楊 爽，王曉倩，單 靜，姜竹茂*，徐 舸

（煙臺(tái)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，山東 煙臺(tái) 264005）

慈梨（Pyrus pyrifolia）因其原產(chǎn)地在山東省萊陽市又名萊陽梨，其肉質(zhì)清脆香甜，富含還原糖和微量元素，是人們喜食的一種水果[1]?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明[2]，梨有緩解鉛中毒的功效。

炭燒酸奶又稱褐色酸奶，是近幾年新興的酸奶品種，與傳統(tǒng)酸奶相比，炭燒酸奶的色澤和風(fēng)味主要源自美拉德反應(yīng)。原料乳在高溫條件下處理一定時(shí)間，乳中的蛋白質(zhì)和還原糖（乳糖或其他外源性單糖）之間發(fā)生羰氨反應(yīng)，生成種類繁多的小分子揮發(fā)性化合物和大分子褐色產(chǎn)物，使其具有特殊的焦糖氣味和褐色色澤[3-4]。褐色酸奶作為一種新型的酸奶飲品，深受消費(fèi)者的喜愛，但目前國內(nèi)外缺少對(duì)其系統(tǒng)地研究。韓千慧等[5]對(duì)褐色酸奶的品質(zhì)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)與普通酸奶相比，褐色酸奶具有酸味弱，硬度、稠度、凝聚性、表觀黏度和黏度均顯著偏小的特點(diǎn)。張俊山[6]以葡萄糖、果糖、果葡糖漿作為篩選的還原糖，分別與牛奶在不同的溫度和添加量的條件下進(jìn)行褐變反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)葡萄糖的褐變反應(yīng)較好。張晟等[7]通過在原料奶中添加葡萄糖，以及經(jīng)高溫（97.3℃）加熱一定時(shí)間（4.1 h）后，可加工出消費(fèi)者可接受顏色和風(fēng)味的褐色酸奶，與普通酸奶相比，加熱后，有害物質(zhì)5-羥甲基糠醛增大，但仍在安全限量范圍，有效賴氨酸和蛋白質(zhì)消化率均下降，但顯著提升了風(fēng)味。其他指標(biāo)則無顯著變化。目前具有果汁添加的褐色酸奶鮮有研究。本研究以慈梨濃縮汁和脫脂奶粉為原料研制炭燒慈梨飲用型酸奶，利用慈梨濃縮汁中的還原糖和脫脂乳中的蛋白質(zhì)發(fā)生美拉德反應(yīng)，并添加低聚果糖增強(qiáng)其保健功能和口感，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法確定產(chǎn)品的最佳工藝，研制一種既有慈梨香氣又有炭燒風(fēng)味的新型酸奶，不僅可以豐富酸奶的營養(yǎng)成分，為慈梨的深加工提供新的途徑，還能為中國乳制品市場(chǎng)的發(fā)展提供新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料和菌株

脫脂奶粉（水分3.8%，蛋白質(zhì)32.9%）：新西蘭恒天然集團(tuán)；慈梨濃縮汁（還原糖含量59.57 g/100 g）：山東一品堂實(shí)業(yè)有限公司；低聚果糖：云浮市新金山生物科技有限公司；保加利亞乳桿菌（Lactobacillus bulgaricus）、嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophiles）：河北一然生物科技有限公司。

1.1.2 化學(xué)試劑

鹽酸、硫酸銅、亞甲藍(lán)、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、乙酸鋅、冰乙酸、亞鐵氰化鉀（均為分析純）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WT型電子天平：杭州萬特衡器有限公司；FA1004型電子天平、NDJ-5S數(shù)顯黏度計(jì)：上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；PHS-3E型酸度計(jì)：上海雷磁儀器廠；DNP-9082型電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；EM-30型磁力攪拌水浴鍋：常州市人和儀器廠；NH300高品質(zhì)便攜式電腦色差儀：深圳市三恩時(shí)科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 炭燒慈梨酸奶加工工藝流程

1.3.2 炭燒慈梨酸奶工藝操作要點(diǎn)

復(fù)原脫脂乳制備：將脫脂奶粉加入65℃純凈水中充分溶解，復(fù)原脫脂乳固形物含量為12%，添加慈梨濃縮汁。

均質(zhì)：在溫度為60～65℃，壓力為20 MPa條件下對(duì)復(fù)原脫脂乳進(jìn)行均質(zhì)。褐變處理：將復(fù)原乳放入98℃[8]的水浴中褐變處理。冷卻、添加低聚果糖：定量稱取低聚果糖，添加到冷卻至40℃的復(fù)原脫脂乳中，充分?jǐn)嚢枞芙狻?/p>

接種發(fā)酵：將保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌（1∶1）混合菌種，接種于上述復(fù)原脫脂乳中，充分?jǐn)嚢韬螅?2℃條件下發(fā)酵。

終止發(fā)酵：當(dāng)pH下降至4.5～4.6時(shí)終止發(fā)酵。

冷藏后熟：將發(fā)酵結(jié)束后酸奶置于4℃冰箱中靜置12～24 h后熟，即得炭燒慈酸奶。

1.3.3 炭燒慈梨酸奶工藝優(yōu)化

（1）發(fā)酵條件優(yōu)化單因素試驗(yàn)：設(shè)置慈梨濃縮汁添加量分別為5.5%、6.0%、6.5%、7.0%、7.5%、8.0%，褐變時(shí)間分別為90 min、105 min、120 min、135 min、150 min，接種量分別為1%、2%、3%、4%、5%、6%，發(fā)酵時(shí)間分別為6.0 h、6.5 h、7.0 h、7.5 h、8.0 h、8.5 h，低聚果糖添加量分別為0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%、2.4%，采用單一變量的方法，考察各因素對(duì)炭燒慈梨酸奶的感官品質(zhì)的影響。

（2）發(fā)酵條件優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)：在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理[9-11]，選擇接種量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、低聚果糖添加量（C）為影響因素，以感官評(píng)分（Y）作為響應(yīng)值，利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，從而確定最優(yōu)的炭燒慈梨酸奶發(fā)酵工藝，試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 炭燒慈梨酸奶發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素與水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken experiments design for charcoal Cipear yogurt fermentation conditions optimization

1.3.5 炭燒慈梨飲用型酸奶的評(píng)測(cè)方法[12]

（1）感官評(píng)測(cè)：隨機(jī)選定10名（男女各半）有經(jīng)驗(yàn)的品評(píng)員組成的感官評(píng)分小組，根據(jù)產(chǎn)品香味、組織狀態(tài)、滋味和口感4項(xiàng)指標(biāo)對(duì)炭燒慈梨酸奶進(jìn)行感官評(píng)價(jià)，采用加權(quán)平均法對(duì)產(chǎn)品的感官品質(zhì)進(jìn)行綜合評(píng)定，感官評(píng)分滿分為100分，各項(xiàng)指標(biāo)所占分值及評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 炭燒慈梨酸奶感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of charcoal Cipear yogurt

（2）指標(biāo)測(cè)定

色差分析：采用色差計(jì)定量測(cè)定顏色的變化。用標(biāo)準(zhǔn)白板對(duì)色差計(jì)進(jìn)行校準(zhǔn)后，在比色皿內(nèi)取適量的褐變后的原料乳，在同樣的光源下測(cè)量樣品的L*值、a*值、b*值，每個(gè)樣品測(cè)定3次，取平均值。其中L*值為亮度、a*值為紅/綠、b*值為黃/藍(lán)，最后計(jì)算色差ΔE*值[13]。酸度：根據(jù)GB 5009.239—2016《食品中酸度的測(cè)定》中的酚酞指示劑法[14]；蛋白質(zhì)含量：根據(jù)GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法[15]；脂肪含量：根據(jù)GB5009.6—2016《食品中脂肪的測(cè)定》中的蓋勃氏法[16]；黏度：采用黏度計(jì)測(cè)定；微生物：根據(jù)GB 4789.18—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)》[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 慈梨濃縮汁添加量對(duì)炭燒慈梨酸奶感官評(píng)分及酸度的影響

圖1 慈梨濃縮汁添加量對(duì)炭燒慈梨酸奶感官品質(zhì)及酸度的影響Fig.1 Effect of Cipear concentrate juice addition on sensory quality and acidity of charcoal Cipear yogurt

由圖1可知，慈梨濃縮汁添加量＜6.5%之前，酸奶的顏色變化不明顯，原因是慈梨濃縮汁添加量較低時(shí)，其還原糖含量較低，美拉德反應(yīng)不明顯[18]。當(dāng)慈梨濃縮汁添加量＞6.5%之后，隨著慈梨濃縮汁添加量增加，感官評(píng)分降低。原因是隨著慈梨濃縮汁添加量的增加，褐變顏色不斷加深，且酸奶組織狀態(tài)不穩(wěn)定，由于蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)附近時(shí)，分子之間缺乏靜電排斥力，不利于形成穩(wěn)定的乳狀液[19-20]。因而確定慈梨濃縮汁的添加量為6.5%，此時(shí)得到的酸奶褐變顏色適中，組織狀態(tài)均勻穩(wěn)定，且有濃郁的慈梨風(fēng)味，感官評(píng)分為92.1分。

2.1.2 褐變時(shí)間對(duì)炭燒慈梨酸奶感官評(píng)分及色差的影響

不同復(fù)原脫脂乳褐變時(shí)間對(duì)炭燒慈梨酸奶感官評(píng)分和酸奶色度的影響結(jié)果見表3。由表3可知，隨著褐變時(shí)間的增加，原料乳的L*值逐漸降低，原料乳的顏色逐漸加深；a*值逐漸上升，紅色越來越明顯；b*值到105 min時(shí)基本保持不變，表明隨著褐變時(shí)間的增加，黃藍(lán)值變化不大?？偵钤诤肿?0 min后有較明顯的變化，色澤變化可以由肉眼直接觀察到，每15 min后測(cè)一次色差，得知在120 min時(shí)色差較大，其余每15 min測(cè)得的奶液沒有明顯的顏色變化。感官評(píng)分隨著褐變時(shí)間的增加，呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在褐變時(shí)間為120 min時(shí)，感官評(píng)分最高，為92.13分。因此，最佳褐變時(shí)間為120 min。

表3 褐變時(shí)間對(duì)炭燒慈梨酸奶顏色及感官品質(zhì)的影響Table 3 Effect of browning time on color and sensory quality of charcoal Cipear yogurt

2.1.3 接種量對(duì)炭燒慈梨酸奶感官評(píng)分及酸度的影響

圖2 接種量對(duì)炭燒慈梨酸奶感官評(píng)分及酸度的影響Fig.2 Effect of inoculum on sensory evaluation and acidity of charcoal Cipear yogurt

由圖2可知，當(dāng)接種量為3%時(shí)，感官評(píng)分最高，為88.2分。當(dāng)接種量＜3%之前，由于酸奶中菌種的數(shù)量少，一定的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)產(chǎn)酸不足，導(dǎo)致酸奶凝乳不均勻，口感較差。當(dāng)接種量＞3%之后，隨著接種量不斷增加，酸奶中活菌數(shù)不斷增加，產(chǎn)酸增多，凝乳狀態(tài)逐漸變好。但當(dāng)接種量過高時(shí)，產(chǎn)酸過多，導(dǎo)致酸奶中微小蛋白質(zhì)亞膠分子團(tuán)穩(wěn)定狀態(tài)被改變，不易形成穩(wěn)定的乳狀液[19]。因此，最佳接種量為3%，此時(shí)酸奶的凝乳狀態(tài)較好、口感細(xì)膩，且酸甜適中。

2.1.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)炭燒慈梨酸奶感官評(píng)分及酸度的影響

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)炭燒慈梨酸奶感官評(píng)分及酸度的影響Fig.3 Effect of fermentation time on sensory evaluation and acidity of charcoal Cipear yogurt

由圖3可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為7.0 h，酸奶的感官評(píng)分最高，為88.7分，此時(shí)，炭燒慈梨飲用型酸奶凝乳均勻，且酸奶質(zhì)地細(xì)膩，口感較好。發(fā)酵時(shí)間＜7.0 h之前，發(fā)酵的酸奶由于發(fā)酵時(shí)間短，菌種產(chǎn)酸不足，導(dǎo)致酸奶較稀，凝乳不好。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，酸奶的酸度升高，酸奶中原有的聚集體發(fā)生改變，最終形成以酪蛋白膠粒為基礎(chǔ)的凝膠狀態(tài)[20]。發(fā)酵時(shí)間＞7.0 h之后，發(fā)酵酸奶由于發(fā)酵時(shí)間過長，產(chǎn)酸過多，導(dǎo)致酸奶的組織狀態(tài)不好，并且出現(xiàn)了凝塊的現(xiàn)象。因此，確定酸奶的發(fā)酵時(shí)間為7.0 h。

2.1.5 低聚果糖添加量對(duì)炭燒慈梨酸奶感官評(píng)分及酸度的影響

圖4 低聚果糖添加量對(duì)炭燒慈梨酸奶感官評(píng)分及酸度的影響Fig.4 Effect of fructo-oligosaccharide addition on sensory evaluation and acidity of charcoal Cipear yogurt

由圖4可知，當(dāng)?shù)途酃翘砑恿繛?.2%時(shí)，酸奶的感官評(píng)分最高，為88.3分。此時(shí)，酸奶的凝結(jié)度適中，甜度適宜，且口感順滑適口。當(dāng)?shù)途酃堑奶砑恿浚?.2%之前，酸奶的凝結(jié)度較低，且甜度較低。當(dāng)?shù)途酃堑奶砑恿浚?.2%之后，酸奶過于黏稠，且甜度過高。因此，最佳低聚果糖添加量為1.2%。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以接種量（A）、發(fā)酵時(shí)間（B）、低聚果糖添加量（C）為影響因素，以感官評(píng)分（Y）作為響應(yīng)值，利用Design-Expert8.0.6軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，從而確定炭燒慈梨酸奶的最優(yōu)工藝。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表4，方差分析見表5。

表4 炭燒慈梨酸奶發(fā)酵條件優(yōu)化Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 4 Design and results of Box-Behnken experiments for charcoal Cipear yogurt fermentation conditions optimization

表5 回歸模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model

利用Design Expert8.06軟件對(duì)表4結(jié)果進(jìn)行回歸方程擬合，得到炭燒慈梨酸奶的響應(yīng)面回歸方程：Y=88.19+7.93A+4.02B-1.82C-3.04AB-1.15AC+3.98BC-8.80A2-1.46B2-8.42C2。

由表5可知，當(dāng)模型F=33.88時(shí)，P＜0.000 1，說明該模型是極顯著的，當(dāng)失擬項(xiàng)F=4.31時(shí)，P=0.096 1＞0.05，說明模型的失擬項(xiàng)不顯著。決定系數(shù)R2=0.977 6，校正決定系數(shù)R2Adj=0.948 7，表示感官評(píng)分的實(shí)際值和預(yù)測(cè)值之間有較好的擬合度，因而證明該模型能夠很好的對(duì)炭燒慈梨酸奶工藝進(jìn)行分析和預(yù)測(cè)。該模型中的一次項(xiàng)A、B，交互項(xiàng)AB、BC與二次項(xiàng)A2、C2對(duì)結(jié)果影響極顯著（P＜0.01），一次項(xiàng)C對(duì)結(jié)果影響顯著（P＜0.05），其他項(xiàng)對(duì)結(jié)果影響不顯著（P＞0.05）。影響炭燒慈梨酸奶品質(zhì)的主次順序?yàn)榻臃N量＞發(fā)酵時(shí)間＞低聚果糖添加量。

利用Design-Expert軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行運(yùn)算，分別做出兩個(gè)交互項(xiàng)之間的響應(yīng)面及等高線，結(jié)果見圖5。由圖5可知，接種量和發(fā)酵時(shí)間交互作用對(duì)感官評(píng)分的影響顯著；低聚果糖添加量和接種量交互作用對(duì)感官評(píng)分的影響不顯著；發(fā)酵時(shí)間和低聚果糖添加量對(duì)感官評(píng)分的影響顯著，發(fā)酵時(shí)間為6～7.21 h時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，感官評(píng)分快速增長，但當(dāng)發(fā)酵時(shí)間過長時(shí)，菌種產(chǎn)酸過多導(dǎo)致酸奶黏度增大，進(jìn)而影響炭燒慈梨酸奶的口感和質(zhì)地，低聚果糖添加量為0.80%～0.98%時(shí)，隨著添加量的增加，感官評(píng)分迅速增加，但當(dāng)?shù)途酃翘砑恿窟^多時(shí)，酸奶過于黏稠，炭燒慈梨酸奶感官評(píng)分降低。

通過Design-Expert軟件對(duì)已建立的回歸方程進(jìn)行優(yōu)化分析，可得到最佳發(fā)酵工藝條件為接種量3%、發(fā)酵時(shí)間7.21 h、低聚果糖添加量0.98%。在此條件下，炭燒慈梨酸奶的感官評(píng)分預(yù)測(cè)值為88.0分。為了便于實(shí)際操作，將工藝條件修正為接種量為3%、發(fā)酵時(shí)間7.5 h、低聚果糖添加量為1%。在此最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，感官評(píng)分實(shí)際值為91.8分，與模型預(yù)測(cè)值（88.0分）較一致，說明該模型可行。

圖5 各因素交互作用對(duì)炭燒慈梨酸奶感官品質(zhì)影響的響應(yīng)面和等高線Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors on sensory quality of charcoal Cipear yogurt

2.3 炭燒慈梨酸奶質(zhì)量評(píng)價(jià)

2.3.1 感官指標(biāo)

炭燒慈梨酸奶組織狀態(tài)良好，具備特有焦糖香氣和慈梨風(fēng)味、酸甜適宜、黏稠度適當(dāng)，具有較好的口感，感官評(píng)分的平均值為91.8分。

2.3.2 理化指標(biāo)

炭燒慈梨酸奶色差為2.19，酸度為84°T，蛋白質(zhì)含量為2.6%，黏度為1 822.67 mPa·s，理化指標(biāo)均符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

2.3.3 微生物指標(biāo)

大腸桿菌含量＜5 MPN/100 mL，活菌數(shù)＞107CFU/mL，致病菌未檢出，微生物指標(biāo)均符合國家相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

以脫脂奶粉、濃縮梨汁為主要原材料，保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌（1∶1）為發(fā)酵劑，添加低聚果糖增強(qiáng)其保健功能和口感。以感官評(píng)價(jià)和色差分析作為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法確定炭燒慈梨飲用型酸奶的工藝。最后，確定了炭燒慈梨飲用型酸奶的最佳工藝條件：褐變條件98℃、120 min，接種量3%，濃縮梨汁的添加量6.5%，發(fā)酵時(shí)間7.5 h、低聚果糖添加量1%。在此優(yōu)化發(fā)酵工藝條件下，炭燒慈梨飲用型酸奶顏色適中，質(zhì)地均勻細(xì)膩，無乳清析出，具備特有焦糖香氣和慈梨風(fēng)味。