李朝輝， 張 睿， 何俊文， 李祥蕓， 吳建華

(武漢愛爾眼科醫(yī)院眼底病科， 湖北 武漢 430063)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)特有和常見的微血管并發(fā)癥之一，可使患者出現(xiàn)嚴(yán)重的視力損傷[1]。目前認(rèn)為DR患者在出現(xiàn)微血管系統(tǒng)病變前會(huì)出現(xiàn)神經(jīng)組織損傷，其病理特征主要表現(xiàn)為神經(jīng)元凋亡、內(nèi)層視網(wǎng)膜變薄及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞異常活躍等[2]。DR的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的過程，目前認(rèn)為DR的發(fā)病機(jī)制與高血糖、細(xì)胞凋亡、多元醇代謝異常、氧化應(yīng)激、線粒體損傷、細(xì)胞因子及自由基作用等多種因素相關(guān)，且細(xì)胞凋亡是糖尿病大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元損害的主要形式[3-4]。由于神經(jīng)組織損傷后的再生能力較差，因此，研究神經(jīng)保護(hù)在DR治療中的作用具有重要意義。過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor γ coactivator-1α，PGC-1α)是一種強(qiáng)有力的線粒體和氧化代謝調(diào)節(jié)酶，已有研究證明它和視網(wǎng)膜血管的發(fā)生以及缺血狀態(tài)時(shí)新生血管的形成密切相關(guān)[5]?；赑GC-1α在新陳代謝和線粒體氧化作用中的關(guān)鍵作用，我們猜想PGC-1α在糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙谝暰W(wǎng)膜感光細(xì)胞的凋亡中也扮演著重要的角色。本研究在視網(wǎng)膜感光細(xì)胞中過表達(dá)PGC-1α，探討其對(duì)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡的影響，為DR中神經(jīng)元的保護(hù)提供一種新的思路。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

小鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞株RGC-5購(gòu)自武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。高糖DMEM培養(yǎng)基、普通DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)均購(gòu)自Gibco；Annexin V-FITC/PI試劑盒購(gòu)自BD；0.125%胰蛋白酶、Hoechst 33258、PBS及兔抗GAPDH單克隆抗體和羊抗兔多克隆抗體均購(gòu)自Bioswamp；兔抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)單克隆抗體、兔抗神經(jīng)生長(zhǎng)因子(nerve growth factor,NGF)多克隆抗體、兔抗PGC-1α多克隆抗體、兔抗Bcl-2多克隆抗體、兔抗Bax單克隆抗體、兔抗p53多克隆抗體、兔抗線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM)多克隆抗體、兔抗DNA聚合酶γ(DNA polymerase gamma,POLG)單克隆抗體、兔抗ATP合酶O亞基(ATP synthase subunit O,ATP5O)多克隆抗體、兔抗細(xì)胞色素C氧化酶5b亞基(cytochrome C oxidase subunit 5b,COX5b)單克隆抗體、兔抗超氧化物歧化酶(super-oxide dismutase,SOD)1多克隆抗體和兔抗SOD2單克隆抗體均購(gòu)自Abcam。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 用含10% FBS的普通DMEM培養(yǎng)RGC-5細(xì)胞，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)且密度達(dá)到90%后用0.125%胰蛋白酶消化，取傳代后對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用含不同濃度(10 mmol/L、15 mmol/L、20 mmol/L、25 mmol/L和30 mmol/L)葡萄糖、無FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞24 h、48 h和72 h，采用MTT法檢測(cè)細(xì)胞在不同濃度葡萄糖與不同作用時(shí)間條件下的活力，通過繪制濃度-時(shí)間生長(zhǎng)曲線，選擇最佳的葡萄糖濃度與時(shí)點(diǎn)，建立RGC-5細(xì)胞高糖模型。

2.2 載體構(gòu)建 根據(jù)GenBank中小鼠PGC-1α的基因序列(NM_008904)，采用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)引物，上游引物序列為5’-CTAGCTAGCATGGCTTGGGA-CATGTGC-3’，下游引物序列為5’-CCGCTCGAGTTACCTGCGCAAGCTTCTC-3’，分別在引物的5’端添加XhoI和NheI的酶切位點(diǎn)，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。反應(yīng)條件為: 94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 45 s、54 ℃ 30 s、72 ℃ 60 s，共31個(gè)循環(huán)；72 ℃再延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物凝膠回收后，與真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA-3.1分別進(jìn)行XhoI和NheI雙酶切，T4 DNA連接酶連接構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNA-3.1-PGC-1α，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，挑取陽(yáng)性克隆，PCR初步鑒定，確定陽(yáng)性質(zhì)粒。

2.3 實(shí)驗(yàn)分組 取傳代后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞分為正常(normal)組、高糖(high glucose,HG)組、空載(empty vector, EV)組和PGC-1α過表達(dá)(PGC-1α)組，處理方法如下：正常組細(xì)胞使用普通DMEM培養(yǎng)基處理；高糖組、空載組和過表達(dá)PGC-1α組細(xì)胞使用最佳葡萄糖濃度的DMEM培養(yǎng)基處理；空載組細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載體；PGC-1α過表達(dá)組細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA-3.1-PGC-1α重組質(zhì)粒。

2.4 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力 將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞分別接種于96孔板中(每孔1×106個(gè)細(xì)胞)，每孔100 μL，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞分別于培養(yǎng)24 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)3～6 h，每孔加入100 μL甲臜溶解液孵育，在酶標(biāo)儀上測(cè)定各孔吸光度(A)值，同一時(shí)點(diǎn)的A值取其3個(gè)復(fù)孔的平均值。

2.5 Hoechst 33258染色 分別收集各組細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，小心吸出培養(yǎng)基，4%多聚甲醛室溫固定10 min，棄上清后于PBS中保存玻片。用0.2%的TritonX-100通透20～30 min后棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌玻片3次，加入Hoechst 33258染料，在含5% CO2的培養(yǎng)箱中37 ℃避光染色10 min，再用PBS避光洗滌玻片3次，干燥，封片，熒光顯微鏡觀察，拍照保存。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況 將各組細(xì)胞分別接種在6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)基并加入0.125%的胰蛋白酶消化，收集各組細(xì)胞，PBS洗滌2次后用PBS重懸細(xì)胞，加入5 μL Annexin V-FITC染色液避光孵育10 min，再次離心并用PBS重懸細(xì)胞，加入5 μL PI染色液，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡情況。

2.7 Western blot實(shí)驗(yàn) 采用RIPA法提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。12% SDS-PAGE分離目的蛋白，濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入 I 抗4 ℃孵育過夜，PBST沖洗3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的特異性 II抗，室溫孵育1 h，PBST沖洗3次，ECL試劑盒顯影曝片。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，采用單因素方差分析進(jìn)行多組間差異的比較，各組均數(shù)間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 MTT法篩選最佳葡萄糖濃度與作用時(shí)間

采用10、15、20、25和30 mmol/L濃度的葡萄糖處理細(xì)胞24 h、48 h和72 h后，MTT法檢測(cè)結(jié)果(圖1)顯示，不同濃度的葡萄糖處理細(xì)胞24 h，對(duì)細(xì)胞活力的影響較小，因此選擇24 h作為最佳作用時(shí)間。隨著葡萄糖濃度的上升，細(xì)胞活力逐漸減弱，說明葡萄糖可抑制RGC-5細(xì)胞增殖，根據(jù)抑制程度，選擇20 mmol/L葡萄糖作為最佳濃度。

Figure 1. Screening of glucose concentration and action time by MTT assay. Mean±SD.n=3.

圖1 MTT法篩選最佳葡萄糖濃度與作用時(shí)間

2 過表達(dá)PGC-1α促進(jìn)高糖刺激RGC-5細(xì)胞的活力

與正常組相比，高糖組細(xì)胞的活力顯著減弱(P<0.05)；空載組和高糖組細(xì)胞活力之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05);與空載組相比，PGC-1α過表達(dá)組細(xì)胞的活力顯著增強(qiáng)(P<0.05)，見圖2。

Figure 2. The cell viability was measured by MTT assay. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsEV group.

圖2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力

3 過表達(dá)PGC-1α抑制高糖刺激的RGC-5細(xì)胞凋亡

Hoechst 33258染色和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡結(jié)果顯示，正常組細(xì)胞核呈現(xiàn)橢圓形或圓形，其染色質(zhì)呈較均勻藍(lán)色，凋亡細(xì)胞較少；但高糖組和空載組凋亡細(xì)胞較多，且凋亡細(xì)胞核呈分葉狀或點(diǎn)狀，其染色質(zhì)發(fā)生凝集并呈亮藍(lán)色；PGC-1α過表達(dá)組凋亡細(xì)胞少于空載組，見圖3A。

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，高糖組和空載組細(xì)胞凋亡率較正常組顯著增高(P<0.05)，PGC-1α過表達(dá)組細(xì)胞凋亡率較空載組顯著降低(P<0.05)，但仍高于正常組(P<0.05),見圖3B。

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組相比，高糖組和空載組細(xì)胞Bax和p53蛋白的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與空載組相比，PGC-1α過表達(dá)組細(xì)胞Bax和p53蛋白的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)，Bcl-2蛋白的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)，見圖4。

4 過表達(dá)PGC-1α對(duì)高糖刺激的RGC-5細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組相比，高糖組和空載組細(xì)胞NGF、VEGF、PGC-1α、TFAM、POLG、ATP5O、COX5b、SOD1和SOD2蛋白的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；與空載組相比，PGC-1α過表達(dá)組細(xì)胞NGF、VEGF、PGC-1α、TFAM、POLG、ATP5O、COX5b、SOD1和SOD2蛋白的表達(dá)量顯著升高(P<0.05),見圖5。

Figure 3. Over-expression of PGC-1α inhibited apoptosis. A: the apoptosis was detected by Hoechst 33258 staining (×200); B: the apoptosis rate was analyzed by flow cytometry. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsEV group.

圖3 過表達(dá)PGC-1α抑制細(xì)胞凋亡

Figure 4. The expression of apoptosis-related proteins. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsEV group.

圖4 凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的變化

Figure 5. The effects of PGC-1α over-expression on oxidative stress of RGC-5 cells. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsEV group.

圖5 過表達(dá)PGC-1α對(duì)高糖模型RGC-5細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

討 論

DR是糖尿病引發(fā)的一系列眼內(nèi)并發(fā)癥，是成年人致盲的重要原因之一，其具體發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞對(duì)高血糖介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡具有高度敏感性，而視網(wǎng)膜感光細(xì)胞也是DR所致凋亡的主要細(xì)胞類型之一[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在糖尿病動(dòng)物模型中感光細(xì)胞凋亡增加[7]；在糖尿病患者中也掃描出光感受器層變薄現(xiàn)象[8]。感光細(xì)胞在DR早期的發(fā)展過程中發(fā)揮著被以往研究忽略了的重要作用[9]。

PGC-1α是一種強(qiáng)有力的線粒體和氧化代謝調(diào)節(jié)酶，在多種組織中均有表達(dá)。已經(jīng)有研究證明它和視網(wǎng)膜血管的發(fā)生以及缺血狀態(tài)時(shí)新生血管的形成密切相關(guān)[10]。此外，PGC-1α激酶還與光損傷下的光感受器存活相關(guān)[11]。耿慧霞等[12]的研究顯示PGC-1α過表達(dá)可抑制氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡，抑制ROS的產(chǎn)生，促進(jìn)線粒體生成和維護(hù)線粒體功能。有研究發(fā)現(xiàn)，高糖誘導(dǎo)的體外足細(xì)胞模型中PGC-1α表達(dá)顯著下調(diào)，而PGC-1α表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[13]。但PGC-1α對(duì)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的作用我們知之甚少。本研究結(jié)果表明過表達(dá)PGC-1α增強(qiáng)高糖模型RGC-5細(xì)胞的活力，抑制細(xì)胞凋亡，表明PGC-1α參與視網(wǎng)膜感光神經(jīng)元病變，過表達(dá)PGC-1α可能是遏制DR惡化的關(guān)鍵靶點(diǎn)。NGF的生物學(xué)作用非常廣泛，其參與視網(wǎng)膜細(xì)胞的分化、生長(zhǎng)以及死亡，內(nèi)源性NGF可沿軸突逆行至神經(jīng)元發(fā)揮作用，也可以通過軸突順行轉(zhuǎn)運(yùn)影響其遠(yuǎn)端的靶細(xì)胞，視網(wǎng)膜是高度分化的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，對(duì)感光細(xì)胞、雙極細(xì)胞及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞等起到營(yíng)養(yǎng)、支持、絕緣和保護(hù)作用[14]。氧化應(yīng)激損傷、ROS過度堆積、內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)紊亂以及線粒體損傷是導(dǎo)致糖尿病引起視網(wǎng)膜病變的重要原因[15]。TFAM參與線粒體基因的表達(dá)、維持mtDNA的完整性以及mtDNA損傷的修復(fù)過程[16]。 POLG是迄今為止在線粒體中發(fā)現(xiàn)的唯一一種DNA聚合酶，它在mtDNA復(fù)制與修復(fù)過程中扮演著重要的角色[17]。線粒體參與多種生物學(xué)功能，可調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖與凋亡。糖尿病可通過氧化應(yīng)激損傷線粒體DNA及線粒體抗氧化防御系統(tǒng)[18]。杜月光等[19]研究發(fā)現(xiàn)，中藥治療促進(jìn)糖尿病大鼠PGC-1α表達(dá)，降低了MDA含量，提高了SOD活性，從而減輕胰島素抵抗、氧化應(yīng)激及炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果也顯示過表達(dá)PGC-1α可提高高糖模型RGC-5細(xì)胞NGF、VEGF、TFAM、POLG、ATP5O、COX5b、SOD1和SOD2蛋白的表達(dá)量，即過表達(dá)PGC-1α可對(duì)抗糖尿病引起的過氧化物堆積，減輕氧化應(yīng)激及線粒體損傷，有效減緩DR的發(fā)展。

綜上所述，過表達(dá)PGC-1α可提高高糖模型RGC-5細(xì)胞的活力，抑制其凋亡，減輕氧化應(yīng)激及線粒體損傷，從而減緩DR的發(fā)展。