胡鴻雨，孫曉明，袁建鋒*

（浙江師范大學 行知學院，浙江 蘭溪 314100）

吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinine，PQQ）是繼吡啶核苷酸和黃素核苷酸之后，在許多細菌脫氫酶中發(fā)現的第3種氧化還原酶的輔酶。PQQ可作為細菌脫氫酶（醇脫氫酶、醛脫氫酶、D-葡萄糖脫氫酶以及甲氨脫氫酶等）的輔因子，是一種高度可溶及熱穩(wěn)定的化合物，能促進革蘭氏陰性菌周質中醇類和糖類的氧化。X-射線對PQQ結構進行解析顯示[1]，該輔因子3個羧基和2個相鄰醛基的醌類結構，喹啉環(huán)C4和C5位置上的醌在發(fā)生氧化還原反應時，可以被還原為酚，吡咯喹啉醌分子結構及3D立體結構如下：

PQQ廣泛存在于革蘭氏陰性菌及動植物體內，可以影響生物體的生理生化過程。研究表明，PQQ具有以下作用：（1）刺激微生物、人體細胞生長和植物發(fā)育[2-3]；（2）作為動物體的生長因子[4-7]；（3）防治肝損傷[8]；（4）清除自由基，保護機體[9-10]；（5）促進神經生長因子產生[11-12]；（6）信號轉導的調節(jié)與脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）修復功能[13-17]；（7）生物電化學中的應用[18-19]。由此可見，PQQ在醫(yī)藥、化妝品、保健品、環(huán)境和食品領域具有廣泛的應用潛力，需求空間巨大。因此，大規(guī)模制備PQQ具有重要意義。據新思界產業(yè)研究中心統(tǒng)計，2014～2016年期間，中國PQQ產量呈逐年緩慢遞增趨勢。2014年產量為1 540.3 kg，2016年的產量為2 056.5 kg，價格超過5萬元/kg[20]。

隨著醫(yī)藥、食品、農業(yè)等行業(yè)的發(fā)展及人們對PQQ認識程度的加深，PQQ產品的市場需求量將增加。另外，由于技術的進步，其應用范圍也將擴大，進一步促使PQQ產品的市場需求量增加。目前，全球市場需求100多噸，主要供應商是日本的三菱瓦斯化學。我國有部分企業(yè)做植物提取，但是PQQ提取純化難度非常高，而化學合成則程序繁雜、污染嚴重、產率低、對環(huán)境易造成污染，應用于藥物或食品添加劑成本高，不適于推廣。相比之下，生物法合成PQQ具有反應條件溫和、合成過程易于控制、對環(huán)境無污染等優(yōu)點，是未來工業(yè)化生產PQQ的發(fā)展方向。氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans）為革蘭氏陰性菌，廣泛存在于自然界中，該菌含有大量膜結合脫氫酶，并與呼吸鏈耦合作用，氧化有機物和醇類作為PQQ的生產菌，因此在工業(yè)上很適合作為研究的模式菌株。本文對氧化葡萄糖酸桿菌生物合成PQQ過程中涉及的遺傳背景、分子機制以及代謝途徑進行綜述，并對未來研究重點進行展望，為工業(yè)化生產PQQ做鋪墊。

1 自然界PQQ的分布

自從發(fā)現PQQ以來，它在自然界的分布引起了研究者的關注。PQQ幾乎存在于所有的食品中，人體內臟、睪丸和體液中都存在PQQ，脾臟含量最高，達到5.9 ng/g，母乳中PQQ及其衍生物總含量高達140～180 ng/mL，比一般食物含量多幾十倍，但目前還無法證實高等生物能自身合成PQQ[21]。自然界中一些革蘭氏陰性菌具有合成PQQ的能力，研究發(fā)現，在不同的革蘭氏陰性菌中PQQ合成量有所不同，有些細菌，如惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida），僅滿足自身的生理代謝需求[22]；有些細菌卻能大量合成PQQ并分泌到胞外。迄今發(fā)現的野生菌包括：甲烷單胞菌屬（Methanomonas）、交替單胞菌屬（Alteromonas）、黃色桿菌屬（Xanthobacter）、不動桿菌屬（Acinetobacter）、甲基桿菌屬（Methylobacterium）、醋桿菌屬（Acinetobacter）、葡萄糖桿菌屬（Gluconobacter）、硫桿菌屬（Thiobacillus）、枝動菌屬（Mycoplana）、彎桿菌屬（Ancylobacter）、嗜甲基菌屬（Methylophilus）、生絲微菌屬（Hyphomicrobium）、精朊桿菌屬（Protaminobacter）等[23]。在這些微生物中，PQQ作為葡萄糖脫氫酶和乙醇脫氫酶的輔基，在底物與電子受體之間參與呼吸鏈電子傳遞作用，如氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans）、肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）、綠膿假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）、乙酸不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）、扭脫甲基桿菌（Methylobacterium extorquens）、嗜有機甲基桿菌（Methylobacteriumo organophilum）、鞭毛甲基菌（Methyldbacteriu fagellatum）、耐輻射球菌（Deinococuus radiodurans）等[24]。另外，自然界中還存在一些細菌，僅能合成醌蛋白酶類，而不合成PQQ，如大腸桿菌（Escherichia coli），醌酶只有結合PQQ后才具有活性。由此可見，微生物具有合成PQQ的應用條件，而如何開發(fā)構建高效PQQ生物合成的微生物是當前研究者需要重點解決的問題。

2 氧化葡萄糖酸桿菌中PQQ的相關研究

2.1 PQQ生物合成相關基因

PQQ合成途徑的研究已有二十余年，期間已對多種微生物的PQQ合成途徑進行了基因簇標記，發(fā)現不同的微生物間存在一定的差異，如Klebsiella pneumonia中PQQ基因簇為pqq ABCDEF；Pseudomonas aeruginosa中pqq ABCDE與pqq F相互分離；Methylobacterium extorquens AM1含有pqq ABC/DE操縱子，其中pqq C與pqq D為嵌套基因，另外pqq FG與其他基因獨立成操縱子；Acinetobactercalcoaceticus中僅有pqq ABCDE基因簇，而不含有pqq F基因等，PPQ生產菌及其基因簇排列情況具體見表1。

表1 吡咯喹啉醌生產菌及其基因簇排列情況[22]Table 1 Pyrroloquinoline quinone production strain and its genes cluster arrangement

2005年，PRUST C等[25]對氧化葡萄糖酸桿菌G.oxydans 621H基因組進行測序，發(fā)現其PQQ主要是由pqq ABCDE基因簇所編碼，HOLSCHER T等[26]通過熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）證實了pqq A的啟動子為整個基因簇唯一的啟動子。不同菌種pqq A基因編碼氨基酸肽鏈有所不同，一般為23～29個氨基酸殘基，如K.pneumoniae中為23個氨基酸組成；M.extorquens含有29個氨基酸；G.oxydans中包含27個氨基酸。即便如此，pqq A編碼的短肽鏈結果仍比較保守，其中谷氨酸Glu和酪氨酸Tyr為兩種保守殘基氨基酸，結構為Glu-X-X-X-Tyr（X為任意氨基酸）[27]。另外，在A.calcoaceticus中，pqq A基因保守序列的定點突變，以及K.pneumoniae中pqq A基因的移碼突變都能終止PQQ的合成，進一步證實pqq A基因中包含PQQ合成的骨架序列。pqq B基因編碼一個300個左右氨基酸的蛋白，對其序列分析發(fā)現，該蛋白為鋅指結構蛋白，屬于金屬-β-內酰胺酶類，且與磷酸二酯酶Phnp同源性最高。在PqqB蛋白活性中心與鋅指結構之間還有一段甘氨酸序列，且包含一個常見于非血紅素鐵蛋白結構。研究表明，pqq B基因編碼蛋白與Tyr的氧化[28]及PQQ的分泌[29]相關，但PqqB蛋白無疏水結構，不屬于膜蛋白，因此，PqqB蛋白可能是間接參與PQQ轉運。缺失PqqC蛋白的突變體中無法檢測到PQQ，而體外實驗表明，在在缺失PqqC蛋白的突變體無細胞體系中加入單獨表達的PqqC，溫育后則能檢測到PQQ，說明pqq C基因編碼的蛋白主要負責催化最后一步反應，形成PQQ[30]。經序列比對發(fā)現，PqqE蛋白與S-腺苷甲硫氨酸酶家族的蛋白具有較高的同源性，由此推測PqqE蛋白為Glu和Tyr形成C-C鍵提供活性能量，這也是PQQ合成的第一步反應，在此過程中，還需要PqqD蛋白參與激活PqqE的活性位點。在G.oxydans 621H中不含有pqq F基因，而在其遠下游端有一基因GOX1104，其與E.coli的tldD基因有很大同源性[26]。將GOX1104基因敲除后發(fā)現，宿主的生長非常緩慢，并且不能在以甘露醇為碳源的培養(yǎng)基上生長，同時，PQQ的合成受到抑制。通過GOX1104回補實驗確定，其與PQQ的生物合成相關。在G.oxydans中PQQ合成基因簇如圖1所示。

圖1 氧化葡萄糖酸桿菌621H中pqq ABCDE基因簇（a）及GOX1104基因簇（b）Fig.1 Gene cluster of pqq ABCDE(a)and GOX1104(b)in Gluconobacter oxydans 621H

2.2 PQQ生物合成途徑

研究人員雖已發(fā)現G.oxydans基因組中PQQ合成有關的基因簇，然而，PQQ整個生物合成途徑及代謝調控機制仍不清楚。KLEEF M A等[27，31]在培養(yǎng)PQQ生產菌的過程中，利用13C同位素標記，對培養(yǎng)基的碳源進行跟蹤，并結合核磁共振進行分析，結果發(fā)現谷氨酸（Glu）和酪氨酸（Tyr）是合成PQQ的重要氨基酸，這與PqqA的保守肽段相符合，并在此基礎上提出了PQQ合成途徑，如圖2所示。

圖2 谷氨酸和酪氨酸合成吡咯喹啉醌途徑Fig.2 Pyrroloquinoline quinone synthesis pathway from glutamic acid and tyrosine

2004年，MAGNUSSON O T等[32]在大腸桿菌中表達來自K.pneumoniae的pqq C基因，并經過蛋白結晶、X-衍射確認PqqC的空間結構及反應活性位點。在體外催化反應中發(fā)現，PQQ合成途徑的最后一步由PqqC蛋白酶負責完成，如pqq C基因功能缺失將無法合成PQQ，且有一中間代謝物質累積。該中間產物再經過PqqC的氧化作用，在其結構的不同位置脫去8個氫而最終又可以合成PQQ。2008年，PUEHRINGER S等[33]利用氨基酸序列及蛋白質同源建模，分析各參與PQQ合成相關酶的催化功能并提出其合成代謝途徑。首先以pqq A基因產物為前體，在PqqE作用下，將前體肽鏈的谷氨酸和酪氨酸相連；然后在PqqF蛋白酶的催化作用下切除多余的肽鏈；再經過脫水環(huán)化和加氧羰基化，隨后在PqqC蛋白酶作用之下，經過多步加水和脫氫反應形成PQQ。

蛋白質家族和生物合成途徑的結構表征，闡明PQQ生物合成的演變，對于其他天然產品及其生物合成所需的途徑是有意義的。確定每一個基因在PQQ生物合成途徑的作用，也可能有助于了解某些蛋白質家族中肽構象改變形成的天然生物活性產物。

2.3 氧化葡萄糖酸桿菌生物合成PQQ潛在優(yōu)勢

氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans）是一類橢圓形或桿狀的革蘭氏陰性細菌，相比于其他細菌，G.oxydans細胞膜上存在大量的脫氫酶，能將多元醇不完全氧化為醛或酮，這吸引了眾多研究者研究其生物化學及分子生物學性質。

據研究顯示，G.oxydans有32個膜結合的脫氫酶，其中的11個已經非常清楚，剩余的21個脫氫酶功能還不是很明確，特別是底物特異性方面[25]。在這些脫氫酶中，大部分為依賴于輔酶PQQ作為配基，部分依賴于黃素核苷酸。PQQ是一種高度可溶和熱穩(wěn)定的化合物，作為輔基與蛋白非共價結合，促使細菌周質中糖和醇的氧化，過程中擔負著傳遞電子、質子和化學基團的功能。2014年，GAO L L等[34]在G.oxydans WSH-003中融合表達PQQ合成基因簇及途徑關鍵基因，使得2-酮基-L-古龍酸的產量達32.4 g/L；YUAN J F等[35]在G.oxydans DSM2343中過表達PQQ基因簇，使得PQQ水平提升3.8倍?？梢?，PQQ是G.oxydans的關鍵因子，可以影響目標產物的生成，而最主要的是PQQ直接影響宿主菌的生長。據報道[26]，如缺失PQQ合成基因，G.oxydans將無法在D-甘露醇、D-葡萄糖及甘油為唯一碳源的培養(yǎng)基上生長。

由此可見，PQQ對G.oxydans有重要的生理意義。另外，G.oxyadan膜結合蛋白酶的催化活性中心面向于周質外，有著非常高的氧化速率和氧化產率，不需要氧化底物運送到細胞內部，就可以將大量的氧化產物釋放到培養(yǎng)基中。而PQQ是在細胞內合成，并轉運到胞外產生功能的物質，所以認為，氧化葡萄糖酸桿菌的這種生理特性表明其具有超越其他合成PQQ微生物的優(yōu)勢，具有進一步開發(fā)生產PQQ的潛力。因此，若能夠利用基因工程技術使其構建成基因工程菌，就能夠提高其生物量和酶活力，從而以提高經濟效益。

3 影響氧化葡萄糖酸桿菌中PQQ合成的因素

3.1 基因表達調控

在氧化葡萄糖酸G.oxydans中，pqq ABCDE基因簇對PQQ生物合成進行調控，所有基因共用一個啟動子，即受pqq A基因的啟動子所調控。因此，PQQ合成的所有基因表達的比例必須適當，另外，pqq A基因末端還有抑制轉錄的發(fā)卡結構，可以調控之后的基因的表達[25]。此外，在pqq ABCDE基因簇之間也存在相互的促進或抑制作用，對PQQ的合成也有重要的調控作用。如孫繼國[36]利用不同啟動子在大腸桿菌及肺炎克雷伯氏菌中表達PQQ基因簇，在優(yōu)化培養(yǎng)基的條件下，PQQ產量為1 700 nmol/L。

其次，基因的拷貝數對PQQ合成量影響很大，利用高拷貝質粒表達PQQ基因時，幾乎沒有PQQ的合成[35]，相反地，利用低拷貝質粒時卻有大量PQQ合成并被分泌至培養(yǎng)基中。另外，PQQ的酶蛋白表達量對PQQ合成也存在一定的影響[36]，當酶蛋白沒有合成時，PQQ無法合成，但酶蛋白量與PQQ的合成并不是正相關的關系，當提高酶蛋白的合成量時，PQQ合成量并沒有明顯的增加[34]。

3.2 培養(yǎng)基

據氧化葡糖桿菌的生長特征，其培養(yǎng)基中最基本的碳、氮源、無機鹽、生長因子、水、溶氧、pH等的種類及其含量對PQQ合成會有影響。司振軍[23]利用等離子誘變，結合Plackett-Burman法優(yōu)化培養(yǎng)基，Methylobacillus sp.ZJU323產PQQ達450 mg/L。另外，培養(yǎng)基中的添加如谷氨酸、酪氨酸等的種類和含量也會影響氧化葡萄糖酸桿菌的生長速率，進而會影響PQQ的生產速率和產量。李盼盼[37]利用氧化葡萄糖酸桿菌（G.oxydans）621H作為出發(fā)菌株，單因素及正交試驗優(yōu)化培養(yǎng)基，并優(yōu)化前體物質Glu和Tyr的添加，最終PQQ產量為0.813 mL/L。金屬離子對PQQ的合成也有一定的影響[38]，目前發(fā)現Fe2+與Mg2+對PQQ合成量影響最大。URAKAMIT等[39]利用Hyphomicrobium sp.TK0441合成PQQ時，適量的檸檬酸鐵和硫酸鎂對PQQ的合成具有促進作用。特別是亞鐵離子濃度，當亞鐵離子濃度過髙時，不利于PQQ的積累。楊詩穎等[40]還發(fā)現，磷元素對其產量也具有顯著的影響，鐘杉杉[41]在實驗中同樣也發(fā)現，提高磷元素和鉀元素能提高假單胞桿菌合成PQQ的能力。

3.3 培養(yǎng)條件

最后，對氧化葡萄糖酸桿菌的培養(yǎng)方式、培養(yǎng)基中的有毒有害物質包括代謝的副產物也會影響PQQ的生產速率和產量。經過實驗可知，當其他條件相同，pH值為6.5，發(fā)酵溫度為30℃，發(fā)酵轉速為200 r/min左右時，PQQ的生產速率和產量較為理想[37]。鄭璞等[42]研究發(fā)現，在甲基營養(yǎng)菌（Methylopila sp.）YHT-1中35℃時更有利于PQQ的合成。對于Methylovorus sp.MP688來說，當pH從7.0降至5.5時可以誘導PqqA2基因啟動子啟動，從而提高PQQ合成量[43]。

4 展望

氧化葡萄糖酸桿菌具有獨特的不完全氧化多羥基物質的特性，而使其應用特別廣泛，并吸引眾研究者的關注。氧化葡萄糖酸桿菌的細胞膜上具有大量依賴于PQQ的脫氫酶，而關于PQQ各個相關合成基因的功能研究也有一定的進展，但仍有許多問題無法解決，如是否存在其他的相關合成基因，這些基因的轉錄與表達調控，以及各基因的準確功能，生物合成中各步驟的中間產物與基因產物的結構、性質等將是下一步研究的重點和突破口。關于生物制造PQQ的研究處于剛起步階段，本文所論述的只是研究領域的小部分，今后的研究重點從以下兩個方面展開：

（1）代謝工程改造。如過表達前體肽基因pqq A，提高PQQ水平。另外，表達調控元件，如啟動子、基因拷貝數等對合成PQQ水平具有一定的調控作用，通過對mRNA二級結構調節(jié)等，有效提升PQQ合成基因簇的表達水平。

（2）從PQQ分泌表達角度出發(fā)?？椎鞍资且活惸まD運蛋白，能形成非特異的跨膜通道，允許相對分子質量＜10 kDa的小分子自由通過，可將細胞內物質轉運至胞外，如大腸桿菌ompA、phoE、LamB及ompC這4種蛋白。PqqB蛋白參與PQQ的轉運，但不能直接起作用，主要是其結構缺少疏水序列，而信號肽之所以能促進蛋白質的跨膜轉運，主要是其結構中含有疏水序列，因此，可以利用孔蛋白或信號肽以提升PQQ的跨膜轉運。