胡曉磊，吳 迅，馬永輝，張惠玲*

（1.寧夏大學 寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室，寧夏 銀川 750021；2.寧夏大學 農學院，寧夏 銀川 750021）

馬鈴薯是我國當前最具發(fā)展前景的高產糧食作物之一，近年來國家一直提倡增加馬鈴薯深加工產品，提高馬鈴薯附加值[1-2]，快速推動我國馬鈴薯產業(yè)的發(fā)展。馬鈴薯是寧夏優(yōu)勢特色農產品加工產業(yè)中的重點支持產業(yè)，具有品種優(yōu)良、加工風味好、淀粉含量高等優(yōu)勢[3-6]。其包含了人體所需的各種營養(yǎng)素（如蛋白質、維生素、膳食纖維、礦物質元素等），具有預防腸胃疾病、抗衰老、抗氧化、降低膽固醇、防止動脈硬化、減少白內障、角膜炎等相關炎癥、排毒、解毒等功能性作用[7]。

紅茶菌是由多種醋酸菌、酵母菌和乳酸菌組成的共生體，俗稱“海寶”、“胃寶”[8]，具有抵抗癌癥、提高消化能力、刺激免疫系統(tǒng)、減少發(fā)炎、清理腸胃、幫助消化、預防和治療便秘和痔瘡、預防“三高”、結石及一些心血管疾病、排毒、調節(jié)機體免疫力等作用[9-12]。到目前為止，從各種紅茶菌中分離到的醋酸菌有薩克塔堤查仁桿菌（Tanticharoenia sakaeratensis）、羅旺醋酸桿菌（Acetobacter lovaniensis）、過氧化醋酸桿菌（Acetobacter peroxydans）、蒲桃醋酸桿菌（Acetobactersyzygii）、沖繩醋酸桿菌（Acetobacterokinawensis）、熱帶醋酸桿菌（Acetobacter tropicalis）、醋化醋桿菌（Acetobacter liquefy aciens）等；酵母菌有釀酒酵母（Saccha romyces cerevisiae）、克魯斯假絲酵母（Candiada krusei）、弗洛接合有孢圓酵母（Zygotorulaspora florentina）、熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）、博伊丁假絲酵母（Candida boidinii）、粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）等[13]；乳酸菌有保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）等。

國內現(xiàn)在對紅茶菌的研究主要集中于發(fā)酵條件優(yōu)化，且都僅局限于搖瓶試驗，在發(fā)酵罐發(fā)酵方面的優(yōu)化少有涉及[14]。同時，馬鈴薯醋多為運用酵母菌和醋酸菌進行發(fā)酵而成。目前，國內關于利用紅茶菌發(fā)酵馬鈴薯醋的研究尚未報道。人們對紅茶菌作用機理的研究寥寥無幾，且紅茶菌功能性食品品種極少，市場化程度低[15]。

本研究以馬鈴薯（青薯9號）為原料，利用紅茶菌進行馬鈴薯醋發(fā)酵，并以陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量為響應值，初始糖度、紅茶菌接種量及發(fā)酵溫度為考察因素，采用響應面法優(yōu)化馬鈴薯醋發(fā)酵工藝。加深對紅茶菌的研究，拓寬馬鈴薯加工渠道，發(fā)展馬鈴薯加工業(yè)，實現(xiàn)增值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料與菌株

馬鈴薯（青薯9號）：寧夏黃土地農業(yè)食品有限公司提供（淀粉含量15.1%，粗蛋白含量2.08%，維生素C含量18.6 mg/100 g鮮薯）[16]；紅茶菌：寧夏食品微生物應用技術與安全控制重點實驗室。

1.1.2 試劑

α-淀粉酶（≥3 700 U/g）、糖化酶（≥10 000 U/g）：北京奧博星生物技術有限責任公司；紅茶、白砂糖、檸檬酸（均為食用級）：市售。

1.2 儀器與設備

HH.S21-6型電熱恒溫水浴鍋、BSP-250型生化培養(yǎng)箱：上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；PB-10型酸度計：北京賽多利斯公司；WYT-4型手持糖度計：泉州中友光學儀器有限公司；T-1000型電子天平：美國雙杰兄弟（集團）有限公司；H-1650型臺式高速離心機：上海趙迪生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 紅茶菌的活化與培養(yǎng)

按照糖∶紅茶∶水為1∶15∶100的比例[17]，將紅茶加入沸水中，于85～90℃保持25 min，過濾得茶汁，加入溶化的糖水，接入40%紅茶菌種母液，放入玻璃容器中，用單層紗布封口，于30℃靜置發(fā)酵7 d，待液面產生數(shù)層菌膜即可。

用消毒后的鑷子取出容器內殘余的菌膜，去除菌膜上褐變的部分，用無菌水沖洗菌膜數(shù)遍。無菌水洗凈容器后，倒入成熟的紅茶菌菌液和新鮮的紅茶糖水及處理好的紅茶菌菌膜，再按上述方法繼續(xù)培養(yǎng)紅茶菌，直至擴大培養(yǎng)到所需用量。

1.3.2 馬鈴薯醋工藝流程及操作要點

馬鈴薯預處理→蒸煮→打漿→酶解→滅酶→過濾→調糖、調酸→高溫滅菌→接紅茶菌→紅茶菌發(fā)酵→陳釀→過濾→灌裝→滅菌→成品

（1）原料預處理、蒸煮、打漿[18]：將馬鈴薯進行清洗、去皮、切分，蒸熟晾涼后，加入馬鈴薯質量4倍的水進行打漿，制成馬鈴薯原液。

（2）酶解、滅酶、過濾：在馬鈴薯原液中加入0.23%α-淀粉酶、0.23%糖化酶，在60℃恒溫水浴鍋中進行液化、糖化4 h，90℃水浴10 min，滅酶并過濾，制成馬鈴薯糖化液。

（3）調糖、調酸：在馬鈴薯糖化液中加入白砂糖、檸檬酸，將糖度調至18.0%，pH調至3.80。

（4）高溫滅菌：馬鈴薯糖化液在121℃條件下高壓滅菌15 min，冷卻待用。

（5）紅茶菌接種與發(fā)酵：將冷卻后的馬鈴薯糖化液接入活化后的紅茶菌中，放入恒溫培養(yǎng)箱中進行紅茶菌發(fā)酵，測定總酸含量接近2.5 g/100 mL后結束發(fā)酵。

（6）陳釀、過濾：將發(fā)酵結束的原醋陳釀60 d，離心、過濾制得馬鈴薯醋。

（7）灌裝、滅菌：選擇合適的包裝瓶，將馬鈴薯醋液灌裝進去，封好進行巴氏殺菌。

1.3.3 馬鈴薯醋發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

初始糖度：馬鈴薯糖化液過濾后，分別加白砂糖調糖度至12.0%、14.0%、16.0%、18.0%、20.0%，接入20%培養(yǎng)好的紅茶菌液，于30℃恒溫生化培養(yǎng)箱中深層發(fā)酵，測定陳釀前發(fā)酵液的總酸含量。

紅茶菌接種量：馬鈴薯糖化液過濾后，調糖度至20%，分別接入5%、10%、15%、20%、25%紅茶菌液，在30℃恒溫生化培養(yǎng)箱中深層發(fā)酵，測定陳釀前發(fā)酵液的總酸含量。

發(fā)酵溫度：馬鈴薯糖化液過濾后，調糖度至20%，接入20%紅茶菌液，分別于28℃、30℃、32℃、34℃、36℃的恒溫生化培養(yǎng)箱中深層發(fā)酵，測定陳釀前發(fā)酵液的總酸含量。

1.3.4 馬鈴薯醋發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，利用Box-Benhnken試驗設計，以陳釀前馬鈴薯醋中的總酸含量（Y）為響應值，考察初始糖度（A）、紅茶菌接種量（B）及發(fā)酵溫度（C）3個因素對馬鈴薯醋發(fā)酵的影響。響應面試驗設計的因素與水平見表1。

表1 馬鈴薯醋發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface tests for potato vinegar fermentation process optimization

1.3.5 分析方法

總酸含量（以醋酸計）的測定：酚酞指示劑法[19]；糖度的測定（以葡萄糖計）：3,5-二硝基水楊酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[20]；感官指標的測定：參照GB/T 5009.41—2003《食醋衛(wèi)生標準的分析方法》；細菌總數(shù)的測定：參照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗菌落總數(shù)測定》；大腸菌群的測定：參照GB 4789.3—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗大腸菌群計數(shù)》；致病菌的測定：GB/T 4789.22—2003《食品衛(wèi)生微生物學檢驗調味品檢驗》；可溶性固形物含量的測定：參照NY/T 2637—2014《水果和蔬菜可溶性固形物含量的測定折射儀法》。

2 結果與分析

2.1 馬鈴薯醋發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗

2.1.1 初始糖度對陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響

初始糖度對陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響結果見圖1。

圖1 初始糖度對陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響Fig.1 Effect of initial sugar content on total acid content in potato vinegar before aging

由圖1可以看出，在相同的發(fā)酵時間內，隨著初始糖度的增大，陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量呈先增大后減小的變化趨勢。當初始糖度為18.0%時，陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量最高，為2.34 g/100 mL。因此，確定最佳初始糖度為18.0%。

2.1.2 紅茶菌接種量對陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響

紅茶菌接種量對陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響結果見圖2。

圖2 紅茶菌接種量對陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響Fig.2 Effect of kombucha inoculum on total acid content in potato vinegar before aging

由圖2可以看出，在相同發(fā)酵時間內，隨著紅茶菌接種量的增大，陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量呈先增大后減小的變化趨勢。當紅茶菌接種量為20%時，陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量最高，為2.32 g/100 mL。因此，確定紅茶菌最佳接種量為20%。

2.1.3 發(fā)酵溫度對陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響

發(fā)酵溫度對陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響結果見圖3。

圖3 發(fā)酵溫度對陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響Fig.3 Effect of fermentation temperature on total acid content in potato vinegar before aging

由圖3可以看出，在相同的發(fā)酵時間內，發(fā)酵溫度在28～36℃的范圍內，陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量隨發(fā)酵溫度的升高呈先增大后減小的趨勢。當發(fā)酵溫度為32℃時，陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量最高，為2.33 g/100 mL。因此，確定最佳發(fā)酵溫度為32℃。

2.2 馬鈴薯醋發(fā)酵工藝優(yōu)化響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，以陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量（Y）為響應值，利用Box-Benhnken試驗設計考察初始糖度（A）、紅茶菌接種量（B）及發(fā)酵溫度（C）3個因素對陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量的影響，結果與分析見表2，方差分析見表3。

表2 Box-Benhnken試驗設計及結果Table 2 Design and results of Box-Benhnken tests

續(xù)表

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis of regression equation

通過Design-Expert 8.0.6軟件對表2的結果進行多元二次回歸擬合，得到總酸含量（Y）與初始糖度（A）、紅茶菌接種量（B）、發(fā)酵溫度（C）的回歸方程：

由表3可知，模型P＜0.000 1，極顯著；失擬項P＞0.05，不顯著，表明回歸模型的擬合度較好，可以用該方程對試驗結果進行分析。各因素對結果影響的主次順序為A＞C＞B，即初始糖度＞發(fā)酵溫度＞紅茶菌接種量。由方差分析可知，因素一次項A、B、C和二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著（P＜0.01），交互項AB、AC、BC對結果影響不顯著（P＞0.05）。

通過軟件繪制響應面圖進行可視化分析，初始糖度、紅茶菌接種量、發(fā)酵溫度間交互作用的響應面和等高線見圖4。由圖4可知，拋物面開口均向下，有極大值點；等高線均呈圓形，表明交互作用對結果影響不顯著，與方差分析結果一致。

圖4 各因素交互作用對陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量影響的響應面圖與等高線圖Fig.4 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors on total acid content in potato vinegar before aging

運行軟件的期望函數(shù)優(yōu)化程序，以陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量達到最大值為目標，獲得優(yōu)化發(fā)酵工藝參數(shù)為初始糖度18.62%、紅茶菌接種量20.56%、發(fā)酵溫度33.65℃，預測總酸含量可達到2.55 g/100 mL。考慮到實際操作的局限性，將最優(yōu)發(fā)酵條件調整為初始糖度19%、紅茶菌接種量21%、發(fā)酵溫度34℃，在該條件下重復試驗5次，獲得陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量為2.48 g/100 mL，與預測值基本符合，充分證明了該模型的準確性和實用性。綜上所述，紅茶菌發(fā)酵馬鈴薯醋的最優(yōu)發(fā)酵條件為初始糖度19%、紅茶菌接種量21%、發(fā)酵溫度34℃。

2.3 馬鈴薯醋的質量指標

2.3.1 感官指標

色澤：淺黃色；香氣：醇香，醋香香味協(xié)調；味道：酸中帶甜，無不良氣味；體態(tài)：澄清透亮，無沉淀，無浮膜。

2.3.2 理化指標

馬鈴薯醋陳釀后總酸含量（以乙酸計）為3.60 g/100 mL；可溶性固形物含量為10.50%，符合國家標準GB/T 18187—2000《釀造食醋》具體要求。

2.3.3 微生物指標

細菌總數(shù)≤500 CFU/mL；大腸桿菌未檢出；其他致病菌未檢出。符合GB 2719—2003《食醋衛(wèi)生標準》具體要求。

3 結論

以新鮮馬鈴薯（青薯9號）為原料，利用紅茶菌中豐富的酵母菌、醋酸菌、乳酸菌組成的共生菌系對馬鈴薯糖化汁進行發(fā)酵，制備馬鈴薯醋。馬鈴薯醋的最優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵液初始糖度19%，紅茶菌接種量21%，發(fā)酵溫度34℃。在此最優(yōu)發(fā)酵條件下，陳釀前馬鈴薯醋中總酸含量為2.48 g/100 mL，較優(yōu)化前提高20.4%。經(jīng)陳釀后總酸可達3.60 g/100 mL，馬鈴薯醋澄清透亮，無沉淀，無浮膜；呈淺黃色；醋香香味協(xié)調；酸中帶甜，無不良氣味。微生物指標和理化指標均符合相關標準要求。