豆春峰，王 芳，胡序明，歐陽(yáng)娟，陳世豪，賈崇信，薛松磊，徐 慧，齊田羽，耿拓宇，崔恒宓,4,5,6

（1.揚(yáng)州大學(xué)表觀遺傳學(xué)及表觀基因組學(xué)研究所，揚(yáng)州225009；2.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)和技術(shù)學(xué)院，揚(yáng)州225009；3. 揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚(yáng)州225009；4.揚(yáng)州大學(xué)比較醫(yī)學(xué)研究院，揚(yáng)州225009；5.江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州225009；6.教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州225009）

自從1957年上市以來(lái)，二甲雙胍（metformin）應(yīng)用于Ⅱ型糖尿病臨床治療已有60年的歷史[1]。二甲雙胍是AMPK-LKB1信號(hào)通路的激活劑[2]，可以在肝細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、胰島β細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)抑制線粒體呼吸鏈復(fù)合體I即NADH-Q氧化還原酶的作用[3]，造成線粒體生物氧化功能減弱，從而激活單磷酸腺苷依賴(lài)的蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）的氧化磷酸化。AMPK一旦被激活，即可抑制糖類(lèi)、脂肪和蛋白質(zhì)合成，刺激脂肪酸的氧化和肝臟組織對(duì)葡萄糖的吸收利用，維持能量代謝平衡[4]。二甲雙胍還可通過(guò)降低胰島素和胰島素結(jié)合蛋白水平來(lái)間接降低IGF-1水平，進(jìn)而產(chǎn)生抗腫瘤細(xì)胞增殖作用[5]。近年來(lái)，針對(duì)二甲雙胍臨床價(jià)值的研究越來(lái)越多，新的作用也不斷被發(fā)現(xiàn)。慢性丙型肝炎病毒感染者在接受二甲雙胍、IFN-α和利巴韋林聯(lián)合治療時(shí)，持續(xù)病毒學(xué)應(yīng)答比率（sustained virological response，SVR）增加[6]。Tsai等[7]研究表明二甲雙胍可通過(guò)AMPK途徑來(lái)激活I(lǐng)型干擾素抗病毒信號(hào)通路（type I IFN antiviral pathway），并且可以抑制丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus，HCV）的復(fù)制。

禽白血病是由禽C型反轉(zhuǎn)錄病毒群禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引發(fā)的多種腫瘤性疾病的統(tǒng)稱(chēng)。根據(jù)ALV中和反應(yīng)類(lèi)型、宿主范圍、囊膜特性等將其劃分為A到J 10個(gè)亞群[8]。J 亞群ALV（ALV-J）是20世紀(jì)80年代末期新發(fā)現(xiàn)的白血病病毒的新亞群，可引起骨髓樣細(xì)胞瘤為主的白血病[9]。常維山等[10]在2007～2009 年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，很多地區(qū)蛋雞發(fā)病雞群中白血病發(fā)病率為5%～20%。ALV可經(jīng)蛋由親代向子代發(fā)生垂直傳播，子代可對(duì)ALV產(chǎn)生免疫耐受，但也可成為重要傳染源，通過(guò)垂直傳播形成代代相傳[11]。水平傳播也是ALV重要的傳播方式。ALV可引起感染雞群生產(chǎn)性能下降，達(dá)不到預(yù)期產(chǎn)蛋率，蛋品質(zhì)降低[12]。此外，禽白血病也可影響T、B淋巴細(xì)胞的成熟及分化，引起雞群的免疫抑制[13]，繼發(fā)多種免疫抑制病，使其更易受到細(xì)菌和病毒的感染。

ALV在畜牧獸醫(yī)上日益受到重視，如果驗(yàn)證二甲雙胍具有抑制ALV增殖的作用，那么將在家禽業(yè)的疾病防控中具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、新生牛血清FBS和0.25%胰蛋白酶均購(gòu)自GIBCO公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 和熒光染料試劑SYBR Premix ExTaqⅡ購(gòu)自日本TaKaRa公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純；雞巨噬細(xì)胞HD11和J亞群禽白血病病毒ALV-J由揚(yáng)州大學(xué)焦新安教授饋贈(zèng)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)使用含有1%雙抗和10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基，在41℃、5% CO2培養(yǎng)箱中對(duì)雞巨噬細(xì)胞系HD11進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 藥物處理和病毒感染將雞巨噬細(xì)胞HD11接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，用2 mmol/L 二甲雙胍對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，設(shè)置對(duì)照，48 h后收集HD11細(xì)胞用于RT-qPCR檢測(cè)。將雞巨噬細(xì)胞HD11細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，然后將ALV-J接種于細(xì)胞孔中（MOI=5）。病毒感染細(xì)胞24 h后進(jìn)行二甲雙胍藥物處理。RT-qPCR檢測(cè)引物根據(jù)GenBank公布的序列，采用Primer premier 6.0軟件設(shè)計(jì)并委托Invitrogen公司合成（表1）。

表1 熒光定量PCR檢測(cè)引物Table 1 Primers for RT-qPCR

1.4 總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和RT-qPCR采用Trizol法提取經(jīng)藥物處理48 h的細(xì)胞總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser將1 μg總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，經(jīng)稀釋后通過(guò)CFX ConnectTM熒光定量 PCR 檢測(cè)系統(tǒng)進(jìn)行定量分析。反應(yīng)體系：cDNA 模板1 μL、SYBR Green II 10 μL、上下游引物各2 μL、超純水4.6 μL。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，40個(gè)循環(huán)。TLR3、IFIH1、IRF7、IFN-α、IFN-β、STAT1、ALVE1、EAV-HP和Ovex1 為檢測(cè)基因，GAPDH和β-actin基因作為內(nèi)參。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定采用IDEXX公司提供的ALV抗原抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)ALV-J感染上清進(jìn)行ELISA檢測(cè)。首先取出抗體包被板，分別加入未經(jīng)稀釋的陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和待檢樣品，室溫孵育1 h；洗滌3次后加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的（兔）抗p27抗體，室溫孵育1 h；洗滌3次后每孔加入TMB底物溶液，室溫孵育15 min，加入終止液，終止反應(yīng)。最后，通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定A650。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析和作圖統(tǒng)計(jì)分析和作圖采用SPSS軟件（version 16.0）和GraphPad（Prism 5）軟件進(jìn)行。所有數(shù)據(jù)以±s表示，P＜0.05表示差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01表示差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 二甲雙胍處理后天然免疫相關(guān)基因表達(dá)變化對(duì)雞巨噬細(xì)胞HD11進(jìn)行二甲雙胍處理48 h后，采用RT-qPCR檢測(cè)天然免疫相關(guān)基因TLR3、IFIH1、IRF7、STAT1、IFN-α和IFN-β表達(dá)情況。結(jié)果顯示這些基因的表達(dá)顯著上調(diào)（圖1）。與對(duì)照組相比，STAT1表達(dá)差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，F(xiàn)C＞2），其余基因表達(dá)差異均具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01，F(xiàn)C＞2）。這些基因均在抗病毒天然免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，因此，二甲雙胍可能通過(guò)激活天然免疫以發(fā)揮抗病毒功能。

圖1 二甲雙胍處理HD11細(xì)胞后天然免疫相關(guān)基因表達(dá)變化（**P＜0.01,*P＜0.05）Fig.1 Effects of metformin on the expression of innate immune-related genes in HD11(**P＜0.01,*P＜0.05)

2.2 二甲雙胍處理后內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)變化用2 mmol/L二甲雙胍處理HD11細(xì)胞48 h后，采用RT-qPCR檢測(cè)內(nèi)源性病毒ALVE1、EAV-HP和Ovex1表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，二甲雙胍處理HD11細(xì)胞48 h后激活了雞內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒ALVE1、EAV-HP和Ovex1表達(dá)，且表達(dá)差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖2）。

2.3 二甲雙胍處理對(duì)病毒增殖的影響ALV-J病毒感染HD11細(xì)胞24 h后進(jìn)行二甲雙胍處理，48 h后分別收集細(xì)胞和病毒上清進(jìn)行檢測(cè)。RT-qPCR結(jié)果顯示，二甲雙胍抑制了ALV-Jenv基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，差異具有極顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）（圖3A）。ELISA結(jié)果顯示，二甲雙胍處理48 h抑制了ALV-J p27蛋白（ALV-Jgag基因產(chǎn)物）的表達(dá)，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖3B）。

圖2 二甲雙胍處理HD11細(xì)胞后內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒表達(dá)變化（**P＜0.01）Fig.2 Effects of metformin on the expression of endogenous virus in HD11(**P＜0.01)

圖3 二甲雙胍處理HD11細(xì)胞后病毒復(fù)制水平變化（**P＜0.01,*P＜0.05）Fig.3 Effects of metformin on the virus replication in HD11(**P＜0.01,*P＜0.05)

3 討論

ALV是在畜牧獸醫(yī)上日益受到重視的一種病原體，但由于目前尚無(wú)有效的疫苗和特效藥物來(lái)控制雞群感染，只能通過(guò)選育抗病品系來(lái)控制發(fā)病率或者通過(guò)雞場(chǎng)種群凈化來(lái)淘汰感染雞群[10]。二甲雙胍不僅可以治療糖尿病，還具有抑制腫瘤、抗衰老等作用。本研究在雞巨噬細(xì)胞HD11中觀察到，二甲雙胍可以顯著抑制ALV-J的增殖，說(shuō)明二甲雙胍具有抗病毒的功能。巨噬細(xì)胞是一種天然的免疫細(xì)胞，是研究抗病毒功能的理想細(xì)胞。。

二甲雙胍可能通過(guò)AMPK途徑來(lái)激活HD11的某些天然免疫信號(hào)通路來(lái)抑制ALV的增殖。研究表明，二甲雙胍可通過(guò)激活A(yù)MPK來(lái)激活I(lǐng)型干擾素抗病毒信號(hào)通路[7]。本研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍誘導(dǎo)了一系列與抗病毒天然免疫相關(guān)基因的表達(dá)：TLR3、IFIH1、IRF7、STAT1、IFN-α和IFN-β，其中IFN-α和IFN-β都屬于I型干擾素。干擾素（interferon，IFN）是由病毒和其他一些干擾素誘導(dǎo)劑，刺激巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及體細(xì)胞所產(chǎn)生的一種糖蛋白，具有免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和誘導(dǎo)分化的作用。它與細(xì)胞靶受體結(jié)合，誘導(dǎo)抗病毒蛋白（antiviral protein, AVP）的生成，抑制病毒的增殖[14]。TLR3是雞體識(shí)別RNA病毒的主要識(shí)別受體，與其特異性配體結(jié)合后，啟動(dòng)雞體內(nèi)天然免疫的信號(hào)級(jí)聯(lián)傳導(dǎo)，從而誘導(dǎo)抗病毒物質(zhì)產(chǎn)生[15]。

二甲雙胍的抗病毒機(jī)制也可能與激活內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒，從而激活細(xì)胞天然免疫有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)二甲雙胍顯著激活了內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒（endogenous retrovirus，ERV）的表達(dá)。某些內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒在不同的哺乳動(dòng)物基因組中可作為干擾素誘導(dǎo)基因的增強(qiáng)子，調(diào)節(jié)臨近干擾素誘導(dǎo)基因的表達(dá)[16]。研究表明，ERV與細(xì)胞天然免疫密切相關(guān)，具有保護(hù)細(xì)胞免受感染的作用。ERV激活表達(dá)可能會(huì)產(chǎn)生某些dsRNA、lncRNAs或蛋白質(zhì)，它們具有一些病毒特征，從而被宿主天然免疫系統(tǒng)識(shí)別[17]。有研究表明，ERV衍生的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）可作為T(mén)oll樣受體和天然免疫作用的調(diào)節(jié)因子[18]，參與抗病毒反應(yīng)。

本研究結(jié)果表明二甲雙胍具有抗病毒作用，其抗病毒機(jī)制可能與細(xì)胞天然免疫應(yīng)答的激活和內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒有關(guān)。二甲雙胍處理可以顯著激活雞巨噬細(xì)胞HD11的天然免疫應(yīng)答，從而抑制禽白血病病毒在巨噬細(xì)胞中的復(fù)制水平。如果二甲雙胍抑制ALV增殖可以進(jìn)一步在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中被加以驗(yàn)證，將給禽白血病的治療帶來(lái)新的曙光。