黃 芳，李 欣，李 沛，李 庫，王 志，代 俊，陳 雄*

（1.湖北工業(yè)大學 生物工程與食品學院 發(fā)酵工程教育部重點實驗室 工業(yè)發(fā)酵湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北 武漢 430068；2.安琪酵母股份有限公司 湖北省酵母功能重點實驗室，湖北 宜昌 443003）

核糖核酸（ribonucleic acid，RNA）是一類十分重要的生物大分子，它不僅在基因的表達和蛋白質的生物合成中起著關鍵的作用，而且能促進細胞的諸多生理功能。核苷酸和核糖核苷酸是核酸的不完全水解物，研究表明，RNA及其降解物核苷酸具有維持機體免疫功能、抗氧化、提高機體蛋白質和鐵的生物利用率、降低膽固醇和抗衰老等多種生理功能[1-2]。因此，RNA及其降解物在醫(yī)藥、保健、農業(yè)生產、食品加工、飼料工業(yè)、化妝品等行業(yè)都有著重要作用[3-6]。

核糖核酸的來源較為廣泛，核糖核酸通常在細菌中的含量為0.3%～9.7%，酵母中的含量為2.7%～15.0%，霉菌中的含量為0.7%～2.8%[7]。目前核糖核酸工業(yè)生產方法以酵母發(fā)酵法為主[5，8-9]，然后從酵母中提取RNA，被用于工業(yè)化微生物法生產RNA的菌種主要有釀酒酵母（Saccha romyces cerevisiae）和解脂假絲酵母（Candida lipolytica）[10]。其中，熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）RNA含量較高，一般在8%以上。許多關于高核酸酵母菌的選育多集中在假絲酵母屬[11-12]。YOSHOIO N等[12]通過化學誘變的方式得到了對數(shù)生長期核酸含量達11%的解脂假絲酵母。楊依順等[13]篩選到一株高核酸釀酒酵母，通過連續(xù)發(fā)酵，其RNA含量達到6.05%。

目前，工業(yè)化酵母培養(yǎng)多采用以糖蜜為碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基[14]，糖蜜內含有大量的可發(fā)酵糖，其主要成分為蔗糖，同時還含有豐富的礦物質（鉀、氯、鈉、鎂等）、維生素、氨基酸等，對微生物的生長有利[15-17]。因其價格低廉，營養(yǎng)豐富，被用于工業(yè)化培養(yǎng)酵母的主要碳源。盛建國等[18]利用高核酸酵母K-79發(fā)酵糖蜜制備RNA，能得到6.5%左右的產率。在發(fā)酵過程中，RNA含量的變化情況主要呈現(xiàn)出兩個明顯的階段：前期的積累和后期的降解?；谶@一現(xiàn)象可通過一些補料發(fā)酵調控方式如補加碳氮源或補加合成RNA的前體物質（氨基酸[19]、堿基）等來延長前期RNA積累的過程、強化RNA積累的速率以及減緩后期RNA的降解速率，來研究熱帶假絲酵母高產RNA的發(fā)酵工藝。俞燦等[20]利用釀酒酵母，以糖蜜為碳源，采用碳源、氮源、磷源流加補料工藝，RNA含量達到8.11%。富含核糖核酸酵母的細胞量和RNA產量不高仍是我國酵母核酸產業(yè)現(xiàn)有的兩大關鍵問題。

本試驗利用一株熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）AY91009，以糖蜜為碳源，通過響應面分析試驗優(yōu)化其發(fā)酵培養(yǎng)基，并進行20 L發(fā)酵罐分批試驗，為高核酸熱帶假絲酵母的工業(yè)生產發(fā)酵研究提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗菌株

熱帶假絲酵母（Candida tropicalis）AY91009：中國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 化學試劑

酵母浸粉（生化試劑）、甘蔗糖蜜（含糖量30%左右）：安琪酵母有限公司；蛋白胨（生化試劑）：北京雙旋微生物培養(yǎng)基制品廠：瓊脂（生化試劑）：中國Biosharp公司；其他實驗所用試劑（均為分析純）：國藥集團化學試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）培養(yǎng)基（種子培養(yǎng)基）：葡萄糖2%，酵母浸粉1%，蛋白胨2%，115℃滅菌20 min。

斜面培養(yǎng)基：葡萄糖2%，酵母浸粉1%，蛋白胨2%，瓊脂2%，115℃滅菌20 min。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖4%，酵母浸粉1%，KH2PO40.3%，（NH4）2SO41%，MgSO4·7H2O 0.12%，ZnSO4·7H2O 0.015%，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.015%，pH5.0±0.05，裝液量50 mL/250 mL，115℃滅菌20 min。

酵母浸粉蔗糖（yeast extract sucrose，YES）培養(yǎng)基（發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基）：蔗糖5%，酵母浸粉1%，MgSO4·7H2O 0.05%，KH2PO40.05%，pH5.0±0.2。

1.2 儀器與設備

DELTA 320 pH計：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；YXQ-LS-75S11立式壓力蒸汽滅菌器：上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠；5417R型冷凍離心機：德國Eppendorf公司；UVmini-1240紫外-可見分光光度計：日本島津公司；HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋：常州國華電器有限公司；HNY-211B全溫振蕩培養(yǎng)箱：天津歐諾儀器儀表有限公司；BIOTECH-3000 20 L發(fā)酵罐：上海保興生物設備工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株的活化及種子液的制備

將斜面保藏的熱帶假絲酵母菌株AY91009接一環(huán)至裝有100 mL YEPD培養(yǎng)基的搖瓶中活化，培養(yǎng)條件為200 r/min、30℃，培養(yǎng)12 h。再將活化好的液體菌液按5%接種量接種至基礎發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為30℃、200 r/min，培養(yǎng)12 h后取樣檢測。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素優(yōu)化試驗

（1）糖蜜含量的優(yōu)化

每100 mL培養(yǎng)基設置不同的糖蜜體積（6 mL、8 mL、10 mL、12 mL、14 mL、16 mL），以糖蜜取代基礎發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖為碳源，其余培養(yǎng)條件不變，培養(yǎng)12 h后取樣檢測生物量與RNA含量。

（2）氮源的選擇及添加量優(yōu)化

分別以1%的酵母浸粉、牛肉膏、玉米漿、氯化銨、硫酸銨、硝酸銨為氮源，其余培養(yǎng)條件不變，培養(yǎng)12 h后取樣檢測生物量與RNA含量。

氮源添加量的優(yōu)化：選擇優(yōu)化后的氮源，設置不同的氯化銨添加量（0、0.3%、0.5%、0.7%）和不同的酵母浸粉添加量（0、1%、2%、3%、4%），空白組中不含任何氮源，其余培養(yǎng)條件不變，培養(yǎng)12 h后取樣檢測生物量與RNA含量。

混合氮源比例的確定：在上述氮源總質量濃度不變的基礎上，調節(jié)酵母浸粉和氯化銨的混合質量比，分別為2.50∶0、2.25∶0.25、2.00∶0.50、1.75∶0.75、1.50∶1.00、1.25∶1.25、1.00∶1.50、0.75∶1.75、0.50∶2.00、0.25∶2.25、0∶2.50，其余培養(yǎng)條件不變，培養(yǎng)12 h后取樣檢測生物量與RNA含量。

（3）磷源的選擇及添加量的優(yōu)化

分別將0.3%的磷酸二氫鉀（KH2PO4）、三水磷酸氫二鉀（K2HPO4·3H2O）、二水磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）、十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）作為培養(yǎng)基中的磷源，其余培養(yǎng)條件不變，培養(yǎng)12 h后取樣檢測生物量與RNA含量。

磷源添加量的優(yōu)化：設置不同的NaH2PO4·2H2O添加量（0、0.05%、0.10%、0.20%、0.30%），其余培養(yǎng)條件不變，培養(yǎng)12 h后取樣檢測生物量與RNA含量。

（4）無機鹽的優(yōu)化

對MgSO4·7H2O和ZnSO4·7H2O在0～0.25%之間設置6個濃度梯度，F(xiàn)eSO4·7H2O在0～0.1%之間設置6個濃度梯度，進行試驗，其余培養(yǎng)條件不變，培養(yǎng)12 h后取樣檢測生物量與RNA含量。

1.3.3 培養(yǎng)基配方優(yōu)化響應面分析[21-22]

（1）Plackett-Burman試驗設計

根據(jù)單因素試驗結果，選取各個因素的水平，進行2水平的Plackett-Burman試驗用Design Expert 8.0.6軟件篩選出影響RNA含量的顯著因子，再通過最陡爬坡試驗確定顯著因子的的濃度范圍，再通過響應面分析對顯著因子的水平進行優(yōu)化確定最佳培養(yǎng)基配方，Plackett-Burman試驗因素與水平見表1。

表1 Plackett-Burman試驗因素與水平Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments

（2）最陡爬坡試驗

根據(jù)Plackett-Burman試驗結果，從眾多因素中篩選出影響RNA含量加大的3個顯著因素，以此來確定各因素的水平、爬坡方向和步長，能快速、經濟逼近最佳值區(qū)域，從而確定響應面試驗中心點。

（3）響應面試驗

根據(jù)最陡爬坡試驗確定了重要因素質量分數(shù)的取值區(qū)間。利用Design-Expert10.0進行中心組合試驗設計（central composite design，CCD），將最陡爬坡試驗中的因素分別標記為X1、X2、X3，以發(fā)酵培養(yǎng)12 h后菌體中RNA含量為響應值，標記為Y，中心組合試驗因素變量與水平見表2。

表2 響應面試驗的因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments

1.3.4 發(fā)酵罐小試發(fā)酵

將斜面保藏菌種接種一到兩環(huán)到YES培養(yǎng)基，200 r/min、30℃搖床培養(yǎng)基12 h后，按2.5%接種量接到1瓶YES培養(yǎng)基（100 mL/瓶）中200 r/min、30℃搖床培養(yǎng)12 h，將1瓶種子液接種到裝有5 L YES培養(yǎng)基的20 L發(fā)酵罐中，設定發(fā)酵條件為100 r/min、30℃，通氣0.4 m3/h培養(yǎng)11 h，再將115℃滅菌20 min后的發(fā)酵培養(yǎng)基接入發(fā)酵罐內，發(fā)酵初始體積為12 L，發(fā)酵溫度30℃，前3小時的pH控制在5.5，轉速600 r/min，通氣量1.44 m3/h，3 h后pH控制在4.5，轉速400 r/min，通氣量0.96 m3/h，每小時取樣檢測。

1.3.5 分析檢測

（1）RNA含量的測定方法[23]

吸取5 mL培養(yǎng)液于10 mL離心管內，然后8 000 r/min離心10 min，倒去上清，稱量菌體濕質量；用清水洗滌菌體2次，然后加入8 mL預冷的0.25 mol/L高氯酸（HClO4）溶液并振蕩搖勻，在4℃的冰箱靜置15 min，4 000 r/min離心10 min，倒去上清液再加入5 mL 0.5 mol/L高氯酸溶液并振蕩搖勻，再放置70℃的恒溫水浴鍋中處理15 min，期間每到2～3 min振蕩一次；再于4 000 r/min離心10 min，吸取1 mL上清液于100 mL容量瓶并用蒸餾水定容。在波長260 nm處測量吸光度值，用蒸餾水作為空白，并記錄吸光度值。RNA含量計算公式如下：

式中：A為樣品溶液的吸光度值；N為樣品稀釋倍數(shù)；0.033 65為對應于吸光度值為1.00時，待測溶液中RNA的含量，mg/100 mL；5為在加入0.5 mol/L HClO4后溶液的體積，mL；M為稱取樣品的干質量，mg。

（2）生物量測定方法

吸取10 mL酵母菌液于干燥并已稱量質量的離心管中，8 000 r/min離心10 min，收集酵母菌體。用去離子水洗滌菌體2次，放入80℃的烘箱中烘干至恒質量，稱質量并計算生物量（細胞干質量（dry cell mass，DCM）），其計算公式如下：

式中：DCM為生物量，g/L；w為一定體積發(fā)酵液質量，g；v為發(fā)酵液體積，mL。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

Plackett-Burman試驗和響應面優(yōu)化試驗均采用Design-Expert8.0.6設計軟件進行設計分析，試驗均進行3次重復取平均值。

2 結果與分析

2.1 熱帶假絲酵母基本性能評價

圖1 熱帶假絲酵母AY91009的生長狀況和RNA含量Fig.1 Growth situation and RNA content of Candida tropicalis AY91009

熱帶假絲酵母AY91009在基礎培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)11 h，每小時取樣檢測生物量和RNA含量，結果見圖1。由圖1可知，熱帶假絲酵母在0～1 h處于生長停滯期，1～7 h處于對數(shù)生長期，7～11 h到達穩(wěn)定期；RNA含量的變化分為兩個階段，0～3 h RNA含量逐漸積累，3 h時RNA含量最高，為11.88%，3～7 h隨著生物量的增加RNA不斷降解，后期基本維持穩(wěn)定，在發(fā)酵結束（第11小時）時RNA含量為8.54%，該菌株RNA含量情況的各階段十分清晰，且在菌體進入穩(wěn)定期后RNA含量也處于比較穩(wěn)定的狀態(tài)。

2.2 單因素優(yōu)化試驗

2.2.1 糖蜜含量的優(yōu)化

不同糖蜜含量對熱帶假絲酵母AY91009生物量和RNA含量的影響，結果見圖2。由圖2可知，當糖蜜含量為6～16 mL/100 mL時，生物量先上升后趨于平穩(wěn)，雖然當糖蜜含量為16 mL/100 mL時，其生物量和RNA含量最佳，分別為7.48 g/L和10.30%；但當糖蜜含量為14 mL/100 mL和16 mL/100 mL時，RNA含量分別為10.15%和10.30%，差異不大，且生物量的差別也較小。因此，出于節(jié)約成本的考慮，選擇糖蜜含量為14 mL/100 mL的培養(yǎng)基進行后續(xù)試驗。

圖2 不同糖蜜含量對菌株AY91009生物量和RNA含量的影響Fig.2 Effect of different molasses volume on biomass and RNA content of strain AY91009

2.2.2 氮源的優(yōu)化

不同氮源及不同氮源的質量濃度對熱帶假絲酵母的生物量及RNA含量的影響，結果見圖3。由圖3A可知，有機氮源中酵母浸粉的效果最好，生物量和RNA含量最高，分別為8.52 g/L和10.85%；無機氮中添加氯化銨時，RNA含量最高，為9.27%。酵母浸粉價格較高。因此，為了降低成本決定選用酵母浸粉和氯化銨作為混合氮源。

由圖3B可知，氯化銨含量在0～0.7%時，生物量基本一致，RNA含量先上升后下降，在氯化銨含量為0.5%時RNA含量為10.42%，因此，氯化銨的最佳含量為0.5%。酵母浸粉用量為0～4%時，RNA含量隨著酵母浸粉用量的增加先上升后下降，在含量為2%時達到最高為11.11%；生物量在酵母浸粉用量為0～3%范圍內逐步上升，在酵母浸粉用量3%～4%后逐步下降，綜合考慮生物量和RNA含量，酵母浸粉的最佳用量為2%。因此，確定培養(yǎng)基中氮源總濃度為2.5%，在此基礎上調節(jié)兩種物質的混合比例。

圖3 不同氮源（A）、不同NH4Cl和酵母浸粉添加量（B）及酵母浸粉與NH4Cl質量比（C）對菌株AY91009生物量和RNA含量的影響Fig.3 Effect of different nitrogen sources(A),different NH 4Cl and yeast extract powder addition(B)and yeast extract powder to NH4Cl mass ratio(C)on biomass and RNA content of strain AY91009

由圖3C可知，生物量隨著混合氮源中酵母浸粉比例的減少而降低，RNA含量隨著混合氮源中酵母浸粉比例的減少先上升后下降又有一定的上升，最終選擇酵母浸粉與氯化銨質量比為1.50∶1.00，即酵母浸粉添加量為1.50%、氯化銨添加量為1.00%，此時RNA含量為11.80%，生物量為9.04 g/L。

2.2.3 磷源的優(yōu)化

不同磷源及其添加量對熱帶假絲酵母生物量和RNA含量影響結果見圖4。

圖4 不同磷源（A）及不同NaH2PO4·2H2O添加量（B）對菌株AY91009生物量和RNA含量的影響Fig.4 Effect of different phosphorus sources(A),different NaH2PO4·2H2O addition(B)on biomass and RNA content of strain AY91009

由圖4A可知，添加不同磷源，生物量變化不大且都比對照小，說明添加不同磷源對菌體生長都有一定的抑制作用；但都對RNA含量有一定影響，其中NaH2PO4·2H2O組RNA含量最高，為10.66%，因此，選擇NaH2PO4·2H2O作為磷源。

由圖4B可知，NaH2PO4·2H2O添加量在0.05%～0.30%時，生物量變化不明顯，RNA含量先上升后下降，當NaH2PO4·2H2O添加量為0.10%時，生物量和RNA含量分別為8.9 g/L、10.57%。因此，NaH2PO4·2H2O的最佳添加量0.10%。

2.2.4 無機鹽的優(yōu)化

不同無機鹽對熱帶假絲酵母生物量和RNA含量影響結果見圖5。由圖5A可知，MgSO4·7H2O含量在0～0.25%時，RNA含量逐步上升最后維持穩(wěn)定。因此，MgSO4·7H2O的最佳添加量0.20%。

由圖5B可知，當FeSO4·7H2O含量在0～0.05%時，RNA含量逐步上升，當FeSO4·7H2O含量＞0.05%之后開始下降；FeSO4·7H2O的含量對生物量的影響不大，在0～0.10%內趨于平穩(wěn)。因此，F(xiàn)eSO4·7H2O的最佳添加量0.05%。

圖5 MgSO4·7H2O（A）、FeSO4·7H2O（B）、ZnSO4·7H2O（C）添加量對菌株AY91009生物量和RNA含量的影響Fig.5 Effect of MgSO 4·7H2O(A),FeSO 4·7H2O(B)and ZnSO4·7H2O(C)addition on biomass and RNA content of strain AY91009

由圖5C可知，當ZnSO4·7H2O含量在0～0.15%時，RNA含量幾乎沒變化，當ZnSO4·7H2O含量＞0.15%之后逐步上升；ZnSO4·7H2O的含量在0～0.25%之間對生物量的影響是先上升后緩慢下降。因此，ZnSO4·7H2O最佳添加量0.25%。

2.3 響應面分析結果

2.3.1 Plackett-Burman試驗

按照Plackett-Burman試驗設計，把每個因素設計成高（+1）、低（-1）2個水平，高水平為低水平的2倍，RNA含量為響應值，具體試驗設計見表3，各因素效應分析見表4。

由表4可知，糖蜜、酵母浸粉、氯化銨、NaH2PO4·2H2O、MgSO4·7H2O表現(xiàn)為正效應，F(xiàn)eSO4·7H2O、ZnSO4·7H2O表現(xiàn)為負效應?？尚哦龋?5%的因素為酵母浸粉、氯化銨、ZnSO4·7H2O，表現(xiàn)為顯著（P＜0.05），且這3個因素的貢獻值都排在前三位。因此，確定酵母浸粉、氯化銨、ZnSO4·7H2O為主要影響因素進行下一步最陡爬坡試驗。

表3 Plackett-Burman試驗設計與結果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4 Plackett-Burman試驗各因素效應分析Table 4 Effect analysis of each factor of Plackett-Burman experiments

2.3.2 最陡爬坡試驗結果

根據(jù)Plackett-Burman試驗的分析結果，顯著因素的步長及分析結果見表5。

表5 最陡爬坡試驗設計及結果Table 5 Design and results of steepest ascent experiments

由表5可知，最高的RNA含量的因素對應的添加量在第5組，因此，選擇第5組作為響應面的中心點，即酵母浸粉2.60%，氯化銨1.30%，ZnSO4·7H2O 0.13%。

2.3.3 響應面分析試驗設計及結果

根據(jù)最陡爬坡試驗確定了重要因素添加量的取值區(qū)間。利用Design-Expert進行中心組合的試驗設計，將最陡爬坡試驗中的因素分別標記為X1、X2、X3，以發(fā)酵培養(yǎng)12 h后菌體中RNA含量為響應值，標記為Y，中心組合試驗設計結果見表6，方差分析見表7。

表6 響應面試驗設計及結果Table 6 Design and results of response surface experiments

表7 回歸模型方差分析Table 7 Variance analysis of regression model

根據(jù)表6的試驗結果通過Design-Expert 10.0分析軟件進行響應面分析，建立多元二次回歸方程：Y=11.24+0.35X1-0.14X2+0.037X3+0.099X1X2-0.26X1X3-0.3X2X3-0.14X12-0.35X22-0.16X32。由表7可知，模型P=0.036 6＜0.05，表明該模型顯著，失擬項P=0.721 5＞0.05，不顯著，表明回歸方程擬合程度良好，可以用此模型對響應值進行分析和預測。一次項X1、二次項X22對結果影響顯著（P＜0.05），決定系數(shù)R2=0.850 9，表明模型在85.09%程度上能夠解釋RNA含量與因素變量之間的關系，而調整決定系數(shù)R2adj=0.826 7，與R2數(shù)值相接近表明模型預測值和實際試驗結果具有較好的相關性。

2.3.4 最佳添加量的確定及驗證試驗

根據(jù)上述回歸方程繪出響應面分析圖，結果見圖6。由圖6可知，該方程的拋物線圖形開口均向下，說明存在最大值，即響應面覆蓋了最大值所在的區(qū)域。由Design-Expert10.0分析得到最適培養(yǎng)基組成為糖蜜140 mL/L、酵母浸粉2.90%、氯化銨1.37%、NaH2PO4·2H2O 0.10%、MgSO4·7H2O 0.20%、FeSO4·7H2O 0.05%、ZnSO4·7H2O 0.10%。預測在此條件下，RNA含量能達到11.56%。

圖6 酵母浸粉、NH4Cl和ZnSO4·7H2O添加量交互作用對RNA含量影響的響應面和等高線Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between yeast powder,NH 4Cl and ZnSO4·7H2O addition on RNA content

使用上述優(yōu)化后的培養(yǎng)基進行搖瓶驗證試驗，熱帶假絲酵母的發(fā)酵生長及RNA含量如圖7所示，發(fā)酵結束即第12小時RNA含量達到11.58%，與理論值11.56%相差不大，比優(yōu)化前（8.54%）提高了35.6%。

圖7 優(yōu)化培養(yǎng)基對熱帶假絲酵母AY91009的生長和RNA含量的影響Fig.7 Effect of optimized medium on growth and RNA content of Candida tropicalis AY91009

2.4 20 L發(fā)酵罐發(fā)酵性能評估

利用響應面優(yōu)化確立的最適發(fā)酵培養(yǎng)基在20 L發(fā)酵罐水平進行發(fā)酵驗證，結果見圖8。由圖8可知，發(fā)酵結束（第13小時）時，生物量達到32.38 g/L，RNA含量為6.69%，總RNA含量（每升發(fā)酵液中的RNA含量）為2.17 g/L；RNA含量先上升后下降，在第3小時達到最高點為11.33%，隨著生物量的增加，RNA不斷降解，在第12小時的時候RNA降到最低點，到13 h又有一定的回升，3～12 h平均每小時RNA降解速率為0.49%，表明熱帶假絲酵母AY91009是一株有潛力的工業(yè)化生產菌株。

圖8 在20 L發(fā)酵罐優(yōu)化培養(yǎng)基中熱帶假絲酵母AY91009的生長和RNA含量變化Fig.8 Changes of growth and RNA content of Candida tropicalis AY91009 in optimized medium of 20 L fermentation

3 結論

本試驗通過現(xiàn)有一株熱帶假絲酵母菌株AY91009，在初始培養(yǎng)基上RNA含量為8.54%。并以糖蜜為培養(yǎng)基碳源，采用響應面法，建立了酵母浸粉、氯化銨和ZnSO4·7H2O用量的二次回歸模型，確定最適發(fā)酵培養(yǎng)基為：糖蜜（30%含糖量）140 mL/L、酵母浸粉2.9%、氯化銨1.37%、NaH2PO4·2H2O 0.1%、MgSO4·7H2O 0.2%、FeSO4·7H2O 0.05%、ZnSO4·7H2O 0.1%。在此培養(yǎng)基中RNA含量達11.58%，比優(yōu)化前提高了35.6%。最后利用20 L的發(fā)酵罐進行發(fā)酵驗證，發(fā)酵13 h生物量達32.38 g/L，RNA含量達6.69%，總RNA為2.17 g/L。