韓 麗，李 磊，曾 毅，楊源源，儲(chǔ)鎮(zhèn)江，何培新，2

（1.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品生產(chǎn)與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，河南 鄭州 450002）

酯酶（esterase）是指能夠催化水解羧酸酯的所有酶的總稱(chēng)，是目前較常見(jiàn)的生物催化劑之一[1]，其廣泛存在于動(dòng)植物和微生物中，尤其在微生物中種類(lèi)最多[2-3]。微生物酯酶在細(xì)菌中分布最多，其廣泛存在于包括金黃葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、鏈球菌（Streptococcus）、芽孢桿菌（Bacillus）和結(jié)核桿菌（Mycobacterium tuberculosis）等多種細(xì)菌中。

酯酶作為重要的生物催化劑，其催化的反應(yīng)具有較高的底物專(zhuān)一性、區(qū)域選擇性和對(duì)應(yīng)選擇性[4]，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品、化工、環(huán)保等領(lǐng)域，尤其在白酒釀造業(yè)。隨著工業(yè)的發(fā)展，人們對(duì)酯酶的要求越來(lái)越高，因此，選育性質(zhì)特殊、催化活性高的酯酶成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)[5-8]。目前，研究學(xué)者主要從土壤、海洋樣品中篩選產(chǎn)酯酶細(xì)菌，為了獲得催化性能優(yōu)良、耐極寒或酷熱的酯酶，研究學(xué)者多在高山、極地、深?；蛘呋鹕娇谶M(jìn)行取樣，篩選產(chǎn)酯酶細(xì)菌[9]。鄭鴻飛等[10]從青島前海和膠州灣地區(qū)分離出一株酶活力和穩(wěn)定性較高的菌株EB-1，被鑒定為枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的亞種；王文文等[11]從自然發(fā)酵的黃皮果汁中分離出一株細(xì)菌C10，其產(chǎn)生的酯酶最適pH值為9.0、最適溫度為60℃；盛小禹等[12]從溫泉中分離得到一株的棲熱菌（Thermurs sp.）FD3041，其產(chǎn)酯酶FD2TAP的最適溫度為70℃，且在95℃處理60 min后仍然有75%的活性；ZAPPA S等[13]從火山中分離到一株異養(yǎng)古細(xì)菌Pyrococcusabyssi，其培養(yǎng)溫度為100℃，從中分離得到的胞內(nèi)堿性磷酸酯酶最適溫度為70℃。

現(xiàn)有的報(bào)道中多從富含油脂的土壤中篩選能夠產(chǎn)酯酶的真菌或細(xì)菌[14-16]，而鮮有從窖泥中篩選產(chǎn)酯酶菌株的報(bào)道。本研究從白酒窖泥中篩選出一株高產(chǎn)酯酶的菌株，對(duì)其進(jìn)行形態(tài)觀察和分子生物學(xué)鑒定，并對(duì)其產(chǎn)生的酯酶進(jìn)行純化和酶學(xué)性質(zhì)分析，以期對(duì)窖泥的改良與優(yōu)化提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

窖泥：采集于河南周口宋河酒廠。

1.1.2 試劑

酵母粉、胰蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉（均為生化試劑）：北京索萊寶科技有限公司；氯化鈉、聚乙烯醇、三丁酸甘油酯、羅丹明B（均為分析純）、細(xì)菌基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒、DNA聚合酶、2000Maker：上海生工生物工程有限公司；硫酸銨、硝酸銨、磷酸氫二鉀、氯化鈉、七水硫酸鎂、七水硫酸亞鐵（均為分析純）：天津市永達(dá)化學(xué)試劑有限公司；丁酸酯、己酸酯、辛酸酯、癸酸酯、十二烷酸酯、十四烷酸酯、十六烷酸酯（均為分析純）：上海麥克林生化科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

三丁酸甘油酯乳化液：稱(chēng)取3 g聚乙烯醇于80 mL蒸餾水中，沸水浴加熱、攪拌，直至全部溶解，冷卻后用蒸餾水定容至100 mL。采用3.0%的聚乙烯醇溶液制備含100 g/L三丁酸甘油酯的乳液，超聲波處理（功率40%，破碎5 s停3 s，總時(shí)間15 min），得到的乳化液為乳白色黏稠狀液體。

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L，pH 7.0。121℃高壓滅菌20 min。固體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉20 g/L。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏3 g/L、蛋白胨5 g/L、葡萄糖5 g/L、NaCl 5 g/L、pH 7.0。121℃高壓滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、氯化鈉10 g/L、pH 7.0。121℃高壓滅菌20 min。

富集培養(yǎng)基：三丁酸甘油酯乳化液12 mL、酵母粉0.2 g/L、磷酸氫二鈉3.5 g/L、磷酸氫二鉀1.5 g/L、微量金屬離子，pH 7.5。121℃高壓滅菌20 min。

三丁酸甘油酯固體培養(yǎng)基：硫酸銨0.5 g/L、硝酸銨0.1 g/L、磷酸氫二鉀1 g/L、氯化鈉1 g/L、七水硫酸鎂0.5 g/L、七水硫酸亞鐵0.1 g/L、酵母粉3 g/L、蛋白胨3 g/L，三丁酸甘油酯乳化液12 mL、瓊脂粉20 g，pH 7.0。121℃高壓滅菌25 min。

篩選培養(yǎng)基：于三丁酸甘油酯固體培養(yǎng)基中加入2 mL 0.5%羅丹明B溶液，蒸餾水定容至1 L，于121℃高壓滅菌25 min。

1.2 儀器與設(shè)備

DH-600A電熱恒溫培養(yǎng)箱：北京中興偉業(yè)儀器有限公司；SW-CJ-2D雙人超凈工作臺(tái)：蘇州凈化設(shè)備有限公司；DMEX30生物顯微鏡：寧波舜宇儀器有限公司；FORMA-86C超低溫冰箱：鄭州金友寧儀器有限公司；ZWY-100H搖床：上海智誠(chéng)分析儀器制造有限公司；AE224分析天平：北京賽多利斯天平有限公司；TGL-16G離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；SC-15恒溫水浴鍋、SCIENTZ-10N真空冷凍干燥機(jī)：寧波新芝生物科技有限公司；DYCZ-24KF四板垂直電泳儀：北京六一生物科技有限公司；C1000聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀：美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)酯酶菌株的初篩

稱(chēng)取5 g窖泥樣品于100 mL無(wú)菌生理鹽水中，充分混勻后按1%（V/V）的接種量接種于富集培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)2 d。將富集液進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?0-1～10-6），每個(gè)梯度涂布于兩個(gè)三丁酸甘油酯平板，每塊平板涂布200μL，30℃倒置培養(yǎng)2 d至長(zhǎng)出單菌落。挑取產(chǎn)生透明圈的單菌落點(diǎn)樣于篩選培養(yǎng)基平板上，30℃培養(yǎng)2 d，觀察透明圈，以菌落直徑和水解圈直徑的比值作為初篩依據(jù)，篩選比值較大的菌落于LB固體培養(yǎng)基上分離純化。將得到的產(chǎn)酯酶細(xì)菌接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)24 h后，保存于甘油中。

1.3.2 產(chǎn)酯酶細(xì)菌的復(fù)篩

將初篩得到的菌株接種于種子培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)24 h。按1%的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)48 h。取發(fā)酵液1 mL，8 000 r/min、4℃條件下離心10 min，即為粗酶液，通過(guò)測(cè)定酯酶酶活對(duì)菌株進(jìn)行復(fù)篩。

酯酶酶活的測(cè)定[17]：采用棕櫚酸對(duì)硝基苯酯（p-nitrophenylpalmitate，pPNP）法測(cè)定酯酶活力。反應(yīng)體系中加入粗酶液15μL、pPNP（10 mmol/L）35μL、Tris-HCl（0.1 mol/L，pH=8.0）200μL，40℃水浴10 min，在波長(zhǎng)410 nm處測(cè)定吸光度值。酯酶活力單位定義：在pH=8.0、40℃條件下，每分鐘水解產(chǎn)生1μmol的pNP所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位（U）。

1.3.3 產(chǎn)酯酶細(xì)菌的鑒定

形態(tài)觀察：將目標(biāo)菌株劃線于LB固體平板，30℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌株的菌落形態(tài)；參考國(guó)標(biāo)GB 4789.28—2013《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)培養(yǎng)基和試劑的質(zhì)量要求》對(duì)目標(biāo)菌株進(jìn)行革蘭氏染色并鏡檢。

分子生物學(xué)鑒定：采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取目的菌株的基因組DNA，以其作為模板，使用引物27F（5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：DNA模板2 μL，10×PCR buffer（MgCl2）4 μL，2.5 mmol/L脫氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleoside triphosphate，dNTP）mix 3.2μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.8μL，pfu DNA聚合酶（2.5 U/mL）0.8μL，雙蒸水（ddH2O）補(bǔ)足至40μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物并送至蘇州金唯智生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果提交至美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心（national center for biotechnology information，NCBI）的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast同源性比對(duì)。選取同源性較高的模式菌株的16S rDNA序列，采用Mega 5.0軟件中的鄰接（neighbor joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育。

1.3.4 酯酶的純化

將目標(biāo)細(xì)菌劃線于LB固體培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)24 h。挑取單菌落接種于50 mL種子培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min條件下培養(yǎng)48 h。按照1%的接種量將種子液接種于1 L發(fā)酵培養(yǎng)基中，30℃、180 r/min培養(yǎng)48 h，8 000 r/min、4℃條件下離心20 min，取上清液備用。

由分級(jí)沉淀得到純化酯酶的最佳硫酸銨飽和度為60%。向上清液中緩慢加入硫酸銨沉淀，使其飽和濃度達(dá)到60%，4℃過(guò)夜，5 000 r/min、4℃離心10 min，即可得到蛋白沉淀。將得到的蛋白沉淀溶于Tris-HCl（0.1 mol/L，pH=8.0）中，移入透析袋（截留分子質(zhì)量：8 000～14 000 Da）中，透析液為T(mén)ris-HCl（0.1 mol/L，pH=8.0）。每隔4 h換一次透析液，直至硫酸銨沉淀完全去除。取一定量的透析液，加入高濃度的硫酸鋇溶液，如無(wú)白色沉淀生成表明硫酸銨已透析完全。透析液5 000 r/min、4℃離心10 min，去除未溶沉淀，然后用液氮速凍，冷凍干燥機(jī)過(guò)夜[18]。將凍干的酶粉溶解于Tris-HCl（0.1 mol/L，pH=8.0）中，即可得到粗純化的酶液。酶液經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）檢測(cè)。

1.3.5 酯酶酶學(xué)性質(zhì)研究

最適溫度及溫度穩(wěn)定性：將純化的酶液分別在不同溫度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）條件下孵育10 min，測(cè)定酶活，確定酯酶的最適溫度。在pH=8.0的條件下，純化的酶液在不同溫度（20℃、30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃）條件下孵育30 min，測(cè)定殘余的酶活力來(lái)分析酯酶的溫度穩(wěn)定性。

最適pH及pH穩(wěn)定性：將反應(yīng)體系的pH調(diào)整至5.0～10.0，測(cè)定酯酶在不同pH值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）條件下的酶活，確定酯酶的最適pH。酶液在不同pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0）的緩沖溶液中40℃孵育30 min，測(cè)定殘余的酶活力來(lái)分析酯酶的pH穩(wěn)定性。

底物鏈長(zhǎng)的選擇性：反應(yīng)體系中添加不同碳鏈長(zhǎng)的對(duì)硝基苯酚脂肪酸酯乙醇溶液（10 mmol/L），包括對(duì)丁酸酯、己酸酯、辛酸酯、癸酸酯、十二烷酸酯、十四烷酸酯、十六烷酸酯。在相同的體系下測(cè)定酯酶對(duì)不同底物的水解酶活。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)酯酶菌株的篩選結(jié)果

經(jīng)過(guò)初篩與復(fù)篩從宋河酒廠窖泥中共篩選出20株產(chǎn)酯酶的細(xì)菌，將其編號(hào)為SH-1～SH-20。20株細(xì)菌在三丁酸甘油酯平板上形成的透明圈直徑如表1所示，酯酶酶活如表2所示。

表1 20株產(chǎn)酯酶細(xì)菌在三丁酸甘油酯平板的透明圈直徑Table 1 Transparent circle diameter of 20 esterase-producing bacteria on tributyrin plates

由表1可知，從窖泥中分離出的20株菌株中，14株菌株在三丁酸甘油酯平板上產(chǎn)生的透明圈直徑≥5 mm，占窖泥樣品中分離菌株總數(shù)的70%；3株菌株（SH-17、SH-1和SH-18）的透明圈直徑達(dá)＞7 mm，其中菌株SH-17的透明圈直徑最大，為7.56 mm。

表2 20株產(chǎn)酯酶細(xì)菌的酯酶活力測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of esterase activity of 20 esterase-producing bacteria

由表2可知，pPNP法測(cè)定酶活力復(fù)篩結(jié)果與三丁酸甘油酯平板法初篩結(jié)果一致。20株菌株中4株菌株的酶活力＞2 U/mL，占篩選菌株的25%，其中菌株SH-17的酯酶活力最高，為2.83 U/mg。因次，選取菌株SH-17進(jìn)行鑒定。

2.2 菌株SH-17的鑒定結(jié)果

菌株SH-17在LB固體平板上的菌落形態(tài)、革蘭氏染色結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，菌株SH-17的菌落呈淡黃色、光滑、圓潤(rùn)、圓形，為革蘭氏陰性菌。

圖1 菌株SH-17的菌落形態(tài)（A）和革蘭氏染色結(jié)果（B）Fig.1 Colony morphology(A)and gram staining result(B)of strain SH-17

菌株SH-17的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知，菌株SH-17的16S rDNA序列堿基長(zhǎng)度在1 450 bp左右，與預(yù)期結(jié)果相符，進(jìn)行測(cè)序。將菌株SH-17的16S rDNA測(cè)序結(jié)果進(jìn)行Blast比對(duì)，采用Mega5.0軟件的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，如圖3所示。

圖2 菌株SH-17的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.2 Agarose gel electrophoresis of 16S rDNA PCR amplification product of strain SH-17

圖3 基于16S rDNA序列菌株SH-17的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain SH-17 based on 16S rDNA sequences

由圖3可知，菌株SH-17與約氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter johnsonii）有最高相似度，同源性達(dá)到98.57%。結(jié)合形態(tài)學(xué)特征及革蘭氏染色結(jié)果，鑒定菌株SH-17為約氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter johnsonii）。

2.3 酯酶的純化結(jié)果

采用飽和度60%的硫酸銨對(duì)酯酶進(jìn)行純化后，蛋白回收率為（42.19±0.36）%，酶活力回收率為（78.29±0.59）%，純化倍數(shù)為（1.68±0.11）倍。將經(jīng)過(guò)硫酸銨沉淀和冷凍干燥后的酶粉溶于Tris-HCl（0.1 mol/L，pH=8.0）中，進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，純化的蛋白條帶單一且較清晰，其分子質(zhì)量約為42 kDa。

圖4 純化蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果Fig.4 Polyacrylamide gel electrophoresis results of purified protein

2.4 酯酶酶學(xué)性質(zhì)的研究

2.4.1 酯酶的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

在20～80℃的溫度范圍內(nèi)，酯酶活力隨溫度的變化情況如圖5所示。由圖5可知，菌株SH-17所產(chǎn)酯酶在20～80℃的溫度范圍內(nèi)均有活性，且隨著溫度的升高酶活性呈先升高后降低的趨勢(shì)。當(dāng)溫度為40℃時(shí)，酶活力最高，因此，該酯酶的最適反應(yīng)溫度為40℃。

圖5 溫度對(duì)酯酶酶活的影響Fig.5 Effect of temperature on esterase activity

酯酶經(jīng)不同溫度（20～80℃）熱處理30 min后，酯酶活力變化結(jié)果如6所示。由圖6可知，酯酶經(jīng)20～40℃處理30 min仍有90%以上的酶活力，而溫度高于40℃之后處理30 min后，酶活不斷降低，當(dāng)溫度高于60℃之后，相對(duì)酶活僅為10%，此時(shí)的酯酶已喪失大部分活性，說(shuō)明該酯酶耐高溫性能較差。

圖6 酯酶的溫度穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果Fig.6 Determination results of temperature stability of esterase

2.4.2 酯酶的最適pH值及pH穩(wěn)定性

40℃條件下菌株SH-17所產(chǎn)酯酶在pH值為5～10條件下酶活力變化如圖7所示。由圖7可知，菌株SH-17所產(chǎn)酯酶在pH值為5和6時(shí)基本無(wú)催化活性，當(dāng)pH＞6之后，酶的催化活性隨pH值增加而升高，當(dāng)pH=8時(shí)，達(dá)到最高催化活性，隨后酯酶的催化活性不斷降低，但在pH=10時(shí)該酶仍有20%的催化活性，說(shuō)明該酶是一種弱堿性酯酶，其最適反應(yīng)pH值為8。

圖7 pH值對(duì)酯酶酶活的影響Fig.7 Effect of pH on esterase activity

圖8 酯酶的pH值穩(wěn)定性測(cè)定結(jié)果Fig.8 Determination results of pH value stability of esterase

酯酶在40℃條件下經(jīng)不同pH（5～10）處理30 min后，酯酶活力變化結(jié)果如8所示。由圖8可知，酯酶經(jīng)過(guò)不同pH處理30 min，在pH7.0～9.0的范圍內(nèi)，其活力保持在60%以上；而在pH＜7.0或pH＞9.0的條件下，其酶活穩(wěn)定性變低。結(jié)果表明，該酯酶在中性偏堿的環(huán)境中相對(duì)穩(wěn)定。

2.4.3 底物碳鏈長(zhǎng)的選擇性

以C4～C16相應(yīng)的酯為底物測(cè)定菌株SH-17所產(chǎn)酯酶在40℃、pH=8.0條件下對(duì)不同底物的水解酶活，結(jié)果如圖9所示。由圖9可知，該酯酶對(duì)6個(gè)碳的底物催化活性最高，對(duì)于碳鏈長(zhǎng)＞12的底物催化活性較低。結(jié)果表明，該酯酶對(duì)鏈長(zhǎng)較短的底物催化活性較高，最適反應(yīng)底物碳鏈長(zhǎng)為6。推測(cè)該酯酶作用于酯化反應(yīng)時(shí)可能對(duì)乙酸、己酸等短鏈酸有較高的催化活性，在白酒發(fā)酵過(guò)程中可以增加白酒中乙酸乙酯、己酸乙酯等香味成分[19-20]，對(duì)豐富白酒風(fēng)味具有一定意義且對(duì)窖泥的評(píng)估和改良也有一定的參考價(jià)值。

圖9 酯酶對(duì)不同鏈長(zhǎng)底物的水解活力Fig.9 Hydrolytic activity of esterase on substrates with different chain length

3 結(jié)論

本研究從白酒窖泥中共篩選出20株產(chǎn)酯酶菌株，其中菌株SH-17的酯酶活力最高，為2.83 U/mL。經(jīng)形態(tài)觀察和分子生物學(xué)技術(shù)鑒定其為約氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter johnsonii）。經(jīng)飽和度60%的硫酸銨鹽析得到該酯酶分子質(zhì)量約為42 kDa，最適反應(yīng)溫度為40℃、最適pH值為8.0，高溫耐受性差，在中性偏堿的環(huán)境中相對(duì)穩(wěn)定，且對(duì)碳鏈長(zhǎng)較短的底物催化活性較高，最適反應(yīng)底物碳鏈長(zhǎng)為6。