秦小勇 張冉

【摘要】 目的 探索踝管綜合征是否對大鼠糖尿病足病變的發(fā)展有促進(jìn)作用。方法 鏈脲佐菌素（55 mg/kg）腹腔注射制備糖尿病大鼠;將糖尿病大鼠后肢隨機(jī)分為卡壓組（A組）、松解組（B組），在A組大鼠一側(cè)后肢踝管處血管、神經(jīng)行卡壓手術(shù)，在B組大鼠一側(cè)后肢踝管處血管、神經(jīng)行探查手術(shù)，同時在A組、B組大鼠一側(cè)足底制作創(chuàng)面，6周后取材制作病理切片，顯微鏡下觀察踝管處血管、神經(jīng)及足底創(chuàng)面的組織病理學(xué)改變。結(jié)果 A組與B組比較，A組大鼠足底創(chuàng)面組織中的血管、血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯減少，A組大鼠足底創(chuàng)面組織中的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、神經(jīng)生長因子（NGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）表達(dá)明顯降低，平均光密度相對值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<001）。結(jié)論 踝管綜合征對大鼠糖尿病足病變的發(fā)展有明顯促進(jìn)作用。

【關(guān)鍵詞】 糖尿病足;糖尿病大鼠;踝管綜合征

中圖分類號：R688 ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.05.003

【Abstract】 Objective To explore whether tarsal tunnel syndrome can promote the development of diabetic foot disease in rats.Methods Diabetic rats were prepared by intraperitoneal injection of streptozotocin（55 mg/kg）.The hindlimbs of diabetic rats were randomly divided into compression group（group A） and loose group（group B）.In the group A， the vessels and nerves in the ankle canal of one hind limb of rats were given compression operation，while the vessels and nerves in the ankle canal of one hind limb of rats in the group B were given exploratory operation.At the same time，wounds were made on one side of feet of rats in the group A and the group B.After 6 weeks，pathological sections were taken to observe the histopathological changes of blood vessels，nerves and plantar wounds in ankle canal under microscope.Results Compared with the group B，the vascular and vascular endothelial cells in the plantar ulcer tissue of the group A significantly reduced.The expressions of vascular endothelial growth factor（VEGF），nerve growth factor（NGF） and basic fibroblast growth factor（bFGF） in plantar wound tissue of rats in the group A significantly decreased，and difference of the relative values of average optical density between the two groups was statistically significant（P<0.01）.Conclusion Tarsal tunnel syndrome can promote the development of diabetic foot lesions in rats.

【Key words】 diabetic foot;diabetic rats;tarsal tunnel syndrome

隨著糖尿病患者日益增多，糖尿病足（Diabetic Foot）患者也隨之增多。踝管綜合征（Tarsal tunnel syndrome）也稱跗管綜合征，指脛神經(jīng)或其分支、終末支在內(nèi)踝后下方的相應(yīng)管道內(nèi)受到擠壓而產(chǎn)生的局部或足底放射性疼痛、麻木的神經(jīng)綜合征[1]。糖尿病足患者合并踝管綜合征時病情發(fā)展變得更加復(fù)雜，此類疾病的治療及研究鮮有報道，僅有個別文獻(xiàn)報道提及部分糖尿病患者出現(xiàn)此病癥狀[2]?；颊啧坠芗磅坠苌舷麓嬖诙喟l(fā)神經(jīng)、血管的嚴(yán)重病變，通過高頻彩色多普勒對患者踝管處血管、神經(jīng)的掃描[3]得到證實(shí)。踝管綜合征如何影響糖尿病足病變發(fā)展的機(jī)制尚未清楚，因此根據(jù)糖尿病足合并踝管綜合征患者病變特點(diǎn)設(shè)計近似實(shí)際病變的動物模型，探索病變發(fā)展過程中糖尿病足皮膚、血管、神經(jīng)病變組織的病理學(xué)改變。

1 資料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計 采取隨機(jī)對照動物實(shí)驗(yàn)方法。實(shí)驗(yàn)過程中對動物的處置符合2006年科技部關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動物的規(guī)章。

1.2 時間及地點(diǎn) 于2016年12月～2017年6月在柳州市人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)中心動物實(shí)驗(yàn)室完成。

1.3 實(shí)驗(yàn)材料 SPF級6周齡SD大鼠50只，體重（20944±18.61）g。動物來源于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法 將鏈脲佐菌素（Streptozoticin，STZ，Sigma公司）溶于0.1 mol/L 新鮮枸櫞酸/枸櫞酸鈉緩沖液中（pH 4.5），SD大鼠禁食12 h后按55 mg/kg劑量一次性腹腔注射1.2%STZ。于72 h時后測空腹血糖（FPG），選取FPG連續(xù)維持在16.7 mmol/L以上的SD大鼠，飼養(yǎng)2周后空腹采尾靜脈血，以血糖分析儀測定，F(xiàn)PG>11.1 mmol/L為造模成功[4] 。選取其中造模成功SD大鼠40只飼養(yǎng)2周，按隨機(jī)數(shù)字表分為卡壓組（A組）與松解組（B組）各20只，予0.3%戊巴比妥鈉溶液（1 mL/100 g）腹腔麻醉， A組大鼠一側(cè)后肢踝管處血管、神經(jīng)行卡壓手術(shù)。為保持良好的卡壓效果，自行設(shè)計切取5 mm×5 mm淺筋膜條，顯微鏡下顯露血管、神經(jīng)鞘后將筋膜條環(huán)繞一周，以顯微縫線固定并環(huán)扎血管、神經(jīng)3道，每道縫線間隔約2 mm。卡壓成功標(biāo)準(zhǔn)：顯微鏡下觀察神經(jīng)表面動脈受壓，但血流尚未完全阻斷?？p合關(guān)閉切口。B組大鼠一側(cè)后肢踝管處血管、神經(jīng)行探查手術(shù)后關(guān)閉切口。同時兩組大鼠手術(shù)側(cè)足底相同部位使用直徑3 mm金屬棒明火加熱2分鐘后，直接燒灼5秒鐘制備直徑約3 mm足底創(chuàng)面。

1.5 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本收集及檢測方法 A組、B組大鼠飼養(yǎng)6周，予0.3%戊巴比妥鈉溶液（1 mL/100 g）腹腔麻醉，行手術(shù)側(cè)后肢踝管處神經(jīng)、血管及足底創(chuàng)面組織取材，標(biāo)本經(jīng)生理鹽水沖洗后，立即使用4%多聚甲醛溶液中固定24小時，經(jīng)梯度酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋，做連續(xù)切片，常規(guī)HE染色和免疫組化染色標(biāo)記足底創(chuàng)面組織切片中的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、神經(jīng)生長因子（NGF）、堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF）。免疫組化圖像使用Image-pro plus 進(jìn)行分析并測算平均光密度相對值。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)：α=0.05，雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié) ?果2.1 糖尿病大鼠一般情況 造模前大鼠反應(yīng)良好，毛發(fā)光潔，飲食、大小便正常，行動靈敏，行STZ腹腔注射后3～7天，大鼠開始出現(xiàn)明顯多尿、多飲、多食癥狀，毛發(fā)污黃，光澤度差，活動力明顯降低。連續(xù)2周多次測定FPG為（20.37±4.18）mmol/L，糖尿病大鼠造模成功。

2.2 糖尿病足大鼠病變發(fā)展情況 A組大鼠術(shù)后3天出現(xiàn)明顯的肢體腫脹，足底創(chuàng)面周圍腫脹尤其明顯。3周時A組足底創(chuàng)面明顯擴(kuò)大，且肢體腫脹明顯;B組大鼠足底創(chuàng)面無明顯擴(kuò)大，肢體腫脹不明顯。6周實(shí)驗(yàn)取材時A組大鼠足底創(chuàng)面不愈合，B組足底創(chuàng)面基本愈合。見圖1。

2.3 病理學(xué)形態(tài)改變 組織切片HE染色顯微鏡下A組大鼠的踝管處神經(jīng)組織水腫，大量單核細(xì)胞浸潤，神經(jīng)纖維變性;血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯減少，血管內(nèi)皮細(xì)胞核皺縮;足底創(chuàng)面組織中纖維細(xì)胞萎縮，纖維變性、細(xì)胞水腫，細(xì)胞核明顯減少。B組大鼠踝管處神經(jīng)、血管及足底創(chuàng)面組織表現(xiàn)為較正常的組織學(xué)結(jié)構(gòu)，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)纖維結(jié)構(gòu)清晰，皮膚細(xì)胞層次清晰、結(jié)構(gòu)完好。見圖2。

2.4 細(xì)胞因子表達(dá) A組足底創(chuàng)面組織切片免疫組化顯示大鼠VEGF、NGF、bFGF表達(dá)較B組明顯降低（P<0.01）。見表1和圖3。

2.5 各組大鼠的一般情況 在實(shí)驗(yàn)過程中，A組和B組大鼠無死亡。

3 討 ?論 ?足底皮膚是遠(yuǎn)離循環(huán)系統(tǒng)中心的末梢組織，糖尿病足狀態(tài)下易出現(xiàn)不同程度的損害，組織形態(tài)學(xué)改變主要表現(xiàn)為皮膚變薄，損傷后易出現(xiàn)難愈合的皮膚潰瘍。足底創(chuàng)面的修復(fù)需要血管再生為基礎(chǔ)，血管內(nèi)皮細(xì)胞及成纖維細(xì)胞等在細(xì)胞因子的引導(dǎo)下增殖、遷移到血管外周后分化成相應(yīng)的組織細(xì)胞。糖尿病足大鼠踝管卡壓形成后，踝管處的血管、神經(jīng)卡壓加重導(dǎo)致相應(yīng)支配區(qū)域的血液及神經(jīng)營養(yǎng)削弱，術(shù)后6周A組大鼠足底創(chuàng)面組織中的VEGF、NGF、bFGF平均光密度與B組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，A組大鼠足底創(chuàng)面處無法生成較多的新生血管內(nèi)皮細(xì)胞，皮膚成纖維細(xì)胞增殖困難，造成創(chuàng)面愈合困難，表現(xiàn)為A組大鼠糖尿病足病變發(fā)展較B組迅速，A組大鼠足底創(chuàng)面修復(fù)時間長且修復(fù)效果差。

VEGF是目前所知最強(qiáng)的血管內(nèi)皮細(xì)胞選擇性有絲分裂因子和血管生成因子，能夠特異地直接作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，作用包括促進(jìn)新血管生成、促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、提高血管通透性、改變血管外基質(zhì)、維持新生血管功能，在微小血管結(jié)構(gòu)和功能改變的病理生理過程中發(fā)揮重要作用[5]。VEGF在動脈閉塞病理進(jìn)展及側(cè)支循環(huán)建立新生血管的過程中起著至關(guān)重要的作用，VEGF表達(dá)提高后可以通過旁分泌介導(dǎo)作用促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移、分裂、增殖，形成新的毛細(xì)血管網(wǎng)。A組大鼠足底創(chuàng)面組織中血管內(nèi)皮細(xì)胞明顯減少， A組大鼠足底創(chuàng)面組織切片中的VEGF表達(dá)明顯低于B組，A組VEGF表達(dá)水平降低導(dǎo)致足底創(chuàng)面邊緣毛細(xì)血管通透性減弱，新生毛細(xì)血管再生數(shù)量及速度下降，直接影響足底創(chuàng)面的修復(fù)。

NGF是各類組織中常見的細(xì)胞生長調(diào)節(jié)因子，具有營養(yǎng)神經(jīng)和促進(jìn)神經(jīng)生長的生物學(xué)功能，對中樞神經(jīng)元和周圍神經(jīng)的發(fā)育、分化、生長、再生及功能特性的表達(dá)具有重要調(diào)節(jié)作用。NGF不僅可以對神經(jīng)元起營養(yǎng)保護(hù)作用，而且具有促進(jìn)神經(jīng)組織以外的血管生成作用[6]。NGF表達(dá)能夠?yàn)橹車窠?jīng)修復(fù)早期提供蛋白合成信息，使感覺神經(jīng)對氨基酸和其他小分子物質(zhì)攝取增加，軸漿合成、運(yùn)送加速，經(jīng)再生軸突運(yùn)送到感覺效應(yīng)器并加速其功能恢復(fù)，促進(jìn)感覺結(jié)構(gòu)完整性的恢復(fù)，同時促進(jìn)了神經(jīng)周圍微血管的再生。Juliopieper等[7]通過實(shí)驗(yàn)證實(shí)NGF可增加VEGF的mRNA和蛋白表達(dá)水平，說明NGF能夠作用于VEGF來促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞再生并介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞的遷移、增殖，最終形成新生血管及血管周基質(zhì)。A組大鼠踝管處的神經(jīng)組織中神經(jīng)纖維排列明顯松散，髓鞘嚴(yán)重厚薄不均并出現(xiàn)嚴(yán)重空泡變性，軸索變細(xì)甚至消失。A組大鼠足底創(chuàng)面組織中的NGF表達(dá)明顯低于B組，NGF表達(dá)水平降低間接影響到新生血管的生成。

bFGF是具有多種生物活性的多肽類物質(zhì)，對皮膚組織的成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等細(xì)胞有明顯的促進(jìn)分化增殖作用，在皮膚損傷后的修復(fù)過程中起重要作用。 本實(shí)驗(yàn)中A組大鼠足底創(chuàng)面組織中的細(xì)胞排列明顯松散，細(xì)胞核減少并出現(xiàn)空泡變性，細(xì)胞層數(shù)明顯減少，血管明顯減少。A組大鼠足底創(chuàng)面中的bFGF表達(dá)明顯低于B組，足底創(chuàng)面處的成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移明顯減少。

綜上所述，糖尿病足大鼠合并踝管綜合征后組織中的VEGF、NGF、bFGF表達(dá)明顯降低導(dǎo)致足底創(chuàng)面不愈合，由此可見踝管綜合征對大鼠糖尿病足病變的發(fā)展有明顯促進(jìn)作用。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] ?劉志雄，張伯勛.周圍神經(jīng)外科學(xué)[M].北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社，2004：593-597.

[2] ?李曉濤，路來金，于佳傲.老年踝管綜合征35例臨床診治分析[J].中國老年學(xué)雜志，2008，1（28）：190-191.

[3] ?郝晶晶，秦小勇.高頻超聲在糖尿病下肢周圍神經(jīng)、血管病變診斷的應(yīng)用研究[J].右江醫(yī)學(xué)，2014，42（1）：32-34.

[4] ?孫曉芳，趙長勇，陳 暉，等.高糖高脂飲食加鏈尿佐菌素建立實(shí)驗(yàn)性大鼠2型糖尿病模型[J].南京醫(yī)科大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2009，29（6）：797-800，806.

[5] ?Meirer R，Gurunluoglu R，Siemionow M.Neurogenic perspective on vascular endothelial growth factor：review of the literature[J].J Recons Microsurg，2001，17（8）：625-629.

[6] ?Steinle JJ，Granger HJ.Nerve growth factor regulates human choroidal，but not retinal，endothelial cell migration and proliferation [J].Auton Neurosci，2003，108（1-2）：57-62.

[7] ?Juliopieper M，Lara HE，Bravo JA，et al.Effects of nerve growth factor（NGF）on blood vessels area and expression of the angiogenic factors VEGF and TGF betal in the rat ovary[J].Reproductive Biology&Endocrinology，2006，4（1）：57-67.