)），丹參酮ⅡA（T4952-5MG，美國(guó)Sigma公司），DMEM 培養(yǎng)基（SH30022.01B，美國(guó)Hyclone公司），F(xiàn)BS（S601S-500，德國(guó) Sera&Pro公司），胰蛋白酶（0457，美國(guó) Amresco公司），PBS（GNM-10010，杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司），青鏈霉素雙抗（15140-122，美國(guó)Gibco公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒（CCK-8）、膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙錠（PI）凋亡檢測(cè)試劑盒（日本同仁化學(xué)研究所），Matrigel基質(zhì)膠、Transwell侵襲小室（美國(guó)Corning公司），培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、離心管、6孔板、96孔板（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人膀胱癌J82細(xì)胞體外培養(yǎng)于DMEM（高糖）培養(yǎng)基（含10%FBS+1%雙抗），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 采用CCK-8法。胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人膀胱癌J82細(xì)胞并配制成細(xì)胞懸液，每孔加100μl（3 000～5 000個(gè)細(xì)胞），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（過夜貼壁），邊緣孔用無菌PBS填充。設(shè)置藥物濃度分別為 1、2、3、5、8μmol/L 的實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組（藥物濃度為0μmol/L）及空白對(duì)照組，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。在實(shí)驗(yàn)組中每孔加入10μl相應(yīng)濃度藥物，空白對(duì)照組每孔加入10μl培養(yǎng)基。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24、48h后，各取1塊板，每孔加入 10μl CCK-8試劑，輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻，在培養(yǎng)箱中孵育2h。使用酶標(biāo)儀測(cè)定450nm處光密度值（OD值）。增殖抑制率=1-（OD值實(shí)驗(yàn)組-OD值空白對(duì)照組）/（OD值陰性對(duì)照組-OD值空白對(duì)照組）×100%。應(yīng)用Graphpad Prism軟件繪圖。

1.2.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè) 采用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記流式檢測(cè)法。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人膀胱癌J82細(xì)胞3瓶，棄原培養(yǎng)基，分別加入含有濃度為1、3、5μmol/L藥物的培養(yǎng)基，另取1瓶作為對(duì)照組給予換液；培養(yǎng)48h后按照Annexin V-FITC/PI凋亡檢測(cè)試劑盒操作步驟染色、上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，應(yīng)用Flowjo軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)。用無血清培養(yǎng)基按照1∶5比例稀釋Matrigel基質(zhì)膠，每孔100μl加入上室內(nèi)，置入37℃培養(yǎng)箱內(nèi)40min使膠凝固。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期人膀胱癌J82細(xì)胞，胰蛋白酶消化、離心；用無血清培養(yǎng)基及無血清含藥物濃度為1、3、5μmol/L的培養(yǎng)基分別懸浮細(xì)胞，調(diào)整濃度至5×105/ml，每孔100μl接種于上室內(nèi)，下室加入500μl含20%FBS培養(yǎng)基；分別培養(yǎng)24、48h后取出小室，棉簽擦去上室內(nèi)基質(zhì)膠及細(xì)胞，甲醛固定20min，0.1%結(jié)晶紫染色15min，PBS沖洗2次，在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野，拍照并計(jì)數(shù)。

1.2.5 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用劃痕實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)操作前對(duì)所用物品進(jìn)行滅菌，使用直尺、記號(hào)筆等物品操作前在超凈臺(tái)內(nèi)紫外線照射30min。胰蛋白酶消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的人膀胱癌J82細(xì)胞并配制成細(xì)胞懸液，以2ml/孔（約5×105個(gè)細(xì)胞）接種至6孔板中，分別加入含濃度為1、3、5μmol/L藥物的培養(yǎng)基，分為 3組，并設(shè)置對(duì)照組，培養(yǎng)24h后將6孔板放置在預(yù)先設(shè)計(jì)好的劃痕模版（模版上均勻劃6條橫線，線間距離1cm）上，借助直尺，用200μl移液槍頭依照模版在板底對(duì)應(yīng)孔中劃直線，用PBS漂洗2次以除去劃下的懸浮細(xì)胞；繼續(xù)培養(yǎng)12、24、36h后在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞遷移情況。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件測(cè)量各個(gè)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞未覆蓋的面積。劃痕愈合率=1-（各時(shí)間點(diǎn)劃痕面積/開始的劃痕面積×100%）。上述實(shí)驗(yàn)步驟重復(fù)5次，取平均值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SAS 8.1統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用表示，細(xì)胞增殖抑制率及細(xì)胞侵襲數(shù)的比較采用析因設(shè)計(jì)資料的方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；劃痕愈合率的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。細(xì)胞凋亡率的比較采用χ2檢驗(yàn)，兩兩比較采用Bonfferoni校正法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丹參酮ⅡA對(duì)J82細(xì)胞增殖的影響 1、2、3、5、8μmol/L丹參酮ⅡA對(duì)J82細(xì)胞作用24h時(shí)的增殖抑制率分別為（1.88±3.07）%、（15.34±4.43）%、（30.24±3.38）%、（42.44±1.98）%、（46.36±2.40）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；作用 48h時(shí)的增殖抑制率分別為（3.12±2.73）%、（19.83±4.27）%、（45.41±3.20）%、（62.09±5.04）%、（67.79±1.94）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。隨著給藥濃度的增加，J82細(xì)胞增殖抑制率隨之增加；在相同給藥濃度（除1μmol/L外）前提下，丹參酮ⅡA作用48h的細(xì)胞增殖抑制率均高于24h（均P＜0.05）。提示丹參酮ⅡA對(duì)J82細(xì)胞有增殖抑制作用，且呈濃度與時(shí)間依賴性，見圖1。

圖1 不同濃度丹參酮ⅡA作用24、48h對(duì)J82細(xì)胞增殖的影響

2.2 丹參酮ⅡA對(duì)J82細(xì)胞凋亡的影響 對(duì)照組、1μmol/L組、3μmol/L組、5μmol/L組細(xì)胞數(shù)分別為7 787、10 106、9 502、14 941個(gè)；總凋亡率分別為3.36%、12.23%、14.74%、18.40%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。兩組間比較發(fā)現(xiàn)，3個(gè)藥物處理組總凋亡率均高于對(duì)照組（均P＜0.05），3μmol/L組、5μmol/L組均高于 1μmol/L組（均P＜0.05），5μmol/L 組高于 3μmol/L 組（P＜0.05）。提示丹參酮ⅡA對(duì)J82細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡的作用，且呈濃度依賴性，見圖2。

圖2 不同濃度丹參酮ⅡA作用48h對(duì)J82細(xì)胞凋亡的影響（Q1：機(jī)械損傷；Q2：晚期凋亡；Q3：正常細(xì)胞；Q4：早期凋亡；總凋亡率為Q4、Q2之和）

2.3 丹參酮ⅡA對(duì)J82細(xì)胞侵襲能力的影響 對(duì)照組、1μmol/L 組、3μmol/L 組、5μmol/L 組作用 24、48h時(shí) J82細(xì)胞侵襲數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，同一時(shí)點(diǎn)任意兩濃度組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。在相同給藥濃度的前提下，丹參酮ⅡA作用48h的細(xì)胞侵襲數(shù)均少于24h（均P＜0.05）。提示丹參酮ⅡA能減弱J82細(xì)胞的侵襲能力，且呈濃度與時(shí)間依賴性，見表1和圖3（插頁(yè)）。

圖3 不同濃度丹參酮ⅡA作用24、48h對(duì)J82細(xì)胞侵襲能力的影響（結(jié)晶紫染色，×150）

2.4 丹參酮ⅡA對(duì)J82細(xì)胞遷移能力的影響 不同濃度丹參酮ⅡA對(duì)J82細(xì)胞作用24h后進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)，觀察劃痕后12、24、26h的J82細(xì)胞劃痕愈合率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)對(duì)照組、1μmol/L 組、3μmol/L 組、5μmol/L 組劃痕后 12、24、36h劃痕愈合率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。進(jìn)一步兩兩比較發(fā)現(xiàn)，3μmol/L組、5μmol/L組與對(duì)照組以及1μmol/L組與5μmol/L組劃痕后12、24h劃痕愈合率比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（均P＜0.05）；劃痕后36h，任意兩濃度組劃痕愈合率比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。提示丹參酮ⅡA能減弱J82細(xì)胞的遷移能力，且呈濃度依賴性，見表2和圖4。

表1 丹參酮ⅡA對(duì)J82細(xì)胞侵襲數(shù)的影響（個(gè)）

表2 丹參酮ⅡA對(duì)J82細(xì)胞劃痕愈合率的影響（%）

3 討論

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)中發(fā)病率最高的惡性腫瘤。新發(fā)膀胱癌多數(shù)為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌，治療以手術(shù)切除為主，術(shù)后聯(lián)合輔助性膀胱灌注治療（包括膀胱灌注化療、膀胱灌注免疫治療）。膀胱癌患者5年生存率可達(dá)90%，但臨床上面臨較大的問題是其復(fù)發(fā)率很高（50%～70%），部分患者（10%～15%）甚至進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌[8]，最終全身轉(zhuǎn)移而病死。因此，減少膀胱癌的復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

近年來，隨著對(duì)各類中藥化學(xué)成分的深入研究，發(fā)現(xiàn)了一大批具有抗腫瘤活性良好的天然化合物，如丹參酮ⅡA等。已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，丹參酮ⅡA可抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和增殖。Su等[9]證實(shí)丹參酮ⅡA處理人胃腺癌AGS細(xì)胞后，可以在體外和體內(nèi)抑制第10號(hào)染色體磷酸酶和張力蛋白同源丟失性基因（PTEN）的蛋白表達(dá)，通過下調(diào)磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/絲蘇氨酸蛋白激酶（Akt）/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）級(jí)聯(lián)抑制腫瘤細(xì)胞增殖。Zhang等[10]研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA在食管癌Ec109細(xì)胞中可通過上調(diào)microRNA-122而抑制丙酮酸激酶M2（PKM2）的表達(dá)，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖。在丹參酮ⅡA誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的研究中，Jung等[11]發(fā)現(xiàn)丹參酮ⅡA可能通過兩面神激酶（JAK）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3/5（STAT3/5）途徑體外誘導(dǎo)慢性粒細(xì)胞白血病K562細(xì)胞凋亡；而Lin等[12]研究結(jié)果表明，經(jīng)丹參酮ⅡA處理后，人類肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞中Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白樣白介素-1β轉(zhuǎn)換酶抑制蛋白（FLIPS）表達(dá)明顯下調(diào)，形成半胱天冬酶8的同二聚體并作用于受體相互作用蛋白激酶-1（RIP1）、RIP3和混合系列蛋白激酶樣結(jié)構(gòu)域（MLKL），從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。除了上述抑制腫瘤細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)其凋亡的作用外，丹參酮ⅡA還被證實(shí)具有抑制腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移的作用。Zhang等[13]研究發(fā)現(xiàn)，丹參酮ⅡA可明顯降低基質(zhì)金屬蛋白酶-2、基質(zhì)金屬蛋白酶-9的表達(dá)水平，從而抑制骨肉瘤MG-63細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。李萍等[14]研究表明，丹參酮ⅡA能明顯降低異質(zhì)性黏附分子CD44V6的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)E-鈣黏附蛋白的表達(dá)，從而減弱胃癌MKN-45細(xì)胞黏附侵襲與趨化能力，達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞侵襲與轉(zhuǎn)移的目的。

圖4 不同濃度丹參酮ⅡA作用24h（劃痕后0、12、24、36h）對(duì)J82細(xì)胞遷移能力的影響（×150）

本實(shí)驗(yàn)就丹參酮ⅡA是否對(duì)膀胱癌具有同樣良好的抗腫瘤活性進(jìn)行了探討，結(jié)果表明丹參酮ⅡA在體外能抑制人膀胱癌J82細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)其凋亡，還能降低其侵襲與遷移的能力，且在一定程度上呈現(xiàn)出濃度及作用時(shí)間依賴效應(yīng)。但本研究為初步實(shí)驗(yàn)，仍存在不足之處，如關(guān)于丹參酮ⅡA降低腫瘤細(xì)胞侵襲與遷移能力的作用，尚不能判斷是藥物直接作用，還是由于藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞抑制增殖及誘導(dǎo)凋亡的作用過于顯著而導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)量明顯減少，從而影響了腫瘤細(xì)胞的侵襲與遷移能力。下一步筆者將從分子水平進(jìn)行研究，探討其相關(guān)機(jī)制，為丹參酮ⅡA用于膀胱癌治療提供更可靠的理論依據(jù)。