王 萌，張念章，朱興全

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所 家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 甘肅省動(dòng)物寄生蟲(chóng)病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730046）

弓形蟲(chóng)病（toxoplasmosis）是由剛地弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）引起的一種人獸共患寄生蟲(chóng)病，廣泛分布于世界各地，可感染包括人在內(nèi)的幾乎所有溫血?jiǎng)游?。全世界約30%的人感染弓形蟲(chóng)[1]，我國(guó)人弓形蟲(chóng)血清陽(yáng)性約7.88%[2]。人類除先天性感染弓形蟲(chóng)外，也可通過(guò)誤食含有弓形蟲(chóng)包囊的生肉或含有弓形蟲(chóng)卵囊的水和蔬菜等而感染。

貓科動(dòng)物既是弓形蟲(chóng)的中間宿主，也是其唯一的終末宿主。貓攝取弓形蟲(chóng)速殖子、緩殖子或孢子體后，都會(huì)感染弓形蟲(chóng)[3]，但是潛伏期（最初感染到排出卵囊的時(shí)間）和排卵囊的頻率不同。研究表明，貓感染組織包囊后排出卵囊的潛伏期為3～10 d，感染卵囊的潛伏期不低于18 d[4-7]，而感染速殖子后潛伏期不定[8]。研究顯示潛伏期與感染劑量無(wú)關(guān)。貓?jiān)谑橙牍蜗x(chóng)速殖子和卵囊之后，排卵囊率不足50%，但貓食入包囊后，排卵囊率會(huì)高達(dá)100%[4-10]。鑒于貓科動(dòng)物在弓形蟲(chóng)病傳播過(guò)程中的關(guān)鍵作用，本文將綜述貓科動(dòng)物弓形蟲(chóng)病的研究進(jìn)展。

1 貓弓形蟲(chóng)病的發(fā)現(xiàn)歷史

1908年， Nicolle和Manceaux在一種嚙齒類梳齒鼠（gundis）的體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一種蟲(chóng)體，命名為剛地弓形蟲(chóng)。1956年，Hutchison首次發(fā)現(xiàn)貓的糞便可以導(dǎo)致人或動(dòng)物感染弓形蟲(chóng)病[11]。1970年，人們?cè)谪埿∧c上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了弓形蟲(chóng)的有性生殖階段，并在貓的糞便中檢測(cè)出弓形蟲(chóng)裂殖生殖和配子生殖的產(chǎn)物-弓形蟲(chóng)卵囊[3,12-13]。經(jīng)多次研究證明，只有貓科動(dòng)物可以排卵囊，即貓是弓形蟲(chóng)的唯一終末宿主[14]。目前已知大部分常見(jiàn)貓科動(dòng)物在人工感染或自然感染條件下可以排出弓形蟲(chóng)卵囊。

貓科動(dòng)物在弓形蟲(chóng)的自然傳播過(guò)程中起到很重要的作用。對(duì)太平洋地區(qū)，以及澳大利亞、美國(guó)的多個(gè)獨(dú)立島嶼進(jìn)行動(dòng)物血清學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，弓形蟲(chóng)的傳播與貓科動(dòng)物的出現(xiàn)呈正相關(guān)。豬和小鼠等中間宿主食入1個(gè)卵囊便可導(dǎo)致弓形蟲(chóng)感染，而貓食入100個(gè)卵囊也未必感染成功。飼喂貓1個(gè)緩殖子可排出數(shù)以萬(wàn)計(jì)的卵囊，但飼喂小鼠100個(gè)緩殖子也可能導(dǎo)致弓形蟲(chóng)感染失敗[10,15]。因此貓可以作為檢測(cè)肉類樣品中是否含有弓形蟲(chóng)的指示動(dòng)物，而小鼠和豬等中間宿主可以作為檢測(cè)動(dòng)物飼料或者水源是否有弓形蟲(chóng)卵囊污染的指示動(dòng)物[16]。

2 腸內(nèi)發(fā)育的研究

弓形蟲(chóng)發(fā)育史中包含有性生殖（配子生殖）和無(wú)性生殖（裂殖生殖）兩種繁殖方式，有性生殖只發(fā)生于貓科動(dòng)物的小腸上皮細(xì)胞中。貓科動(dòng)物經(jīng)口感染包囊后，包囊壁被胃和小腸的蛋白水解酶水解，緩殖子被釋放出來(lái)，進(jìn)入小腸上皮細(xì)胞，裂殖生殖多代。一部分速殖子隨血液循環(huán)，在其他組織、器官內(nèi)進(jìn)行無(wú)性生殖，還有一部分在小腸上皮細(xì)胞內(nèi)經(jīng)數(shù)代無(wú)性繁殖后形成A型裂殖體。A型裂殖體的出現(xiàn)，標(biāo)志著弓形蟲(chóng)的有性生殖即將開(kāi)始。通常弓形蟲(chóng)包囊感染貓12 h后，小腸上皮細(xì)胞中就會(huì)出現(xiàn)A型裂殖體。在配子體出現(xiàn)之前，小腸上皮細(xì)胞中同時(shí)存在5種不同形態(tài)，包括A型、B型、C型、D型以及E型裂殖體（圖1），但這5種無(wú)性生殖階段的裂殖體與速殖子在核內(nèi)的染色、理化性質(zhì)等方面都存在差異，且不同形態(tài)的裂殖體間生物學(xué)性狀也各不相同[17]。3～15 d后，貓的整個(gè)小腸中都存在配子體，主要集中在回腸。形成合子后，隨之形成卵囊壁，隨后小腸上皮細(xì)胞破裂，卵囊進(jìn)入小腸腔內(nèi)（圖1）。

圖1 弓形蟲(chóng)在貓小腸上皮細(xì)胞內(nèi)有性發(fā)育的過(guò)程[18] Fig. 1 Diagram representing the sexual development of Toxoplasma gondii in small intestinal epithelial cell of cat

貓感染弓形蟲(chóng)后1～6 d，速殖子出現(xiàn)于小腸的固有層中，在淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞內(nèi)的納蟲(chóng)泡（parasitophorous vacuole，PV）中寄生，在納蟲(chóng)泡中有一個(gè)管狀囊泡形的膜網(wǎng)結(jié)構(gòu)（tubulovesicular membrane network, TMN）。電子顯微鏡掃描顯示，C型、D型和E型裂殖體與幾乎所有的等孢球蟲(chóng)裂殖體一樣[19]，缺少TMN結(jié)構(gòu)，并且PV膜的厚度逐漸增厚。D型、E型裂殖體以及配子體的PV膜由2～4個(gè)電子致密膜融合而成。B型和C型裂殖體在小腸上皮的淋巴細(xì)胞內(nèi)發(fā)育成熟，但B型裂殖體沒(méi)有殘余小體（residual body）。D型和E型裂殖體的主要區(qū)別在于每個(gè)裂殖體內(nèi)裂殖子的數(shù)量以及裂殖子的大小不同。貓感染弓形蟲(chóng)后4～6 d，配子體和卵囊形成，只存在于小腸上皮細(xì)胞內(nèi)，而包括小腸上皮淋巴細(xì)胞在內(nèi)的其他細(xì)胞中均未發(fā)現(xiàn)配子體[17]。

3 流行病學(xué)與分型

近年來(lái)，隨著寵物貓數(shù)量的增多，貓與人類的關(guān)系越來(lái)越密切，貓科動(dòng)物感染弓形蟲(chóng)也因此愈發(fā)受到人們關(guān)注。貓科動(dòng)物作為弓形蟲(chóng)的唯一終末宿主，是傳播弓形蟲(chóng)病的主要傳染源之一，具有重大公共衛(wèi)生學(xué)意義。由于貓科動(dòng)物感染弓形蟲(chóng)后多呈亞臨床癥狀，所以血清學(xué)和分子生物學(xué)檢測(cè)成為研究貓弓形蟲(chóng)病流行的主要手段。貓弓形蟲(chóng)病的流行具有明顯的地理差異，世界平均感染率達(dá)30%～40%[1]，野貓的感染水平普遍高于家貓。非洲、歐洲部分地區(qū)感染率高于世界平均感染水平，如埃及野貓血清檢測(cè)弓形蟲(chóng)陽(yáng)性率高達(dá)97.4%[1]，阿爾巴尼亞貓弓形蟲(chóng)感染率為62.3%[20]，土耳其貓弓形蟲(chóng)感染率為40.3%～76%[1,21]，芬蘭貓的弓形蟲(chóng)感染率為48.4%[22]，拉脫維亞感染率為51.6%[23]，法國(guó)為58.95%[24]，愛(ài)莎尼亞為60.8%[25]，西班牙為24.2%～57.18%[26-27]。亞洲大部分地區(qū)貓弓形蟲(chóng)感染率普遍低于世界平均水平，如科威特貓弓形蟲(chóng)感染率為19.6%[28]，伊拉克為30.4%[29]，斯里蘭卡科倫坡為30.2%[30]，韓國(guó)為2.2%～47.2%[31-33]，泰國(guó)為4.8%～11%[34-35]，伊朗為40%[36]，馬來(lái)西亞為14.5%、日本為9%～16.14%[37,38]，新加坡為30.3%[1]。美洲國(guó)家巴為8%～84.4%[39-42]，美國(guó)為6%～66.7%[43-45]。

我國(guó)貓弓形蟲(chóng)感染與世界平均感染率大致相當(dāng)，約4%～79.4%，地理差異較明顯[46]。中南部省份貓弓形蟲(chóng)感染率高于西北、東北等地貓弓形蟲(chóng)的感染率，且同一地區(qū)，家貓的感染率普遍低于流浪貓（表1）。

表1 我國(guó)貓弓形蟲(chóng)病流行病學(xué)調(diào)查及基因分型鑒定Table 1 Epidemiological and typing of T. gondii in cats in China

目前，對(duì)于弓形蟲(chóng)基因型的鑒定主要通過(guò)PCRRFLP方法[71]，在ToxoDB網(wǎng)站可查閱到412株貓?jiān)垂蜗x(chóng)蟲(chóng)株。ToxoDB網(wǎng)站僅顯示了我國(guó)的70株分離株，對(duì)其中36株進(jìn)行了基因分型，除TgCtPCR1和TgCtPCR3分離株的基因型為T(mén)oxo DB#18外，其余分離株均為T(mén)oxo DB#9。Dubey等[72]首次報(bào)道了廣州貓?jiān)垂蜗x(chóng)蟲(chóng)株的基因型為T(mén)oxoDB#9。此后，發(fā)現(xiàn)該型還主要流行于云南、河南省豬群中[73-74]。北京市分離出的11株貓?jiān)垂蜗x(chóng)株，經(jīng)鑒定均為T(mén)oxoDB#9型[47]。Wang等[75]報(bào)道徐州市貓?jiān)创嬖诠蜗x(chóng)基因I型。朱長(zhǎng)東[76]在徐州市分離了6株貓?jiān)垂蜗x(chóng)株，包括ToxoDB#9和ToxoDB#205兩種基因型。Tian等[51]在我國(guó)云南省分離出16株弓貓?jiān)葱蜗x(chóng)分離株，經(jīng)PCR-RFLP分型鑒定發(fā)現(xiàn)其中11株為T(mén)oxoDB#9，2株為T(mén)oxoDB#255，其余分別為T(mén)oxoDB#3、ToxoDB#20以及基因Ⅱ型。由此可見(jiàn)，我國(guó)貓?jiān)垂蜗x(chóng)的基因多樣性很低，Toxo DB#9為流行的主要基因型。

4 貓弓形蟲(chóng)疫苗

弓形蟲(chóng)疫苗種類繁多，包括全蟲(chóng)疫苗、蟲(chóng)體特異組分疫苗、基因工程疫苗等。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，弓形蟲(chóng)疫苗在實(shí)驗(yàn)研究中取得了一定的進(jìn)展，但是距離實(shí)際應(yīng)用還有一定的距離。通過(guò)免疫的方式，能夠阻止家貓不向環(huán)境中排放卵囊[77]。但是，對(duì)于野生的貓科動(dòng)物，由于不能全覆蓋接種免疫，因而免疫作用不大。目前，對(duì)于貓弓形蟲(chóng)疫苗的研究很少，弓形蟲(chóng)緩殖子的突變體（T-263）是首次報(bào)道的貓弓形蟲(chóng)疫苗[78]。口服T-263緩殖子后，對(duì)84%的貓有免疫效果，不排卵囊[78-79]。Omata等[80]對(duì)弓形蟲(chóng)速殖子Beverly株用60Co輻照，然后免疫貓，對(duì)部分貓可以起到不排卵囊的效果，但是這種方法造價(jià)高，而且需要冷凍。為了彌補(bǔ)這一缺陷，弓形蟲(chóng)排泄粗抗原以及過(guò)濾性病毒載體等已經(jīng)應(yīng)用于在新型貓弓形蟲(chóng)疫苗的研究中。貓科動(dòng)物病毒1型（FHV1）載體表達(dá)的弓形蟲(chóng)ROP2蛋白，作為疫苗能夠降低貓腦中的弓形蟲(chóng)包囊的數(shù)量，但是不能阻止卵囊的排放[81]。用Quil-A作為佐劑，與純化的弓形蟲(chóng)棒狀體粗抗原混合后免疫貓，能夠誘導(dǎo)保護(hù)卵囊的排放[82]。Zulpo等[83]進(jìn)一步比較研究了通過(guò)注射和口服的方式免疫貓后，引起的免疫應(yīng)答效果以及卵囊的排放情況。結(jié)果顯示這兩種方式都能夠引起貓血清中的抗體水平升高以及腸內(nèi)免疫應(yīng)答，與對(duì)照組相比，都能夠顯著性降低卵囊的排放，注射的方法比口服的方法效果更好。研究結(jié)果為積極探索用疫苗方法阻斷貓弓形蟲(chóng)病奠定了基礎(chǔ)，但由于僅停留在實(shí)驗(yàn)水平，與可應(yīng)用于臨床獸醫(yī)弓形蟲(chóng)病的防治要求相差甚遠(yuǎn)。

5 診斷方法

通常貓感染弓形蟲(chóng)后，沒(méi)有明顯的臨床癥狀，呈隱性感染。因此，貓弓形蟲(chóng)病的診斷主要通過(guò)病原學(xué)、免疫學(xué)以及分子生物學(xué)等方法進(jìn)行檢測(cè)。其中免疫學(xué)方法是貓弓形蟲(chóng)病臨床診斷和流行病學(xué)調(diào)查的主要方法[84]。

弓形蟲(chóng)免疫學(xué)診斷方法包括染色試驗(yàn)（dye test，DT）、凝集試驗(yàn)（agglutination test，AT）、改良凝集試驗(yàn)（modified agglutination test，MAT）、乳膠凝集試驗(yàn)（latex agglutination，LA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）、間接血凝試驗(yàn)（indirect hemagglutination test，IHA）、間接熒光抗體試驗(yàn)（indirect fluorescent antibody test，IFAT）、免疫膠體金技術(shù)等。Ozkan等[85]比較了DT和IFAT對(duì)貓血液樣本中弓形蟲(chóng)抗體的檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)DT的敏感性更高。Mac rì等[86]用IFAT和MAT檢測(cè)貓血清中弓形蟲(chóng)IgG抗體，發(fā)現(xiàn)MAT特異性和敏感性高，更適合貓血清弓形蟲(chóng)的檢測(cè)。Zhu等[87]比較MAT和ELISA檢測(cè)結(jié)果，發(fā)現(xiàn)MAT更適合貓弓形蟲(chóng)抗體的檢測(cè)。因此，MAT用于貓科動(dòng)物的檢測(cè)更為普遍。MAT方法是由Desmonts和Remington[88]以及Dubey和Desmonts[89]在Fulton和Turk[90]發(fā)明的凝集試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，經(jīng)改進(jìn)后建立的一種針對(duì)動(dòng)物弓形蟲(chóng)病檢測(cè)的方法。利用弓形蟲(chóng)的蟲(chóng)體抗原與待檢血清中弓形蟲(chóng)特異性IgG抗體發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生凝集現(xiàn)象，通過(guò)伊文氏藍(lán)染色，使得陰、陽(yáng)性結(jié)果在藍(lán)色背景下更容易觀察。由于實(shí)驗(yàn)前，血清樣品經(jīng)β-巰基乙醇處理，將IgM蛋白變性直接檢測(cè)IgG抗體，克服了直接凝集試驗(yàn)特異性不強(qiáng)的缺點(diǎn)。近年來(lái)，膠體金技術(shù)發(fā)展十分迅速，適宜在基層獸醫(yī)門(mén)診中推廣應(yīng)用，具有較大的臨床應(yīng)用價(jià)值和較好的臨床推廣前景。

6 貓弓形蟲(chóng)病及弓形蟲(chóng)卵囊相關(guān)的組學(xué)研究

隨著“后基因組”時(shí)代的到來(lái)，對(duì)于轉(zhuǎn)錄組、蛋白組和代謝組等組學(xué)方面的研究方興未艾。這些組學(xué)的發(fā)展為我們了解病原的致病機(jī)理及宿主與病原的相互作用挖掘了大量數(shù)據(jù)，提供了新的思路，奠定了研究基礎(chǔ)。應(yīng)用iTRAQ與LC-MS/MS聯(lián)合的方法測(cè)定孢子化與未孢子化弓形蟲(chóng)卵囊的蛋白質(zhì)組學(xué)，共鑒定出2095個(gè)蛋白，其中587個(gè)為差異蛋白。差異蛋白主要參與氨基酸和糖代謝的信號(hào)通路。推測(cè)這些蛋白可能與弓形蟲(chóng)卵囊孢子化過(guò)程相關(guān)[91]。將孢子化卵囊感染小鼠后，測(cè)定小鼠血清的代謝組學(xué)，共鑒定出3871個(gè)陽(yáng)性分子和2825個(gè)陰性分子。在弓形蟲(chóng)孢子化卵囊急性感染的小鼠血清中，檢測(cè)到甘油磷脂代謝、氨基酸合成和酪氨酸代謝過(guò)程發(fā)生紊亂，提示這些過(guò)程可能參與了弓形蟲(chóng)早期感染，為下一步研究和診斷由卵囊感染導(dǎo)致的弓形蟲(chóng)病奠定基礎(chǔ)[92]。將弓形蟲(chóng)基因II型的包囊感染貓7 d后，與未感染弓形蟲(chóng)包囊的貓肝臟進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)比較，發(fā)現(xiàn)82個(gè)弓形蟲(chóng)的差異表達(dá)基因和5690個(gè)宿主差異表達(dá)的基因[93]。宿主差異表達(dá)的基因主要與細(xì)胞凋亡過(guò)程相關(guān)[81]。

盡管這些組學(xué)研究?jī)H僅是利用生物信息學(xué)方法對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了歸納整理，尚未通過(guò)進(jìn)一步研究驗(yàn)證預(yù)測(cè)結(jié)果是否成立。但是，統(tǒng)計(jì)出的新數(shù)據(jù)可以為今后深入研究貓弓形蟲(chóng)病，弓形蟲(chóng)卵囊發(fā)育及致病機(jī)制提供新的思路或研究方向。

7 展望

貓科動(dòng)物是弓形蟲(chóng)的唯一終末宿主，是造成弓形蟲(chóng)基因型多樣性和廣泛流行的主要因素。我國(guó)弓形蟲(chóng)的基因型較南美等地變異率低，但最近幾年檢測(cè)顯示逐步有新的基因型出現(xiàn)。在繼續(xù)進(jìn)行家貓弓形蟲(chóng)流行病學(xué)調(diào)查的同時(shí)，開(kāi)展流浪貓和野生貓科動(dòng)物的弓形蟲(chóng)流行病學(xué)調(diào)查，有助于更全面的掌握我國(guó)弓形蟲(chóng)基因型的流行情況，從而為防控奠定基礎(chǔ)。研制針對(duì)貓弓形蟲(chóng)病的特效藥物或疫苗，是防控各種動(dòng)物弓形蟲(chóng)病的關(guān)鍵。如果可以利用藥物治療或免疫預(yù)防的方法控制貓科動(dòng)物弓形蟲(chóng)病的發(fā)生，便可通過(guò)治療或凈化等方法逐步減少弓形蟲(chóng)感染的中間宿主的數(shù)量，從而達(dá)到徹底消滅各種動(dòng)物弓形蟲(chóng)病的目的。使用多種抗原混合的DNA疫苗免疫貓科動(dòng)物，阻止其排出卵囊是研制貓弓形蟲(chóng)疫苗的方向之一。

目前對(duì)弓形蟲(chóng)如何入侵貓小腸上皮細(xì)胞以及如何完成配子發(fā)育等關(guān)鍵問(wèn)題尚未明確，亦未研制出有效的貓弓形蟲(chóng)病的快速檢測(cè)方法、疫苗或藥物。近幾年興起的貓弓形蟲(chóng)病組學(xué)的研究，篩選出大量弓形蟲(chóng)有性發(fā)育過(guò)程中的關(guān)鍵分子與基因。弓形蟲(chóng)感染貓腸上皮細(xì)胞的早期便向有性生殖過(guò)程轉(zhuǎn)變，理論上，這一階段的差異表達(dá)基因參與了弓形蟲(chóng)的有性發(fā)育過(guò)程，但目前尚未見(jiàn)關(guān)于這個(gè)發(fā)育時(shí)期的研究報(bào)道。隨著人們對(duì)貓弓形蟲(chóng)病致病機(jī)理的不斷深入探究，必將揭開(kāi)弓形蟲(chóng)在貓?bào)w內(nèi)有性生殖的神秘面紗，進(jìn)而為研制適用于貓科動(dòng)物的新型抗弓形蟲(chóng)疫苗或藥物奠定基礎(chǔ)，從而達(dá)到徹底防控弓形蟲(chóng)病的目的。