王 崢， 胡 芳， 孫 瑩， 陳楊麗

(中山大學附屬第五醫(yī)院內(nèi)分泌與代謝病科， 廣東 珠海 519000)

大血管病變是糖尿病患者常見的并發(fā)癥，也是引起患者死亡和致殘的主要因素之一[1]。糖尿病引起的大血管病變是一個復雜的病理生理學過程，其中各種損傷因素造成的血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMC)過度增殖是血管粥樣硬化形成、血管壁增厚、 管腔狹窄、 血管順應性降低及血管重構(gòu)的重要環(huán)節(jié)[2]。雖然已經(jīng)明確高血糖是引起VSMC過度增殖的因素之一，但其具體的分子生物學機制還有待進一步研究。近期研究顯示，長鏈非編碼RNA心肌梗死相關轉(zhuǎn)錄本(long non-coding RNA myocardial infarction associated transcript，lncRNA-MIAT)在糖尿病引起的血管病變中扮演重要角色，參與調(diào)控血管內(nèi)皮細胞的功能[3]。但lncRNA-MIAT是否在高糖引起的VSMC細胞活力異常中發(fā)揮調(diào)控作用還未見報道。另一方面，本研究通過生物信息學預測發(fā)現(xiàn)微小RNA-145(microRNA-145, miR-145)可能受lncRNA-MIAT的調(diào)控，而microRNA-145被證明是調(diào)控VSMC活力及增殖的重要分子[4]。因此本研究假設lncRNA-MIAT可以通過調(diào)控microRNA-145參與高糖引起的VSMC活力異常，并設計體外實驗加以驗證，現(xiàn)報道如下。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

清潔級SD大鼠(雌雄不限，體質(zhì)量200 g左右)，由中山大學實驗動物中心提供，動物合格證號為SCXK(粵)2016-0029。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、Lipofectamine 2000試劑盒、Lipofectamine RNAiMAX、TRIzol試劑和TaqManTMAdvanced miRNA cDNA合成試劑盒均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；SYBR? Premix Ex TaqTM購自寶生物工程(大連)有限公司；pcDNA3.1-MIAT真核表達質(zhì)粒、microRNA-145模擬序列(miR-145 mimic)、microRNA-145抑制序列(miR-145 inhibitor)及無關序列均購自廣州銳博生物；CellTiter-Blue試劑盒和雙螢光素酶報告基因質(zhì)粒及雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)購自上海普洛麥格生物產(chǎn)品有限公司；microRNA-145和U6的引物購自QIAGEN。

2 方法

2.1 大鼠主動脈VSMC的分離及培養(yǎng) 大鼠經(jīng)腹腔注射50 mg/kg戊巴比妥鈉進行麻醉，無菌條件下剪開腹腔和胸腔，取出主動脈，體視顯微鏡下分離取出血管中膜組織，充分剪碎獲取的中膜組織。將剪碎的組織置入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中豎直放置5 h，待組織黏附后，平放細胞培養(yǎng)瓶，繼續(xù)培養(yǎng)。每3 d換液1次，當組織塊周圍細胞融合達到80%左右時常規(guī)傳代，取2代后的細胞進行鑒定，確認為血管平滑肌細胞后進行后續(xù)實驗操作。非高糖處理的細胞進行常規(guī)培養(yǎng)(培養(yǎng)基葡萄糖濃度為5 mmol/L)，需進行高糖處理的細胞培養(yǎng)于葡萄糖濃度為25 mmol/L的培養(yǎng)基中。

2.2 細胞的體外轉(zhuǎn)染 通過向VSMC轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MIAT真核表達質(zhì)粒和MIAT小干擾RNA(MIAT small interfering RNA,MIAT-siRNA)分別實現(xiàn)細胞內(nèi)lncRNA-MIAT的過表達和沉默。通過向VSMC轉(zhuǎn)染miR-145 mimic和miR-145 inhibitor分別實現(xiàn)細胞內(nèi)microRNA-145的過表達和沉默。質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine?2000試劑進行，同時使用pcDNA3.1空質(zhì)粒作為轉(zhuǎn)染對照。MIAT-siRNA、microRNA模擬序列及抑制序列的轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine?RNAiMAX試劑。使用轉(zhuǎn)染無關序列的細胞作為轉(zhuǎn)染對照。

2.3 細胞分組 根據(jù)是否進行高糖刺激及轉(zhuǎn)染處理的不同，將細胞分為非高糖培養(yǎng)(non-high glucose)組和高糖培養(yǎng)(high glucose)組; 非高糖培養(yǎng)組再分為3個亞組，包括陰性轉(zhuǎn)染對照(negative transfection control)亞組、轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MIAT亞組及pcDNA3.1-MIAT+miR-145 mimic共轉(zhuǎn)染亞組；高糖培養(yǎng)組也分為3個亞組，包括陰性轉(zhuǎn)染對照亞組、轉(zhuǎn)染MIAT-siRNA亞組及MIAT-siRNA+ miR-145 inhibitor共轉(zhuǎn)染亞組。

2.4 RT-qPCR實驗 使用TRIzol試劑提取各組細胞樣本中的總RNA。mRNA的反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScriptTMRT 試劑盒。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，對cDNA的進行定量擴增，試劑盒選用SYBR? Premix Ex TaqTM，標準化采用GAPDH。MicroRNA的反轉(zhuǎn)錄采用TaqManTMAdvanced miRNA cDNA合成試劑盒，反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后使用miScript SYBR Green PCR 試劑盒對cDNA進行熒光定量擴增，標準化采用U6。獲取循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct)之后采用2-ΔΔCt法進行計算目的基因的相對水平。lncRNA-MIAT的上游引物序列為5’-ATCCTCGAGACAAAGAGCCCTCTGCACTAG-3’，下游引物序列為5’-ATCGGATCCGAGCAAATGGAGACAAAGGAC-3’；GAPDH的上游引物序列為5’-CATGTTCGTCATGGGGTGAACCA-3’，下游引物序列為5’-AGTGATGGCATGGACTGTGGTCAT-3’。 MicroRNA-145及U6均采用商品化的miScript引物。

2.5 細胞活力實驗 將各組細胞以每孔5 000個的密度種植于96孔板，于種植后24 h及72 h分別使用CellTiter-Blue試劑盒測定各組細胞573 nm波長處的吸光度(A)值，并根據(jù)公式計算72 h時點相對于24 h時點的細胞活力相對變化。細胞相對活力(%)=72 hA值/24 hA值×100%。

2.6 生物信息學分析及雙螢光素酶報告基因?qū)嶒?使用miRcode lncRNA-microRNA互作預測系統(tǒng)預測lncRNA-MIAT與microRNA-145的結(jié)合能力，尋找兩者可能互補結(jié)合的區(qū)域。為驗證生物信息學分析的結(jié)果，采用雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灤_認lncRNA-MIAT與microRNA-145的結(jié)合能力：首先構(gòu)建不含任何突變的野生型lncRNA-MIAT螢光素酶報告基因質(zhì)粒，命名為pmirGro-MIAT-WT；同時對lncRNA-MIAT中上述生物信息學預測到的結(jié)合區(qū)域進行突變，構(gòu)建突變型lncRNA-MIAT螢光素酶報告基因質(zhì)粒，命名為pmirGro-MIAT-MUT，使用microRNA-145 mimic(同時使用無關序列作為陰性對照)與上述2種螢光素酶報告基因質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染VSMC，隨后采用雙螢光素酶報告基因檢測系統(tǒng)測定轉(zhuǎn)染后細胞的相對螢光素酶活性。

3 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計學分析采用R語言，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)的形式表示。兩組間的均數(shù)差異比較采用獨立樣本t檢驗；多組間均數(shù)差異的比較采用單因素方差分析，隨后采用Bonferroni校正的t檢驗進行兩兩比較。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 高糖刺激引起大鼠VSMC中l(wèi)ncRNA-MIAT的增高及microRNA-145水平的降低

非高糖培養(yǎng)組細胞lncRNA-MIAT的相對水平為1.00±0.02，高糖培養(yǎng)組的lncRNA-MIAT相對水平為2.26±0.15，較非高糖培養(yǎng)組顯著升高(P<0.01)。非高糖培養(yǎng)組細胞microRNA-145的相對水平為1.00±0.05，高糖培養(yǎng)組的microRNA-145相對水平為0.61±0.09，較非高糖培養(yǎng)組顯著降低(P<0.01)，見圖1。該結(jié)果提示高糖刺激可以引起lncRNA-MIAT水平的升高，但是會抑制microRNA-145的表達。

Figure 1. The changes of lncRNA-MIAT and microRNA-145 le-vels in the VSMC cultured in non-high glucose and high glucose media. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsnon-high glucose group.

圖1 非高糖培養(yǎng)及高糖培養(yǎng)后的血管平滑肌細胞lncRNA-MIAT和microRNA-145水平的變化

2 lncRNA-MIAT通過調(diào)控microRNA-145促進大鼠VSMC活力

對于非高糖培養(yǎng)的VSMC，與陰性轉(zhuǎn)染對照亞組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MIAT亞組72 h的細胞相對活力顯著升高(P<0.01)。對于高糖培養(yǎng)的VSMC，與陰性轉(zhuǎn)染對照亞組相比，轉(zhuǎn)染MIAT-siRNA亞組72 h的細胞相對活力顯著降低(P<0.01)。高糖培養(yǎng)組的陰性轉(zhuǎn)染對照亞組的細胞相對活力顯著高于非高糖培養(yǎng)組的陰性轉(zhuǎn)染對照亞組(P<0.01)。更為重要的是，在非高糖培養(yǎng)組中，pcDNA3.1-MIAT+miR-145 mimic共轉(zhuǎn)染亞組的細胞相對活力顯著低于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MIAT亞組(P<0.01);在高糖培養(yǎng)組，MIAT-siRNA+ miR-145 inhibitor共轉(zhuǎn)染亞組的細胞相對活力顯著高于轉(zhuǎn)染MIAT-siRNA亞組(P<0.01),見圖2、3。上述結(jié)果提示高糖處理可誘導VSMC活力，lncRNA-MIAT具有促進VSMC活力的作用，而microRNA-145具有抑制VSMC活力的作用，lncRNA-MIAT對VSMC活力的調(diào)控依賴于micro-RNA-145的水平。

Figure 2. The viability changes of VSMC cultured in non-high glucose medium after transfection. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsnegative transfection control group;##P<0.01vspcDNA3.1-MIAT group.

圖2 非高糖處理培養(yǎng)的血管平滑肌細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后的細胞活力變化

Figure 3. The viability changes of VSMC cultured in high glucose medium after transfection. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsnegative transfection control group;##P<0.01vsMIAT-siRNA group.

圖3 高糖培養(yǎng)的血管平滑肌細胞經(jīng)轉(zhuǎn)染處理后的細胞活力變化

3 lncRNA-MIAT負向調(diào)控microRNA-145

RT-qPCR結(jié)果顯示， 對于非高糖培養(yǎng)的VSMC，與陰性轉(zhuǎn)染對照亞組相比，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MIAT亞組的microRNA-145相對水平顯著降低(P<0.05)。對于高糖培養(yǎng)的VSMC，與陰性轉(zhuǎn)染對照亞組相比，轉(zhuǎn)染MIAT-siRNA亞組的microRNA-145相對水平顯著升高(P<0.05)，見圖4、5。該結(jié)果提示lncRNA-MIAT可以抑制microRNA-145的表達。miRcode lncRNA-microRNA互作預測系統(tǒng)的結(jié)果提示, lncRNA-MIAT與microRNA-145存在互補結(jié)合的區(qū)域。雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灥慕Y(jié)果顯示，相對于共轉(zhuǎn)染microRNA-145 mimic與pmirGLO-MIAT-MUT質(zhì)粒的細胞,共轉(zhuǎn)染microRNA-145 mimic與pmirGLO-MIAT-WT質(zhì)粒的細胞相對螢光素酶活性顯著降低(P<0.01)，見圖6。該結(jié)果提示lncRNA-MIAT確實可以與microRNA-145直接靶向結(jié)合，可能以“核酸海綿”的形式抑制microRNA-145的表達。

Figure 4. MicroNRA-145 level in VSMC cultured in non-high glucose medium after lncRNA-MIAT over-expression. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsnegative transfection control group.

圖4 非高糖培養(yǎng)的血管平滑肌細胞中過表達lncRNA-MIAT后的microRNA-145水平

討 論

糖尿病患者的大血管病變主要以動脈粥樣硬化為主，超過80%左右的糖尿病患者的死亡原因與動脈粥樣硬化引起的心腦血管事件相關[5-6]。糖尿病患者罹患動脈粥樣硬化的風險顯著提高且病變較非糖尿病患者來說更加彌漫復雜，預后更差[7]。糖尿病患者高血糖、高胰島素血癥及血脂蛋白代謝紊亂等損傷因素造成的VSMC增殖過度是血管內(nèi)膜增厚、新生內(nèi)膜形成、纖維帽子形成及管腔狹窄的主要原因，被認為是糖尿病患者動脈粥樣硬化形成的重要病理生理學環(huán)節(jié)[8-9]。因此采用干預手段防止VSMC的增殖過度可能對糖尿病大血管病變的防治具有重要意義。高血糖是糖尿病患者的共同標志性的特征，且被證實是糖尿病患者發(fā)生動脈粥樣硬化的一個獨立風險因素[10-11]，因此探討高糖引起VSMC過度增殖的機制并設計干預措施的臨床意義更為重大。

Figure 5. MicroNRA-145 level in VSMC cultured in high glucose medium after lncRNA-MIAT silencing. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsnegative transfection control group.

圖5 高糖培養(yǎng)的血管平滑肌細胞中沉默lncRNA-MIAT后的microRNA-145水平

Figure 6. Relative luciferase activity changes of the VSMC detected by dual-luciferase reporter assay. Mean±SD.n=5.**P<0.01vspmirGro-MIAT-MUT.

圖6 雙螢光素酶報告基因?qū)嶒炛屑毎南鄬ξ灩馑孛富钚宰兓?/p>

lncRNA是一類轉(zhuǎn)錄本超過200個核苷酸單位的非編碼RNA，雖不編碼蛋白質(zhì)，但在染色質(zhì)重構(gòu)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及蛋白質(zhì)代謝等方面均發(fā)揮重要的作用，因此參與各種疾病的調(diào)控[12-13]。本研究主要關注lncRNA-MIAT在高血糖引起的VSMC過度增殖中扮演的角色。lncRNA-MIAT已經(jīng)被證實參與糖尿病并發(fā)的血管病變。如Yan等[3]的研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病大鼠模型的視網(wǎng)膜微血管組織中存在lncRNA-MIAT的高表達，在高糖環(huán)節(jié)培養(yǎng)的血管內(nèi)皮細胞中也存在lncRNA-MIAT高表達且可以促進血管內(nèi)皮細胞的功能紊亂。但是還沒有研究證實lncRNA-MIAT在是否參與糖尿病患者大血管的病變，且沒有研究表明其是否與高糖下VSMC的增殖過度有關。本研究通過體外細胞實驗發(fā)現(xiàn)，高糖刺激后的大鼠VSMC出現(xiàn)了lncRNA-MIAT的高表達，而敲減細胞內(nèi)lncRNA-MIAT的表達后，高糖刺激誘導的細胞活力增高作用被減弱。上調(diào)非高糖培養(yǎng)環(huán)境下VSMC的lncRNA-MIAT后，我們發(fā)現(xiàn)細胞的活力增加。因此本研究認為lncRNA-MIAT具有促進VSMC活力的作用，可參與高糖引起的VSMC活力異常。

lncRNA發(fā)揮調(diào)控作用的機制比較復雜，其中一個較為重要的機制是競爭性內(nèi)源RNA學說，即lncRNA可以作為“核酸海綿”，吸附相應的可與之互補的microRNA，導致該microRNA的游離分子減少，間接導致該microRNA的靶基因水平發(fā)生改變[14]?；谶@個學說，本研究認為lncRNA-MIAT可能通過某個microRNA分子發(fā)揮作用。通過生物信息學分析我們發(fā)現(xiàn)，lncRNA-MIAT可以和若干microRNA分子互補，這些microRNA中包括microRNA-145。之所以進一步關注microRNA-145，是因為已經(jīng)有研究證實microRNA-145是VSMC中含量最豐富的micro-RNA，不但可以調(diào)控VSMC的表型也可以調(diào)控其增殖和遷移。有研究指出，高血糖可以抑制VSMC的microRNA-145表達，而microRNA-145本身具有抑制VSMC增殖的作用,因此microRNA-145很可能參與糖尿病引起的血管病變，特別是參與該過程中VSMC的損傷[15]。在生物信息學分析的基礎上，本研究通過轉(zhuǎn)染改變了VSMC的lncRNA-MIAT水平，同時檢測了microRNA-145的表達變化，結(jié)果提示lncRNA-MIAT能夠抑制microRNA-145的水平。進一步的雙螢光素酶報告基因?qū)嶒灡砻鱨ncRNA-MIAT確實可以和microRNA-145互補結(jié)合。此外，本研究也發(fā)現(xiàn)microRNA-145在高糖刺激的VSMC中低表達，且確實發(fā)揮抑制VMSC活力的作用，與既往研究一致。綜合這些結(jié)果，我們認為lncRNA-MIAT可以通過調(diào)控microRNA-145來實現(xiàn)對高糖刺激下VMSC活力的影響。當然，根據(jù)競爭性內(nèi)源RNA學說，lncRNA-MIAT如能對microRNA-145實現(xiàn)調(diào)控，則同時能改變microRNA-145靶基因的水平，但本研究沒對這些microRNA-145的靶基因進行探討，這是本研究的缺陷。一些報道證實，microRNA-145參與調(diào)控VSMC功能的靶基因主要有MMP-9、KLF4、KLF5、ELK1、肌動蛋白調(diào)節(jié)蛋白基因、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶等。未來研究可以著眼于探討lncRNA-MIAT對上述基因的調(diào)控。

總之，本研究的結(jié)果提示lncRNA-MIAT可能通過抑制microRNA-145促進VSMC的活力，這可能是高血糖導致VSMC活力增加的一個機制。靶向抑制lncRNA-MIAT可能有利于糖尿病大血管病變的防治。