胡曉魯，張 婷，蘭海玲,3，李雪松，楊健美，滕巧泱，陳鴻軍，李澤君，劉芹防，關(guān)平原

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學獸醫(yī)學院，呼和浩特010018；2. 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所，上海200241；3.黑龍江大學生命科學學院，哈爾濱150080）

豬流感（swine influenza，SI）是由豬流感病毒（swine influenza virus，SIV）引起的一種嚴重的呼吸道傳染病，其特點是急性、熱性和高度接觸性，臨床以高熱、呼吸困難、咳嗽、衰竭、迅速康復或死亡為特征[1]。豬流感病毒屬正黏病毒科、A型流感病毒屬，為單股、負鏈、分節(jié)段RNA病毒，基因組由8個獨立RNA片段構(gòu)成[2]：PB1、PB2、PA、NP、HA、NA、M和NS，分別編碼聚合酶（PB1、PB2和PA）、核蛋白（NP）、血凝素（HA）、神經(jīng)氨酸酶（NA）、基質(zhì)蛋白（M1和M2）、核輸出蛋白（NEP）以及非結(jié)構(gòu)蛋白（NS1和NS2）[3-4]。

1930年，美國首次報道了豬流感，現(xiàn)已遍布世界各地[5]。目前，全球流行的豬流感病毒主要亞型為H1N1、H1N2和H3N2 。H1N1亞型病毒分為古典型和類禽源型，H3N2亞型病毒為類人源型，H1N2亞型病毒由H1N1、H3N2亞型病毒重組產(chǎn)生[6-7]。1930年首次分離到豬流感病毒屬經(jīng)典H1N1亞型[8]，1979年分離到歐洲類禽H1N1豬流感病毒[9]。1969年中國臺灣省首次分離到豬流感病毒，1970年病毒傳到香港和大陸。由于豬呼吸道上皮細胞具有唾液酸α2,3 受體和α2,6 受體，所以豬被認為是人對禽流感病毒適應(yīng)過程的中間宿主，同時也是流感病毒重組和復制的“混合器”[10]。豬流感病毒不經(jīng)過重組就能感染人和禽類，在對流感病毒流行、跨種傳播的研究以及公共衛(wèi)生方面，豬流感病毒都具有重要意義[11]，成為流感病毒研究的熱點[12]。8質(zhì)粒拯救系統(tǒng)是利用RNA 聚合酶Ⅰ和RNA 聚合酶Ⅱ啟動轉(zhuǎn)錄的雙向系統(tǒng)，其特點是完全以質(zhì)粒為基礎(chǔ)，不需要任何輔助質(zhì)粒，避免了大量的篩選工作，對病毒基因組的操作更加方便，成為拯救流感病毒的重要工具，大大促進了對病毒致病機理的研究與疫苗研發(fā)[13]。

山東省某發(fā)病豬場豬群有明顯的高熱、咳嗽、呼吸困難等癥狀，發(fā)病率較高，死亡率低。本研究采集了豬咽喉棉拭子，并成功分離到1株H1N1亞型豬流感病毒，序列分析結(jié)果顯示此毒株為歐洲類禽豬流感H1N1亞型病毒。體外復制試驗結(jié)果顯示，分離病毒在ST細胞上可以高效繁殖，而在MDCK細胞中復制水平較差。利用RT-PCR將分離病毒的8個基因片段擴增后克隆到8質(zhì)粒拯救系統(tǒng)中，并成功拯救出該株豬流感病毒，測序結(jié)果顯示拯救病毒與野生毒株序列完全一致。反向遺傳系統(tǒng)的建立為歐洲類禽H1N1亞型豬流感病毒基因組結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，流感病毒跨種傳播的機制以及新型豬流感疫苗株的進一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞與質(zhì)粒293T細胞、MDCK細胞、ST細胞、pLLB-A、pLLB-G雙向表達流感病毒反向遺傳系統(tǒng)載體為本實驗室保存。9～11日齡SPF雞胚購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑反轉(zhuǎn)錄試劑購自TaKaRa公司；PCR試劑（Phanta）和ClonExpress? II重組克隆試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶STUI、DNP1購自NEB公司；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)液、MEM培養(yǎng)液、Opti-MEM培養(yǎng)液、青霉素鏈霉素混合液（SP）和TPCK胰酶購自美國Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA）購自Sigma公司；轉(zhuǎn)染試劑Mirus購自BIO公司；RNA提取試劑盒購自Tiangen公司；凝膠回收試劑盒和小劑量質(zhì)粒抽提試劑盒購自Axygen公司；大劑量質(zhì)粒抽提試劑盒購自Qiagen公司。

1.3 病毒分離鑒定采集發(fā)病豬咽喉棉拭子，加入2 mLPBS，離心收集上清。取100 μL上清（其余保存于-80℃冰箱）經(jīng)尿囊腔接種9～11日齡SPF雞胚，37℃孵育，收集48 h后未死亡有血凝活性的雞胚尿囊液，保存于-80℃冰箱備用。

1.4 反向遺傳質(zhì)粒的構(gòu)建使用RNA提取試劑盒提取病毒RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以通用引物進行PCR擴增目的基因，電泳后膠回收擴增產(chǎn)物。將PLLB-A、PLLB-G載體經(jīng)StuI內(nèi)切酶酶切，電泳后進行膠回收。利用重組克隆試劑盒，將目的片段與載體的膠回收產(chǎn)物進行同源重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，12 h后挑取單個菌落進行菌液PCR鑒定。陽性質(zhì)粒送公司測序，選取無突變的克隆進行質(zhì)粒大量提取，測定濃度后用于病毒拯救。

表1 PCR引物信息Table 1 Sequence of PCR primers in this study

1.5 病毒全基因組測序與Blast分析將構(gòu)建好的反向遺傳質(zhì)粒，使用載體引物pLLB-F、pLLB-R測序。利用SeqMan軟件組裝基因組，對全基因組進行Blast，分析與分離病毒最接近的病毒亞型與來源。

1.6 病毒拯救使用含有10%FBS和1%SP的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)293T細胞，將細胞傳至6孔板。當細胞密度超過80%時，進行轉(zhuǎn)染。將8 μg質(zhì)?；旌衔铮? μg/質(zhì)粒）和24 μL轉(zhuǎn)染試劑分別溶于250 μL OPTIMEM無血清培養(yǎng)基中，室溫靜置5 min后相互混勻，結(jié)合30 min。棄掉6孔板中的細胞生長液，PBS輕洗1次， 再加入1.5 mL OPTI-MEM無血清培養(yǎng)基，將質(zhì)粒與轉(zhuǎn)染試劑的混合物 (共500 μL)均勻加入，在37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h。轉(zhuǎn)染的同時，設(shè)立只加2 mL OPTI-MEM無血清培養(yǎng)基作為對照組。

轉(zhuǎn)染48 h后，在96孔血凝板中測定血凝滴度。取50 μL細胞上清與50 μL PBS混勻，進行8個滴度的倍比稀釋后，每孔加入50 μL 0.7 %雞紅細胞，靜置30 min后觀察結(jié)果。

1.7 拯救病毒在MDCK與ST細胞中復制能力比較用含有10%FBS和1% SP的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)ST細胞，以含有5% FBS和1% SP的MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)MDCK細胞，將細胞傳至6孔板。當細胞密度超過80%時，進行接毒。棄掉6孔板中的細胞生長液后用PBS輕洗細胞2次，每孔加入1.5 mL維持液（MDCK為4%BSA、1% SP、1‰ TPCK胰酶的MEM培養(yǎng)液；ST為4%BSA、1% SP、1‰ TPCK胰酶的DMEM培養(yǎng)液）；然后每孔再加入500 μL轉(zhuǎn)染后的細胞上清，在37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，連續(xù)傳3代。接毒48 h后，收集細胞上清測定血凝滴度。若有血凝活性，將病毒收集，凍存于-80℃冰箱。

為了比較分離病毒在不同細胞中的復制能力，將MDCK細胞、ST細胞分別傳至T25細胞瓶。當細胞密度超過80%時，每瓶用PBS洗2次后加入維持液5 mL。按照接毒劑量稀釋病毒至1 mL，加入瓶中，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。分別在第12、24、36、48 h，每瓶取細胞上清300 μL保存至-80℃，然后每瓶補充300 μL細胞維持液，每個時間點做3個重復。最后對每個時間段收取的樣品測定TCID50，利用GraghPad Prism 5 Project軟件畫圖。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離鑒定將處理后的樣品接種9～11日齡SPF雞胚，72 h后收集雞胚尿囊液。檢測結(jié)果顯示病毒的HA滴度為22，具有血凝活性。將HA陽性的尿囊液接種MDCK細胞，接種后72 h，出現(xiàn)細胞病變，細胞變圓、脫落，而對照組細胞狀態(tài)保持完好（圖1）。MDCK細胞上清進行血凝活性測定，結(jié)果為22。

圖1 分離到豬流感病毒在MDCK細胞中產(chǎn)生細胞病變Fig.1 Cytopathic effect(CPE) caused by SIV in MDCK cells

2.2 分離病毒的基因擴增與質(zhì)粒構(gòu)建結(jié)果使用流感病毒通用引物對病毒cDNA進行PCR，可擴增出8個目的基因片段（圖2～5）。將反向遺傳質(zhì)粒pLLB載體進行酶切。原質(zhì)粒為超螺旋結(jié)構(gòu)，因此擴增條帶在線性化質(zhì)粒的下方，電泳結(jié)果顯示酶切成功（圖6）?；厥彰盖泻蟮腜LLB載體，分別與擴增的8個基因片段進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH52感受態(tài)細胞，然后進行菌液PCR鑒定。鑒定結(jié)果為陽性的菌液送公司測序，并對測序結(jié)果進行Blast比對。結(jié)果顯示8個片段均來源于歐亞類禽豬流感分支，表明質(zhì)粒構(gòu)建成功。從陰性菌液中提取質(zhì)粒，測定濃度和OD值后分裝，進行病毒拯救。

圖2 分離毒株NP、PA基因片段PCR 擴增結(jié)果Fig.2 PCR result of NP and PA gene segments from isolated strain

圖3 分離毒株P(guān)B1、PB2基因片段PCR 擴增結(jié)果Fig.3 PCR result of PB1 and PB2 gene segments from isolated strain

圖4 分離毒株HA、NA基因片段PCR 擴增結(jié)果Fig.4 PCR result of HA and NA gene segments from isolated strain

2.3 分離病毒全基因組測序與Blast分析Blast結(jié)果顯示這8個基因片段與歐洲類禽豬流感H1N1病毒的相似性均大于等于95%（表2）。其中PB1、HA、M、NS基因都與A/Jiangsu/ALS1/2011(H1N1)較為接近，說明這兩個毒株存在較近的親緣關(guān)系。

2.4 病毒拯救結(jié)果及驗證將拯救的病毒接種在MDCK細胞上，48 h后出現(xiàn)細胞病變，傳3代后，上清中血凝效價為22。將拯救病毒接種到ST細胞上，48 h后出現(xiàn)細胞病變，傳3代后，上清中的血凝效價為26，說明本分離毒株更適應(yīng)豬的ST細胞。將拯救病毒進行全基因組測序，結(jié)果顯示拯救的病毒與野生型的病毒序列完全一致，將拯救的毒株命名為A/swine/Shandong/1/2016(H1N1)。

圖5 分離毒株M、NS基因片段PCR 擴增結(jié)果Fig.5 PCR result of M and NS gene segments from isolated strain

圖6 反向遺傳質(zhì)粒PLLB載體酶切鑒定結(jié)果Fig.6 Identification of endonuclease reaction

表2 分離毒株8個基因片段的同源性分析Table.2 Homology analysis of genes fragments from isolated strain by Blast

2.5 病毒在MDCK與ST細胞中復制能力比較為了進一步比較分離毒株在不同細胞中的復制能力，將拯救的病毒分別接種到MDCK和ST細胞，不同時間點收集樣品進行滴度測定。結(jié)果顯示本研究中分離的病毒在ST細胞中復制水平顯著高于在MDCK細胞中復制水平，感染MDCK后12 、24、36 h，上清中的病毒滴度均低于TCID50檢測下限（TCID50）。生長曲線結(jié)果顯示本分離毒株可以很好的適應(yīng)ST細胞，但在MDCK細胞中適應(yīng)性較差，具體的分子機制需要進一步研究。

圖7 分離毒株在不同細胞上的生長曲線Fig.7 Growth dynamics of rescues virus in ST cells and MDCK cells

3 討論

豬流感具有世界性發(fā)生和流行性的特點，遍及世界各大洲。由于豬對禽流感和人流感病毒都易感，不同病毒同時感染豬后可在豬體內(nèi)發(fā)生重排，生成具有新基因型的病毒，因而豬被認為是新型流感病毒的混合器。2009年發(fā)生的甲型H1N1流感病毒也是豬-人-禽流感病毒的三源重配病毒。因此，進行豬流感的監(jiān)測和病毒特性的系統(tǒng)研究對流感大流行的預警具有重要的意義。

2000年以前，我國大陸豬群中較少有豬流感暴發(fā)的新聞報道。2000年以后，豬流感的活動性明顯增強，某些地區(qū)的抗體陽性率高達80%。中國豬群中主要流行的豬流感病毒包括經(jīng)典H1N1亞型、歐洲類禽H1N1亞型、H1N2亞型以及H3N2亞型流感病毒。1991年我國豬群中首次分離到經(jīng)典H1N1亞型SIV[14]，2000年后經(jīng)典H1N1 SIV的流行性顯著提高，但2007年后歐洲類禽H1N1病毒逐漸取代經(jīng)典H1N1病毒成為我國豬群中的優(yōu)勢毒株[15-16]。調(diào)查結(jié)果顯示，2009年大流行的甲型H1N1、經(jīng)典H1N1、歐洲類禽H1N1以及北美三源重排H3N2等多種亞型SIV在我國豬群中共流行，不同病毒之間的基因重排現(xiàn)象頻繁發(fā)生。2009大流行的甲型H1N1流感病毒爆發(fā)后迅速回傳到豬群，并與豬群中流行的豬流感病毒發(fā)生基因重排[17-19]。我國多個地區(qū)的豬群中均分離到歐洲類禽H1N1 SIV與H1N1/2009的重排病毒。研究表明，歐洲類禽豬流感H1N1病毒不僅能在豬之間有效傳播，而且可以通過氣溶膠方式在雪貂間傳播，其潛在的分子機制尚不清楚[20]。

MDCK細胞是流感病毒敏感細胞系，但本研究中分離的毒株在MDCK細胞中的復制能力較弱，具體原因與機制需要進一步研究。本研究成功構(gòu)建的分離毒株的反向遺傳學系統(tǒng)，為研究歐洲類禽H1N1豬流感病毒的復制及致病性分子機理提供了工具。