楊 野，李佳瑩，張 曼，楊 壯，梁鵬飛，牟建樓*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071000）

納豆是一種傳統(tǒng)的發(fā)酵食品，由納豆芽孢桿菌（Bacillus natto）發(fā)酵而成[1]。其具有獨(dú)特的風(fēng)味和粘性，含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、氨基酸、纖維素、維生素等。它還包括多種功能成分，如納豆激酶、異黃酮、超氧化物歧化酶、磷脂、皂甙、亞油酸和亞麻酸等[2-4]，具有降血壓、抗血栓和抗腫瘤活性的作用[5-6]。到目前為止，關(guān)于納豆的研究，國(guó)外主要集中在菌株的篩選、發(fā)酵條件的優(yōu)化、納豆香氣以及納豆激酶化學(xué)結(jié)構(gòu)和生物活性的改善方面[7-14]。國(guó)內(nèi)主要集中于對(duì)納豆的制作原料[15]、菌種培育[16-17]等方面進(jìn)行較深入的研究。而關(guān)于納豆芽孢桿菌和其他菌種聯(lián)合發(fā)酵納豆，改善納豆風(fēng)味方面的研究較少[18-21]。

與豆腐和豆?jié){等其他大豆食品相比，納豆市場(chǎng)相對(duì)較小。此外，納豆的香氣、味道和質(zhì)地也使它無(wú)法成為一種受歡迎的國(guó)際大豆食品[22]。納豆發(fā)酵過(guò)程由于酶和細(xì)菌的作用，大豆中的蛋白質(zhì)被分解，產(chǎn)生帶有氨腥氣味的堿性化合物，使得納豆氨腥氣味濃郁，不被我國(guó)消費(fèi)者接受。因此，本研究以市售大豆為原料，采用納豆發(fā)酵粉和乳酸菌粉混合發(fā)酵納豆，并以感官評(píng)分、揮發(fā)性鹽基氮含量和納豆激酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)對(duì)納豆發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過(guò)乳酸菌產(chǎn)酸中和納豆發(fā)酵產(chǎn)生的堿性化合物來(lái)減弱納豆的氨腥味（氨腥味以揮發(fā)性鹽基氮含量表示），對(duì)于改善納豆風(fēng)味，并促進(jìn)納豆在我國(guó)的發(fā)展具有一定的意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

黃豆：保定人人超市；納豆發(fā)酵粉和乳酸菌粉：北京川秀科技有限公司；商品納豆（燕京納豆）：保定市保百超市。

1.1.2 主要試劑

三氯乙酸（分析純）：南京邦諾生物科技有限公司；硼酸（分析純）：青島捷世康生物科技有限公司；氧化鎂（分析純）：上海聯(lián)邁生物工程有限公司；F8060福林酚（分析純）：北京索萊寶科技有限公司；酪氨酸（純度≥99%）、干酪素（純度92%）：上海源葉生物科技有限公司；無(wú)水碳酸鈉（分析純）：上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司；磷酸二氫鈉和磷酸二氫鈉（分析純）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙醇（分析純）：南京中淳生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MBMJ-78A高壓蒸汽滅菌鍋：北京東西分析儀器科技有限公司；HH2電熱恒溫水浴鍋、Neofuge 15R高速冷凍離心機(jī)：上海力申科學(xué)儀器有限公司；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海菁華科技儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 納豆發(fā)酵工藝流程及操作要點(diǎn)

挑選→清洗→室溫浸泡→高溫高壓滅菌→冷卻→接種發(fā)酵→后熟→成熟納豆

操作要點(diǎn)：選取無(wú)蟲害、無(wú)霉變、顆粒飽滿的黃豆，用清水清洗并充分浸泡，然后在121℃條件下保持20 min，冷卻至40℃，按照黃豆質(zhì)量加入0.2%的納豆發(fā)酵粉和乳酸菌粉，攪拌均勻，置于恒溫培養(yǎng)箱發(fā)酵24 h，發(fā)酵結(jié)束后于4℃條件下后熟24 h。

1.3.3 納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)

分別研究納豆芽孢桿菌和乳酸菌菌粉比例（1.0∶0、1.0∶1.0、1.0∶1.5、1.0∶2.0、1.0∶4.0、1.0∶6.0）、發(fā)酵溫度（38 ℃、40℃、42℃、44℃、46℃）、發(fā)酵時(shí)間（18 h、21 h、24 h、27 h、30 h）對(duì)揮發(fā)性鹽基氮含量、納豆激酶酶活力和感官評(píng)價(jià)的影響。每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.3.4 納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以菌粉比例（A）、發(fā)酵溫度（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）為考察指標(biāo)，感官評(píng)分（Y1）、揮發(fā)性鹽基氮含量（Y2）和納豆激酶活力（Y3）為評(píng)價(jià)指標(biāo)，選用正交表L9（34）進(jìn)行3因素3水平正交試驗(yàn)，確定納豆發(fā)酵條件的適宜組合。正交試驗(yàn)因素與水平如表1所示。

農(nóng)村基層治理體系和治理制度不健全，決策、議事、協(xié)商、評(píng)估、監(jiān)督、考核程序和機(jī)制不完善，治理制度化建設(shè)滯后；基層治理制度的貫徹落實(shí)不夠，不少制度執(zhí)行難、落實(shí)差，有些制度流于形式，陷入“空轉(zhuǎn)”；制度與制度之間的銜接性、協(xié)調(diào)性和系統(tǒng)性不足，制度之間的張力加大，制度體系的集成性不強(qiáng)，難以形成有效的制度合力。

表1 納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for natto fermentation process optimization

1.3.5 測(cè)定方法

揮發(fā)性鹽基氮：揮發(fā)性鹽基氮可用來(lái)衡量納豆的氨腥氣味，揮發(fā)性鹽基氮含量越少，氨腥氣味越小。參照GB 5009.228—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》進(jìn)行測(cè)定。

感官評(píng)價(jià)：選擇10位經(jīng)過(guò)專業(yè)培訓(xùn)的感官鑒評(píng)人員，采取盲評(píng)模式，從色澤、香氣、口感和組織狀態(tài)4個(gè)方面依次對(duì)納豆進(jìn)行評(píng)分，每位評(píng)價(jià)人員獨(dú)立完成，試驗(yàn)設(shè)計(jì)者不參與評(píng)分。以豆粒金黃有光澤，幾乎無(wú)氨腥味且有淡淡清香味，入口濕潤(rùn)且無(wú)苦澀味，粘液多，拉絲狀態(tài)好為最高分（滿分10分），總分為各項(xiàng)指標(biāo)得分之和。最終取10人評(píng)分的平均值。為保證評(píng)分的準(zhǔn)確性，每個(gè)試驗(yàn)水平之間需用清水漱口，且每?jī)蓚€(gè)試驗(yàn)水平之間需暫停1 min，以避免味覺(jué)疲勞。納豆感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。

表2 納豆感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standard of natto

納豆激酶活力的測(cè)定：參照GB/T 28715—2012《飼料添加劑酸性、中性蛋白酶活力的測(cè)定分光光度法》中的Folin-酚法測(cè)定納豆激酶活力。

1.3.6 統(tǒng)計(jì)分析方法

分別采用SPSS Statistics 17.0和Origin 8.6對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌粉比例對(duì)納豆品質(zhì)的影響

菌粉比例對(duì)納豆品質(zhì)的影響見(jiàn)圖1。由圖1A可知，當(dāng)菌粉比例為1.0∶1.5時(shí)，納豆感官評(píng)分較高（7.6分），僅比最高分（8.0分）低5.0%。此時(shí)，豆粒呈淡黃色，幾乎沒(méi)有氨腥味，粘液豐富，拉絲狀態(tài)良好。由圖1B可知，當(dāng)菌粉比例為1.0∶1.5時(shí)，揮發(fā)性鹽基氮含量達(dá)到最低（12.826 mg/100 g），比單菌發(fā)酵所產(chǎn)生的揮發(fā)性鹽基氮含量降低約58.10%。由圖1C可知，當(dāng)菌粉比例由1.0∶1.0增加至1.0∶4.0時(shí)，納豆激酶活力均比納豆芽孢桿菌單獨(dú)發(fā)酵時(shí)高，其中，在菌粉比例為1.0∶1.5時(shí)，納豆激酶活力達(dá)到最高（393.912 U/g），是納豆芽孢桿菌單獨(dú)發(fā)酵時(shí)活力的1.47倍；當(dāng)菌粉比例為1.0∶6.0時(shí)，納豆激酶活力比單菌發(fā)酵略低。這可能是由于在某個(gè)比例范圍內(nèi)，乳酸菌對(duì)納豆激酶的表達(dá)有促進(jìn)作用。各指標(biāo)的組間差異均顯著（P＜0.05）。綜合上述結(jié)果，當(dāng)菌粉比例為1.0∶1.5時(shí)，納豆激酶活力最高，揮發(fā)性鹽基氮含量最低，感官評(píng)分也相對(duì)較高，所以菌粉比例選擇1.0∶1.5。

圖1 菌粉比例對(duì)感官評(píng)分（A）、揮發(fā)性鹽基氮含量（B）及納豆激酶活力（C）的影響Fig.1 Effect of bacteria powder ratio on sensory score(A)and volatile basic nitrogen content(B)and nattokinase activity(C)

2.2 發(fā)酵溫度對(duì)納豆品質(zhì)的影響

圖2 發(fā)酵溫度對(duì)感官評(píng)分（A）、揮發(fā)性鹽基氮含量（B）及納豆激酶活力（C）的影響Fig.2 Effects of fermentation temperature on sensory score(A),volatile basic nitrogen content(B)and nattokinase activity(C)

2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆品質(zhì)的影響

發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆品質(zhì)的影響見(jiàn)圖3。由圖3可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，納豆的感官評(píng)分和納豆激酶活力均呈先上升后下降的趨勢(shì)，而發(fā)酵產(chǎn)物揮發(fā)性鹽基氮含量越來(lái)越多，氨味也越來(lái)越重。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí)，感官評(píng)分及納豆激酶活力均達(dá)到最大，分別為7.8分、379.404 U/g，揮發(fā)性鹽基氮含量相對(duì)較低，為24.036 mg/100 g。各指標(biāo)的組間差異均顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間過(guò)短時(shí)，納豆芽孢桿菌和乳酸菌可能剛進(jìn)入穩(wěn)定期，發(fā)酵還未到達(dá)最高點(diǎn)；發(fā)酵時(shí)間過(guò)長(zhǎng)時(shí)，外界環(huán)境如pH、氧化還原電勢(shì)等越來(lái)越不適宜，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)減少，菌體進(jìn)入衰亡期，菌體內(nèi)部酶促反應(yīng)速率降低。綜合上述結(jié)果，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為24 h時(shí)，感官評(píng)分和納豆激酶活力都最高，揮發(fā)性鹽基氮含量也相對(duì)較低。所以發(fā)酵時(shí)間選擇24 h。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)感官評(píng)分（A）、揮發(fā)性鹽基氮含量（B）及納豆激酶活力（C）的影響Fig.3 Effects of fermentation time on sensory score(A),volatile basic nitrogen content(B)and nattokinase activity(C)

2.4 納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)

選用正交試驗(yàn)表L9（34）研究菌粉比例（A）、發(fā)酵溫度（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）對(duì)納豆品質(zhì)的影響。正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4～6。

表3 納豆發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果與分析Table 3 Results and analysis of orthogonal tests for natto fermentation process optimization

由表3極差分析可知，考察因素對(duì)3個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的影響主次順序均為A＞C＞B，即菌粉比例＞發(fā)酵時(shí)間＞發(fā)酵溫度。以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，最優(yōu)組合條件為A2B3C2，即菌粉比例1.0∶1.5、發(fā)酵溫度44℃、發(fā)酵時(shí)間24 h；以揮發(fā)性鹽基氮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，最優(yōu)組合條件為A1B2C3，即菌粉比例1.0∶1.0、發(fā)酵溫度42℃、發(fā)酵時(shí)間27 h；以納豆激酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，最優(yōu)組合條件為A2B3C3，即菌粉比例1.0∶1.5、發(fā)酵溫度44℃、發(fā)酵時(shí)間27 h。

由表4方差分析可知，菌粉比例和發(fā)酵時(shí)間對(duì)感官評(píng)分影響均顯著（P＜0.05），發(fā)酵溫度對(duì)納豆感官評(píng)分影響不顯著（P＞0.05）；由于C2與C3無(wú)差異（P＞0.05）。因此，以納豆感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，最優(yōu)組合條件可調(diào)整為A2ByCz（y=1，2，3；z=2，3）。

表4 以感官評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 4 Variance analysis using sensory score as evaluation index

表5 以揮發(fā)性鹽基氮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 5 Variance analysis using volatile basic nitrogen content as evaluation index

由表5方差分析可知，菌粉比例和發(fā)酵時(shí)間對(duì)揮發(fā)性鹽基氮含量的影響均顯著（P＜0.05），發(fā)酵溫度影響不顯著（P＞0.05）；由于A1與A2無(wú)差異，C1與C3無(wú)差異（P＞0.05）。因此，以納豆揮發(fā)性鹽基氮含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，最優(yōu)組合條件可調(diào)為整AxByCz（x=1，2；y=1，2，3；z=1，3）。

表6 以納豆激酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table 6 Variance analysis using nattokinase activity as evaluation index

由表6方差分析可知，菌粉比例、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時(shí)間對(duì)納豆激酶活力影響均不顯著（P＞0.05）。因此，以納豆激酶活力為評(píng)價(jià)指標(biāo)時(shí)，最優(yōu)組合條件可調(diào)整為AxByCz（x=1，2，3；y=1，2，3；z=1，2，3）。

綜合考慮納豆感官評(píng)分、揮發(fā)性鹽基氮含量、納豆激酶活力以及生產(chǎn)成本，本研究確定較適宜的混菌發(fā)酵納豆組合條件為A2B1C3，即菌粉比例1.0∶1.5，發(fā)酵溫度40℃，發(fā)酵時(shí)間27 h。該組合沒(méi)有在正交試驗(yàn)的9個(gè)組合中出現(xiàn)，因此，進(jìn)行3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果表明，在此條件下發(fā)酵得到納豆，其感官評(píng)分9.0分，揮發(fā)性鹽基氮含量為11.022 mg/100 g，納豆激酶活力為438.90 U/g，此時(shí)，納豆色澤鮮亮，氨臭味明顯降低，拉絲狀態(tài)好。

2.5 對(duì)比試驗(yàn)結(jié)果

為檢測(cè)試驗(yàn)效果，從感官評(píng)分、揮發(fā)性鹽基氮含量及納豆激酶活力3個(gè)方面，將混菌發(fā)酵納豆與商品納豆進(jìn)行了對(duì)比，結(jié)果見(jiàn)表7。

表7 混菌發(fā)酵納豆與商品納豆的比較Table 7 Comparison between natto fermented with mixed startersand commercially available natto

由表7可知，混菌發(fā)酵納豆的感官評(píng)分比市售納豆高13.92%，揮發(fā)性鹽基氮含量低28.20%，納豆激酶活力高34.03%。結(jié)果表明，混菌發(fā)酵納豆品質(zhì)明顯優(yōu)于市售納豆。

3 結(jié)論

通過(guò)單因素及正交試驗(yàn)得出，混菌發(fā)酵納豆的最優(yōu)工藝為：菌粉比例（乳酸菌∶納豆芽孢桿菌）1.0∶1.5，發(fā)酵溫度40℃，發(fā)酵時(shí)間27 h。在此優(yōu)化條件下，納豆感官評(píng)分為9.0分，揮發(fā)性鹽基氮含量為11.022 mg/100 g，納豆激酶活力為438.90 U/g。此時(shí)，納豆色澤光亮，氨臭味明顯降低，拉絲狀態(tài)好，納豆品質(zhì)明顯優(yōu)于市售納豆。本試驗(yàn)在保證納豆仍有良好保健功能的基礎(chǔ)上改善了納豆的風(fēng)味，為納豆在我國(guó)的消費(fèi)起到了積極的推動(dòng)作用。