劉繼斌， 秦小江， 岳 晗， 伊淑賢， 侯曉敏

(山西醫(yī)科大學 1教務(wù)處， 2公共衛(wèi)生學院， 3基礎(chǔ)醫(yī)學院， 山西 太原 030001)

吸煙是加速心腦血管疾病發(fā)生的重要危險因素之一。流行病學和實驗研究表明，吸煙可增加機體炎癥水平，導致高血壓、腦血栓和動脈粥樣硬化等多種心血管疾病的發(fā)生[1-3]。尼古丁(nicotine)作為香煙煙霧的主要毒性成分之一，已被證實可調(diào)控多種細胞功能的改變，如誘導血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)發(fā)生遷移，通過影響VSMCs細胞膜上離子通道的活性和狀態(tài)從而改變血管的緊張性。本研究基于鬼筆環(huán)肽染色法和膠原收縮法觀察尼古丁對大鼠主動脈VSMCs舒縮功能的影響，為深入探討尼古丁對血管功能異常引起的心血管疾病的病理機制提供基礎(chǔ)依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實驗動物

SD大鼠，雄性，體重210～230 g，購自山西醫(yī)科大學實驗動物中心。動物許可證號為SCXK(晉) 2017-0001。

2 主要實驗試劑

尼古丁(Sigma)；鼠尾膠原蛋白I型(杭州生友公司)；羅丹明-鬼筆環(huán)肽(廣州威佳公司)；胎牛血清(Gibco)；L-谷氨酰胺(山東西亞化學工業(yè)有限公司)。

3 方法

3.1 大鼠主動脈VSMCs的培養(yǎng)及鑒定 首先使用烏拉坦對大鼠進行腹腔注射麻醉，參照文獻[4-6]，用袖套式剝離法去除血管外膜，然后用眼科彎鑷鈍性刮除內(nèi)膜，最終獲得血管平滑肌細胞層。向培養(yǎng)皿中加入少許含胎牛血清(20%)的培養(yǎng)液，用眼科小剪刀將血管中膜層剪碎成為(1～2) mm×1 mm左右的小組織塊，并將其均勻平鋪于培養(yǎng)瓶底部。輕輕翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，瓶底朝上并向瓶內(nèi)注入培養(yǎng)基，培養(yǎng)箱中靜置2 h后，緩慢將培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)放平。每3～5天換液1次，當組織塊周圍細胞爬出并大部分組織周圍細胞融合至80%以上，進行首次傳代，選取第4～6代的細胞進行后續(xù)實驗。利用免疫組織化學方法，使用α-平滑肌肌動蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)單克隆抗體對細胞進行鑒定。

3.2 鬼筆環(huán)肽染色法觀察不同濃度的尼古丁對大鼠VSMCs收縮功能的影響 將VSMCs用胰蛋白酶消化后，接種于6孔板中，置于孵箱中培養(yǎng)(37 ℃、5% CO2)，當融合度為50%時，換含0.5%胎牛血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h，然后將VSMCs分為4個實驗組和1個對照(control)組進行培養(yǎng),實驗組分別加入濃度為0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L的尼古丁，對照組加入等量的含0.5%胎牛血清的培養(yǎng)基[6]，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

用PBS清洗VSMCs 2次，每次5 min。然后室溫下用4%多聚甲醛固定VSMCs 10 min，PBS清洗VSMCs 3次,每次5 min。5 μL TRITC-鬼筆環(huán)肽貯存液加入150 μL PBS中，配成工作液用于細胞染色。將6孔板轉(zhuǎn)至暗室中，室溫染色，使用DAPI復染，PBS沖洗3次，每次10 min。吸去多余水分，封片，共聚焦顯微鏡下分別拍攝不同實驗組的照片，再用ImageJ軟件計算細胞的表面積(μm2)。

3.3 膠原收縮法觀察不同濃度的尼古丁對大鼠VSMCs收縮功能影響 依據(jù)上述鬼筆環(huán)肽染色法發(fā)現(xiàn)，尼古丁對大鼠主動脈VSMCs的最適刺激濃度為10 μmol/L，因此我們選擇10 μmol/L尼古丁繼續(xù)使用膠原收縮法對VSMCs收縮情況進行動態(tài)觀察。

向制備好的三維膠原中加入100 μL 10×PBS或10×培養(yǎng)液，混勻后立即加到培養(yǎng)皿中。將10 μmol/L尼古丁處理的大鼠主動脈VSMCs種植于膠原凝膠中，將培養(yǎng)皿在室溫下放置20 min，待膠凝固后，轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱內(nèi)。然后我們分別觀察加入尼古丁后0 min、10 min、20 min、40 min和60 min時的膠原收縮情況，對各個時點的膠原面積進行拍照，用ImageJ軟件測量膠原面積。膠原收縮相對百分比(%)=收縮后膠原面積/收縮前膠原面積×100%。

4 統(tǒng)計學處理

所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，統(tǒng)計學分析使用兩因素重復測量方差分析，利用GraphPad Prism 7進行統(tǒng)計分析并作圖，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 大鼠血管平滑肌細胞的原代培養(yǎng)及鑒定

原代培養(yǎng)第4～6天，可見少量細胞自組織塊邊緣游出，見圖 1A，且形態(tài)多樣，梭形居多。原代培養(yǎng)VSMCs的胞體較小，胞質(zhì)折光性強，10 d左右細胞顯著增多，高低起伏呈“峰、谷”狀生長，見圖1B。

選擇第3～5代穩(wěn)定生長的VSMCs作為觀察對象，經(jīng)特異性的α-SMA免疫組化染色后，高倍鏡下能看到與細胞長軸平行的細胞蛋白肌絲呈陽性反應(yīng)，見圖1C。

2 鬼筆環(huán)肽法檢測尼古丁對大鼠主動脈VSMCs收縮能力的影響

分別取0.1 μmol/L、1 μmol/L、10 μmol/L和100 μmol/L的尼古丁作用于VSMCs，24 h后固定細胞，固定細胞后用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染細胞骨架[7]，計算細胞表面積。結(jié)果顯示，0.1 μmol/L的尼古丁作用后無明顯變化；1 μmol/L的尼古丁作用后VSMCs的肌絲數(shù)量顯著增多，細胞板狀化明顯；10 μmol/L的尼古丁作用后，VSMCs呈現(xiàn)出較高的張力狀態(tài)，而100 μmol/L尼古丁導致細胞活力顯著降低。分別對不同組的VSMCs拍攝照片，再用ImageJ軟件計算細胞的表面積(μm2)，見圖2。

Figure 1. The primary culture and identification of rat aortic VSMCs. A: rat aorta tissue block; B: primarily cultured rat aortic VSMCs (×10); C: identification of VSMCs by immunocytochemical staining of α-smooth muscle actin (×100).

圖1 大鼠主動脈血管平滑肌細胞的原代培養(yǎng)和鑒定

Figure 2. The effect of nicotine on the contraction of rat aortic VSMCs was detected by skeleton staining(×100). Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2 利用細胞骨架染色法檢測尼古丁對大鼠主動脈血管平滑肌細胞收縮功能的影響

3 膠原收縮法檢測尼古丁對大鼠主動脈VSMCs收縮能力的影響

鑒于前述鬼筆環(huán)肽染色法實驗結(jié)果提示，10 μmol/L是尼古丁對大鼠主動脈VSMCs的最適處理濃度，因此在膠原收縮法進行動態(tài)觀察時，我們只對尼古丁選取10 μmol/L濃度進行實驗。實驗結(jié)果提示，將10μmol/L尼古丁處理的VSMCs種植于膠原中，分別在不同時點(0 min、10 min、20 min、40 min和60 min)進行觀察。隨著時間的增加，膠原收縮逐漸明顯，在60 min時達到最大收縮幅度(P<0.01)。該實驗結(jié)果表明尼古丁對大鼠血管主動脈VSMCs的收縮作用除了具有濃度依賴性，還具有時間依賴性，見圖3。

Figure 3. The effect of nicotine on the contraction of rat aortic VSMCs was detected by collagen contraction method. Mean±SD.n=6.*P<0.05,**P<0.01vs0 min group.

圖3 利用膠原收縮法檢測尼古丁對大鼠主動脈血管平滑肌細胞收縮功能的影響

討 論

尼古丁是煙草的主要成分之一，已有研究證實其可以調(diào)控多種細胞功能的變化[8]、加重腦卒中所致腦損傷等[3, 9]。VSMCs位于動脈血管壁的中層，是構(gòu)成血管壁的重要細胞[10]，對維持機體正常功能非常重要，多種刺激因子由于損傷VSMCs而造成相關(guān)的一些心血管疾病，如尼古丁能夠增加活性氧簇和降低一氧化氮的活力等[1]。本實驗對培養(yǎng)的VSMCs經(jīng)不同濃度的尼古丁處理后發(fā)現(xiàn)，通過2種不同的實驗方法(鬼筆環(huán)肽法和膠原收縮法)觀察了大鼠血管平滑肌細胞的舒張收縮功能的變化。

本研究中利用鬼筆環(huán)肽法對VSMCs骨架進行檢測，實驗結(jié)果顯示，將大鼠主動脈VSMCs用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色后，隨著尼古丁濃度的增加，VSMCs板狀化明顯，肌絲數(shù)量顯著增多，呈現(xiàn)出明顯的收縮狀態(tài)。這種實驗方法雖然可以觀察到尼古丁對細胞骨架的影響，但是不能對細胞進行連續(xù)性的動態(tài)觀察，因此我們接下來又使用了膠原收縮法繼續(xù)對尼古丁對VSMCs的收縮作用進行了連貫性的觀察。

膠原收縮法是一種間接反映細胞收縮能力的實驗方法，與鬼筆環(huán)肽染色法類似，使用膠原收縮法同樣驗證了尼古丁對大鼠主動脈VSMCs收縮能力的影響。使用10 μmol/L的尼古丁對細胞進行干預(yù)后，種植于凝膠中，開始作用時，尼古丁并沒有對膠原面積產(chǎn)生明顯影響，作用20 min時可見膠原呈現(xiàn)顯著收縮，隨著時間的延長，當作用60 min時膠原收縮最為顯著。該實驗結(jié)果提示，尼古丁對大鼠主動脈VSMCs的收縮作用不僅與其濃度有關(guān)系，還具有時間依賴性。

本研究通過利用2種不同的實驗方法——細胞骨架染色法和膠原收縮法，從細胞水平觀察了尼古丁對大鼠主動脈VSMCs的收縮作用，為治療尼古丁所致的相關(guān)心血管疾病提供了作用靶點。