仝晴晴，楊 利，喬緒穩(wěn)，陳 瑾，張元鵬，鄭其升，牛家強(qiáng)，侯繼波

（1. 西藏農(nóng)牧學(xué)院動物科學(xué)學(xué)院，西藏 860000；2. 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，江蘇 210014）

蛋白純化是疫苗制備中十分重要的一步，純化標(biāo)簽是可用于純化多種靶蛋白的工具。如何通過廉價高效的方法對目的蛋白進(jìn)行快速的純化是研究中急需被攻破的課題[1]。內(nèi)含肽自我剪切的發(fā)現(xiàn)為快速高效純化目的蛋白奠定了基礎(chǔ)[2]。內(nèi)含肽是前體未成熟蛋白的一段具有自我剪接功能的多肽鏈。1990 年，第一個內(nèi)含肽釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）VMA1被發(fā)現(xiàn)[3]，隨后內(nèi)含肽在蛋白質(zhì)純化、蛋白質(zhì)連接、環(huán)肽制備、蛋白標(biāo)記以及生物傳感器等方面被廣泛應(yīng)用[4-5]。112 aa的N片段和35 aa的C片段組成的工程化的NpuDnaE內(nèi)含肽能夠在沒有N-末端剪切的情況下快速催化C-末端剪切[6-8]。NpuDnaE突變體表現(xiàn)出硫代依賴性的C末端快速剪切[9-10]，將錨鉤蛋白（protein anchor）定位到內(nèi)含肽N片段的N末端，可避免N片段和C片段之間相互作用的潛在空間位阻，使得超快速剪切成為可能[1,11]。

GEM（gram positive enhancer matrix）顆粒是乳酸菌經(jīng)熱酸處理，去除細(xì)菌原有蛋白質(zhì)和核酸等大分子物質(zhì)后獲得的細(xì)胞壁肽聚糖骨架[12]，具有特異性非共價結(jié)合細(xì)菌細(xì)胞壁水解酶C端結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)（protein anchor，PA）的特性[13]。GEM與含3個LysMs的PA（PA3）的結(jié)合活性高于含2個LysMs的PA（PA2）[14]。因此，與PA3連接的內(nèi)含肽及目的蛋白，可以高密度地展示在GEM顆粒表面形成沉淀[15]，僅需低速離心即可純化目的蛋白。

天然干擾素制備工藝復(fù)雜、產(chǎn)量低、成本高，而利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)外源蛋白操作簡單，成本低廉、可控性好[16]。本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)開發(fā)了斷裂型NpuDnaE內(nèi)含肽介導(dǎo)的基于GEM展示平臺的蛋白純化方法，其中N和C外顯子被錨鉤蛋白（PA3）和目的蛋白（CaIFN-α）取代，利用GEM顆粒與錨鉤蛋白的特異性結(jié)合得到較為純凈的蛋白GEM-PA3-NC1A，再利用斷裂型NpuDnaE內(nèi)含肽的N端和C端結(jié)合獲得融合蛋白GEM-PA3-NC1AC*-CaIFN-α，最后利用內(nèi)含肽的硫代剪切特性獲得純凈的目的蛋白CaIFN-α[17]（圖1）。本研究將斷裂型NpuDnaE內(nèi)含肽與GEM展示系統(tǒng)結(jié)合，建立了一種簡潔高效的蛋白純化方法，并以犬α干擾素（CaIFN-α）為目的蛋白驗證了該方法的可行性，同時確定了蛋白純化的最佳條件。

圖1 蛋白表達(dá)與純化示意圖Fig.1 Schematic of protein expression and purification

1 材料和方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞和病毒內(nèi)含肽N端和錨鉤蛋白的重組表達(dá)質(zhì)粒pQZ-NC1A-PA3以及內(nèi)含肽C端表達(dá)質(zhì)粒pET-C*由本實驗室保存；含有犬α干擾素基因的重組質(zhì)粒pMD18-CaIFN-α由江蘇省農(nóng)科院獸醫(yī)研究所王永山研究員提供；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α和BL21 由本實驗室保存；犬腎細(xì)胞（madindarby canine kidney，MDCK）、水皰性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV，107.0TCID50/mL）由本實驗室保存。

1.2 主要試劑限制性內(nèi)切酶NheI、EcoR I、T4 DNA連接酶購自TaKaRa 公司；DTT和EDTA購自Sigma公司；瓊脂粉、蛋白胨、氯化鈉、氯化鋅等常規(guī)試劑為國產(chǎn)分析純；所有緩沖液使用ddH2O制備。

1.3 引物設(shè)計根據(jù) GenBank 中公布的CaIFN-α基因序列進(jìn)行優(yōu)化后，在編碼成熟蛋白基因的兩端設(shè)計引物，為方便基因操作在5'和3'端分別加入NheI、EcoR I酶切位點。上下游引物序列：5'-GCTAGCTGCCATCTGCCGGATACC-3'，5'-GAATTC GCTTATTTGCGGCGACGAATACGT TCC-3'，由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成。

1.4 CaIFN-α基因的克隆與表達(dá)載體的構(gòu)建通過PCR從pMD18-CaIFN-α質(zhì)粒中擴(kuò)增獲得CaIFN-α基因，克隆至pMD18-T載體，送TaKaRa 公司進(jìn)行測序以確定序列的正確性。PCR擴(kuò)增體系為50 μL：1 μL pMD18-CaIFN-α質(zhì)粒作為模板，25 μL master mix（TaKaRa Japan）和1 μL正向和反向引物。PCR循環(huán)參數(shù)：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸30 s；一次最終變性在72℃延伸5 min。將pMD18-T-CaIFN-α和pET-C*質(zhì)粒分別用NheI和EcoR I雙酶切，電泳回收酶切產(chǎn)物，用T4 DNA連接酶于16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆菌，提取質(zhì)粒后經(jīng)NheI和EcoR I雙酶切鑒定。

1.5 重組菌的誘導(dǎo)表達(dá)及蛋白提取將pQZ-NC1A-PA3和pET-C*-CaIFN-α重組表達(dá)載體分別轉(zhuǎn)化至BL21感受態(tài)細(xì)胞中，挑選陽性克隆菌于 LB 培養(yǎng)液（含適宜抗生素）中，37℃過夜培養(yǎng)，次日將5 mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移至400 mL LB培養(yǎng)基中，并在37℃下生長直至OD600約為0.6。加入阿拉伯糖和IPTG（0.2 mmol/L）在15℃誘導(dǎo)表達(dá)24 h后，4℃、8000×g離心10 min，收獲細(xì)胞，在蒸餾水中洗滌2次。然后將pQZNC1A-PA3和pET-C*-CaIFN-α分別重懸于緩沖液A（0.5 mol/LNaCl、10 mmol/LTris-HCl，pH8.0）和緩沖液B（0.5 mol/LNaCl、50 mmol/LNaPOi,pH 6.0）中。超聲破碎細(xì)胞，4℃、12 000×g離心10 min，收集可溶性裂解物，用0.45 μm濾器過濾，并保存于-80℃。利用SDS-PAGE鑒定蛋白的表達(dá)及蛋白可溶性。

1.6 CaIFN-α蛋白的純化

1.6.1 NC1A-PA3與GEM顆粒的結(jié)合及鑒定 取出10 U制備好的GEM顆粒，離心后用20 mL含有NC1A-PA3可溶性裂解物的緩沖液A重懸，室溫下緩慢轉(zhuǎn)動孵育1 h。離心收集沉淀，將沉淀用等體積緩沖液B洗滌3次，最后1次洗滌緩沖液中含有0.5 mmol/L ZnCl2。SDSPAGE鑒定結(jié)合結(jié)果。

1.6.2 內(nèi)含肽的結(jié)合及鑒定 將洗滌后的沉淀加至等體積的含C*-CaIFN-α可溶性裂解物的緩沖液B中重懸，17℃緩慢轉(zhuǎn)動孵育3 h。離心收集沉淀，用等體積的緩沖液A洗滌3次，SDS-PAGE鑒定結(jié)合結(jié)果。

1.6.3 內(nèi)含肽剪切及內(nèi)毒素的去除 將沉淀用4 mL含有DTT或EDTA的緩沖液A重懸，4℃緩慢轉(zhuǎn)動孵育過夜。剪切后離心，收集上清和沉淀，進(jìn)行SDSPAGE分析。通過3 kDa超濾離心柱（Amicon Ultra，Millipore，Billerica，MA）濃縮純化的蛋白質(zhì)，經(jīng)NanoDrop 1000（Thermo Fisher Scientific）測定OD280值。

1.7 微量細(xì)胞病變抑制法為測定上述純化得到的目的蛋白的抗病毒活性，先將犬腎細(xì)胞 (MDCK) 接種于96孔板，5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)至單層，加入倍比稀釋的干擾素作用18 h后，每孔再加入100 TCID50的VSV，同時設(shè)置陰性對照組，48～72 h后觀察細(xì)胞病變結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 重組表達(dá)載體的鑒定將PMD18-T-CaIFN-α和pET-C*質(zhì)粒分別用NheI和EcoR I酶切，將回收純化的大小片段連接后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞，提取的質(zhì)粒經(jīng)酶切電泳鑒定分離出約 520 bp的小片段即為CaIFN-α，證實在pET-C*中插入了CaIFN-α基因，所得質(zhì)粒命名為PET-C*-CaIFN-α。

2.2 重組質(zhì)粒的表達(dá)及可溶性鑒定收集表達(dá)后的菌體，按1.5中方法進(jìn)行裂菌處理，取裂解液的上清和沉淀進(jìn)行 SDS-PAGE電泳分析。結(jié)果顯示，pQZNC1A-PA3表達(dá)產(chǎn)物的相對分子量約為37 kDa，pETC*-CaIFN-α表達(dá)產(chǎn)物的相對分子量約為26 kDa，兩種菌體蛋白表達(dá)總量較大，上清中均存在目的蛋白，雜蛋白較多（圖2）。

圖2 重組 pQZ-NC1A-PA3和pET-C*-CaIFN-α表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE of recombinant pQZ-NC1A-PA3 and pETC*-CaIFN-α expression in E.coli

2.3 CaIFN-α蛋白的純化

2.3.1 NC1A-PA3與GEM顆粒的結(jié)合及鑒定 利用GEM顆粒與錨鉤蛋白非特異性結(jié)合的特性，將NC1A-PA3蛋白吸附于GEM顆粒上，形成GEM-PA3-NC1A沉淀（圖3）。因總蛋白量較多，結(jié)合過程中其他雜蛋白也會吸附在GEM顆粒表面，但不影響純化結(jié)果。

2.3.2 內(nèi)含肽的結(jié)合及鑒定 利用內(nèi)含肽的結(jié)合特性，將C*-CaIFN-α與GEM-PA3-NC1A沉淀結(jié)合形成GEM-PA3-NC1A-C*-CaIFN-α沉淀（圖4）。結(jié)合過程中可適當(dāng)濃縮以提高純化蛋白的濃度。

2.3.3 內(nèi)含肽剪切及蛋白純化 將內(nèi)含肽結(jié)合后沉淀用含DTT或EDTA的緩沖液A重懸，利用DTT和EDTA對內(nèi)含肽反式剪切的催化作用，將目的蛋白還原為可溶性的CaIFN-α蛋白，離心棄去的沉淀為GEM-PA3-NC1A-C*及其他吸附在GEM顆粒上的雜蛋白。經(jīng)SDS-PAGE電泳后染色，結(jié)果如圖5所示，純化后緩沖液上清中雜蛋白很少，純化效果良好，且EDTA的剪切效果較DTT更好。

2.4 CaIFN-α蛋白的活性測定應(yīng)用MDCK-VSV系統(tǒng)微量細(xì)胞病變抑制法測定純化后的CaIFN-α蛋白活性。結(jié)果顯示接種VSV 48 h后，純化的犬α干擾素的抗病毒比活性為3.0×106U/mL。

3 討論

分別表達(dá)內(nèi)含肽的兩個片段，讓其在體外相互識別結(jié)合并完成剪接反應(yīng)，可以解決提前斷裂的問題，且其反應(yīng)速率并未受到影響[18-19]。內(nèi)含肽改造是通過突變剪接結(jié)構(gòu)模塊中的保守氨基酸，尤其是疏水氨基酸，使剪接反應(yīng)只能完成一端的斷裂[20-21]。有研究通過突變內(nèi)含肽內(nèi)部的2個氨基酸為Cys，使其與首位氨基酸Cys之間形成二硫鍵，從而抑制斷裂反應(yīng)提前進(jìn)行[22]。Asp118 是阻止NpuDnaE C 端斷裂反應(yīng)的關(guān)鍵因素[10]，將Asp118 突變?yōu)镚ly后，可解除N端突變對C端斷裂反應(yīng)的抑制。天然斷裂型NpuDnaE 內(nèi)含肽的斷裂反應(yīng)速率較快，改造后的NpuDnaE 內(nèi)含肽不僅剪切速率提高，而且避免了提前斷裂的發(fā)生。Zn2+通過抑制蛋白質(zhì)剪接過程中的電荷傳遞影響內(nèi)含肽剪接反應(yīng)，使剪切反應(yīng)無法順利進(jìn)行[23]。雖然DTT與Zn2+的結(jié)合能力強(qiáng)于內(nèi)含肽與Zn2+的結(jié)合，但比金屬螯合劑（EDTA）的結(jié)合能力弱，因此可通過EDTA將Zn2+從內(nèi)含肽中去除以恢復(fù)剪接反應(yīng)[24]。

圖3 GEM顆粒與NC1A-PA3結(jié)合的SDS-PAGE分析Fig.3 SDS-PAGE of NC1A-PA3 incubation with GEM

圖5 GEM-PA3-NC1A-C*-CaIFN-α融合蛋白剪切的SDSPAGE分析Fig.5 SDS-PAGE of cleavage of GEM-PA3-NC1A-C*-CaIFN-α fusion protein.

GEM表面展示系統(tǒng)已應(yīng)用于許多疫苗研發(fā)中。Bosma等[12]利用該系統(tǒng)研制了瘧原蟲表面抗原MSA2的亞單位疫苗。人肺炎鏈球菌粘膜疫苗[25]、鼠疫LcrV亞單位疫苗等[26]，以及多價苗的研制都利用了GEM表面展示系統(tǒng)。本實驗室利用GEM表面展示系統(tǒng)濃縮純化了O型口蹄疫病毒滅活抗原[27]和豬繁殖與呼吸綜合征病毒[15]。

本研究建立了一種基于GEM展示平臺，由斷裂型NpuDnaE內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白純化方法，簡便易操作：利用GEM顆粒沉淀可溶的目的蛋白，不需要對包涵體進(jìn)行變性復(fù)性等復(fù)雜操作，蛋白損失較??；利用內(nèi)含肽剪切不需要昂貴的酶和幾丁質(zhì)柱子等額外成本，僅依靠還原劑DTT或EDTA，通過離心即可獲取較為純凈的目的蛋白；不需要層析介質(zhì)，避免了層析介質(zhì)與配基蛋白片段結(jié)合不穩(wěn)定而造成的蛋白脫落。同時，IN與IC在體外結(jié)合作用更強(qiáng)，可以減少目標(biāo)蛋白中出現(xiàn)前體蛋白[28]。結(jié)果表明，將非層析標(biāo)簽與斷裂內(nèi)含肽系統(tǒng)相結(jié)合構(gòu)建的純化系統(tǒng)為純化目的蛋白提供了一種新思路，成本低，易于操作與放大，具有廣闊的應(yīng)用前景。