劉 濤，黃 元，陳錦良，向 華，肖少波，王曉虎，陳 晶，向 蓉，何繼軍，鄭海學(xué)

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所 廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實(shí)驗(yàn)室 廣東省畜禽疫病防治研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學(xué)觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，廣州 510640；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院、動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，武漢 430070；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所，蘭州 730070）

近年來，一種新型病毒正在席卷美國(guó)、加拿大、巴西、澳大利亞、新西蘭等地，豬感染后產(chǎn)生類似水泡樣病變，這種新型的病毒被命名為塞尼卡病毒A（SenecavirusA，SVA）[1]。2002年研究人員首次在人類胚胎成視網(wǎng)膜細(xì)胞培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)SVA，認(rèn)為它可能是通過胎牛血清或豬胰蛋白酶引入培養(yǎng)物中的污染物[2]。SVA屬小RNA病毒科[3]。SVA具有非常強(qiáng)大的溶瘤特性，能夠選擇性感染并裂解腫瘤[4]。我國(guó)2015年檢測(cè)分離到首例SVA毒株CH-01-2015[5]。

口蹄疫（foot-and-mouth disease，F(xiàn)MD）是一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，致病原為口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）。FMD臨床表現(xiàn)為發(fā)熱，唇部、口腔粘膜、蹄部出現(xiàn)水泡性病變，傳播范圍廣，危害性大，被國(guó)際動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）列為18種A類動(dòng)物傳染病之首。

SVA和FMDV同為小RNA病毒，感染癥狀相似，均表現(xiàn)為口鼻和蹄部出現(xiàn)囊泡樣癥狀，臨床診斷不易區(qū)分。本研究針對(duì)這2種病毒的基因序列合成特異性引物，建立了一種能同時(shí)檢測(cè)鑒別SVA和FMDV的雙重RT-PCR方法。

1 材料與方法

1.1 病毒與樣品FMDV由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所保存提供；SVA分離自廣東省某豬場(chǎng)發(fā)病豬水泡皮，在PK-15細(xì)胞上增殖；PK-15細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物衛(wèi)生研究所保存。10份樣品采集自廣東省某豬場(chǎng)。

1.2 主要試劑TaKaRa ExTaqDNA聚合酶、pMD19-T質(zhì)粒和DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自寶生物工程（大連）有限公司；病毒RNA/DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小量快速抽提試劑盒購自美基生物科技有限公司；口蹄疫病毒通用型RT-PCR檢測(cè)試劑盒購自北京世紀(jì)元亨動(dòng)物防疫技術(shù)有限公司。

1.3 引物合成針對(duì)FMDV UTR序列的口蹄疫通用引物[6]，以及針對(duì)SVA VP1基因的引物[7]（表1）由華大基因有限公司合成。

表1 雙重RT-PCR引物相關(guān)信息Table 1 Related information of double RT- PCR primers

1.4 引物驗(yàn)證取A型FMDV、O型FMDV和SVA按照病毒RNA/DNA提取試劑盒說明書方法提取RNA，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將病毒RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板進(jìn)行單引物單模板PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為25 μL：TaKaRa ExTaq聚合酶0.5 μL，上游引物和下游引物各0.5 μL，模板cDNA為0.5 μL，剩余用去離子水補(bǔ)足。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72℃再延伸10 min，4℃保存。 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行點(diǎn)樣，90 V電泳25 min后，觀察擴(kuò)增條帶。

1.5 陽性克隆質(zhì)粒的構(gòu)建將FMDV和SVA擴(kuò)增得到的目的PCR產(chǎn)物用凝膠回收試劑盒進(jìn)行回收，并連接至pMD19-T載體，構(gòu)建分別含有上述2種病毒的5'UTR基因和VP1-2A基因片段的的陽性克隆質(zhì)粒。1.6 反應(yīng)體系優(yōu)化 將2種病毒的cDNA作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為25 μL：TaKaRa ExTaqDNA聚合酶0.5 μL、引物2 μL（每個(gè)引物0.5 μL）、模板1 μL、2種質(zhì)粒各0.5 μL，用去離子水補(bǔ)至25 μL。PCR擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性1 min，55℃ 退火1 min，72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行點(diǎn)樣，90 V電泳25 min后，觀察擴(kuò)增條帶。

將雙重RT-PCR體系中濃度為10 μmol/L的引物依次以0.25 μL增加，從0.25 μL加至1.25 μL，退火溫度范圍設(shè)置為53℃～58℃，篩選出雙重RT-PCR的最佳反應(yīng)條件。

1.7 特異性試驗(yàn)采用優(yōu)化后的雙重RT-PCR擴(kuò)增體系和擴(kuò)增條件，對(duì)豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus，PCV）、豬細(xì)小病毒（Porcine parvovirus，PPV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive respiratory syndrome virus，PRRSV）、豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）、H5N1型禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）、豬瘟病毒（Swine fever virus，SFV）、豬水皰病毒（Vesicular stomatitis virus，VSV）、豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）、FMDV和SVA提取總核酸，作為模板進(jìn)行雙重RT-PCR和PCR，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照，檢測(cè)雙重RT-PCR的特異性。

1.8 敏感性試驗(yàn)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)2種病毒的陽性克隆質(zhì)粒的濃度，并計(jì)算拷貝數(shù)。對(duì)陽性克隆質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，使質(zhì)粒濃度為108～101copies/μL。分別取相同濃度的2種病毒質(zhì)?；旌献鳛槟０澹凑找呀?jīng)優(yōu)化后的雙重RT-PCR反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增，分析雙重RT-PCR反應(yīng)的敏感性。

1.9 樣品檢測(cè)結(jié)果的驗(yàn)證將所有已檢組織病料樣品進(jìn)行冰上研磨和抗生素處理后，分別接種PK15和BHK21細(xì)胞，盲傳10代。將所有病料及最終代次的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物進(jìn)行總核酸提取，用商品化試劑盒進(jìn)行FMDV檢測(cè)，并按照文獻(xiàn)[7] 進(jìn)行針對(duì)SVA的RTPCR檢測(cè)。根據(jù)文獻(xiàn)擴(kuò)增SVA的VP1基因，回收陽性PCR產(chǎn)物并送往華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 引物特異性驗(yàn)證利用不同的引物對(duì)，對(duì)A型FMDV、O型FMDV和SVA進(jìn)行單模板PCR檢測(cè)，以驗(yàn)證引物的特異性。結(jié)果顯示引物特異性良好，以不同的cDNA作為模板，均能以對(duì)應(yīng)的引物擴(kuò)增到相應(yīng)的目的片段（圖1）。

圖1 SVA、A型FMDV和O型FMDV單重RT-PCR結(jié)果Fig.1 PCR results of SVA and FMDV type A/O

2.2 擴(kuò)增條件的優(yōu)化對(duì)FMDV和SVA的引物濃度和退火溫度進(jìn)行了優(yōu)化。以各cDNA作為模板，雙重RT-PCR反應(yīng)體系中最佳引物終濃度分別為0.2 μmol/L（FMDV）、0.5 μmol/L（SVA）（圖2）；最佳退火溫度為57℃（圖3）。最佳反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min；94℃變性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸10 min，4℃保存。

圖2 FMDV和SVA不同引物終濃度雙重RT-PCR結(jié)果Fig.2 Double RT-PCR results for SVA and FMDV in different concentration of primers

圖3 不同退火溫度下SVA和FMDV的雙重RT-PCR結(jié)果Fig.3 Double RT-PCR results for FMDV and SVA at different annealing temperature

2.3 特異性結(jié)果分析利用優(yōu)化好的雙重RT-PCR反應(yīng)條件，對(duì)FMDV和SVA cDNA模板隨機(jī)混合并進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，結(jié)果含有FMDV和SVA的核酸樣品均能擴(kuò)增出目的條帶，且無其他非特異性條帶（圖4）。PRRSV、PPV、PRV、VSV、H5N1、HCV、PCV、PEDV核酸樣品進(jìn)行雙重PCR擴(kuò)增，結(jié)果均為陰性（圖5）。

圖4 SVA和FMDV雙重PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.4 Double RT-PCR results of FMDV and SVA

2.4 敏感性結(jié)果分析在FMDV和SVA引物終濃度分別為0.2 μmol/L、0.5 μmol/L時(shí)，該雙重RTPCR能檢出的最低拷貝數(shù)分別為103copies/μL（FMDV）、104copies/μL（SVA）（圖6）。

圖6 SVA和FMDV雙重RT-PCR敏感性檢測(cè)Fig.6 The sensitivity of double RT-PCR for SVA and FMDV

2.5 樣品檢測(cè)結(jié)果應(yīng)用雙重RT-PCR方法對(duì)臨床送檢的10份樣品和細(xì)胞培養(yǎng)的病毒進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，F(xiàn)MDV和SVA細(xì)胞培養(yǎng)物檢測(cè)為陽性，有2份樣品檢測(cè)為SVA陽性，其余樣品均為陰性。

2.6 樣品檢測(cè)結(jié)果驗(yàn)證雙重RT-PCR方法檢測(cè)為SVA陽性的病料，處理后接種PK15細(xì)胞，盲傳3～5代后均發(fā)生病變。將檢測(cè)為SVA陰性的病料接種BHK-21細(xì)胞，盲傳10代均未發(fā)生病變。所有病料和最終代次的細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)物，分別進(jìn)行FMDV和SVA的RT-PCR鑒定，結(jié)果均與本研究建立的雙重RT-PCR結(jié)果一致。SVA陽性病料VP1基因測(cè)序結(jié)果上傳至GenBank，登錄號(hào)分別為MG557660和MG557661。

3 討論

從2008年開始，研究人員陸續(xù)在美國(guó)中西部地區(qū)和巴西部分地區(qū)豬場(chǎng)檢測(cè)到SVA[2]。SVA感染的臨床表現(xiàn)和口蹄疫極其相似：口腔粘膜、舌頭、蹄冠和鼻子充滿液體或破裂的囊泡；妊娠或分娩母豬厭食，無生殖障礙；仔豬體型肥胖，肌無力，食欲不振，嗜睡，唾液分泌過多，皮膚充血，腹瀉，并且伴有神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)，部分仔豬會(huì)突然死亡[8]。我國(guó)2015年首次在廣東省某豬場(chǎng)檢測(cè)到SVA，同年擴(kuò)散至我國(guó)中部地區(qū)[9]，1～4日齡的仔豬感染后死亡率可達(dá)30%～70%[5,10-12]。分析2015～2016年我國(guó)報(bào)道的塞尼卡病例后發(fā)現(xiàn)，SVA能夠?qū)е履肛i的生產(chǎn)性能下降。SVA現(xiàn)已蔓延至廣東、福建、河南、湖北、江西等多個(gè)省份，引發(fā)的經(jīng)濟(jì)損失已經(jīng)不可估量[13]。

多重PCR（multiplex PCR）由Chambercian等于1988年提出[14-15]，該技術(shù)以其效率高，成本低，速度快等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于基因組結(jié)構(gòu)與功能基因及數(shù)量性狀基因座的定位研究中[16]。雙重RT-PCR通過在同一個(gè)反應(yīng)體系中加入兩對(duì)不同的引物，能夠擴(kuò)增出兩條特異性條帶。本研究建立的雙重RTPCR方法特異性和敏感性良好，能夠很好的區(qū)分出SVA和FMDV的不同核酸片段大小，對(duì)臨床檢測(cè)具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

雙重RT-PCR結(jié)果可受到很多因素的影響，其中最重要的一點(diǎn)就是引物的設(shè)計(jì)。設(shè)計(jì)的兩種引物在目的基因上面無交叉擴(kuò)增反應(yīng)，不會(huì)形成引物二聚體，且目的片段大小相差200 bp以上。本研究利用FMDV 5'UTR序列基因進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，由于5'-UTR區(qū)域比較保守，對(duì)尚未傳入亞洲的SAT1/2/3型擴(kuò)增效率較低，可適用于A、O、C和Asia I型FMDV的擴(kuò)增檢測(cè)[6]。SVA則利用報(bào)道過的VP1序列合成引物。利用NCBI在線引物設(shè)計(jì)工具，使兩對(duì)引物的Tm值控制在同一溫度附近，保證核酸擴(kuò)增的效率。

已知FMDV共存在7種血清型，其中O型和A型分別于2010年和2013年在廣東省暴發(fā)，并在全國(guó)多個(gè)省份流行，是當(dāng)前FMDV在我國(guó)流行的主要血清型。FMDV與SVA無論是臨床表現(xiàn)還是分子結(jié)構(gòu)都具有高度相似性，對(duì)于這兩種病毒進(jìn)行有效的臨床鑒別診斷，在防控中具有重要的意義。本研究建立的雙重RT-PCR檢測(cè)方法能夠快速有效的檢測(cè)出SVA和FMDV，為兩種病毒的鑒別診斷提供了重要工具。