王志超， 張 弛， 張 燕， 岳 峰， 田 華， 焦 鵬， 秦樹存， 薛雅卓， 姚樹桐, 3△

(泰山醫(yī)學(xué)院 1護(hù)理學(xué)院， 2動(dòng)脈粥樣硬化研究所， 山東省高校動(dòng)脈粥樣硬化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 3基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 山東 泰安 271000； 4解放軍總醫(yī)院， 北京 100853； 5泰安市中心醫(yī)院， 山東 泰安 271000)

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)作為心腦血管疾病的主要病理基礎(chǔ)，是一個(gè)復(fù)雜的多細(xì)胞參與的慢性炎癥性病理過程，其中修飾后脂蛋白所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成和凋亡是AS發(fā)展的核心環(huán)節(jié)和造成斑塊不穩(wěn)定的決定性因素，進(jìn)而導(dǎo)致急性心腦血管病事件的發(fā)生[1]。近年來大量研究表明由caspase-12和C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)等介導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)凋亡途徑的活化參與了巨噬源性泡沫細(xì)胞凋亡過程，并在AS易損斑塊的形成中起著關(guān)鍵作用[2-4]。血脂異常是導(dǎo)致AS的主要危險(xiǎn)因素之一，其中氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)可引起內(nèi)皮細(xì)胞損傷及泡沫細(xì)胞形成、凋亡和壞死，進(jìn)而導(dǎo)致粥樣斑塊破裂，是公認(rèn)的AS獨(dú)立危險(xiǎn)因子。低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)除被氧化修飾外，也可在糖尿病環(huán)境中被糖基化修飾，形成糖基化脂蛋白，觸發(fā)氧化應(yīng)激，誘導(dǎo)CD36介導(dǎo)的血管平滑肌源性泡沫細(xì)胞形成[5]，并導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙和損傷[6]。既往研究中所采用的糖基化脂蛋白主要是在體外與糖共孵育經(jīng)非酶促反應(yīng)制備而成[7-8]，其生物特性與糖尿病(diabetes mellitus，DM)患者體內(nèi)的糖基化修飾脂蛋白可能還有一定的差異，因此為了進(jìn)一步證明糖基化脂蛋白致AS的臨床意義，本研究提取了糖尿病患者血漿低密度脂蛋白(LDL from DM patients，DM-LDL)，探討其對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

抗β-actin抗體、衣霉素(tunicamycin，TM)和4-苯基丁酸(4-phenylbutyric acid，PBA)(Sigma)；羧甲基賴氨酸(Nε-carboxy methyl lysine，CML)酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(上海藍(lán)基生物技術(shù)有限公司)；DMEM高糖培養(yǎng)基(HyClone)；胎牛血清(Gibco)；4×蛋白上樣緩沖液、二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide，DMSO)、 RIPA裂解液和BCA蛋白定量試劑盒(北京索萊寶公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)[3-(4,5-dimethylthiazol-2-y-l)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide，MTT](Genview)；Annexin V-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(凱基生物技術(shù)股份有限公司)；兔抗小鼠caspase-12多克隆抗體(Abcam)；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(北京中杉金橋公司)；增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pierce)；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜(Millipore);乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

2 方法

2.1 DM-LDL的提取 選取2017年1月～2017年12月接診的52例2型糖尿病患者，均符合2型糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，排除急性心肌梗死、半年內(nèi)發(fā)生過不穩(wěn)定性心絞痛或腦卒中、合并急慢性感染疾病、甲狀腺疾病、血液系統(tǒng)疾病、自身免疫系統(tǒng)疾病以及嚴(yán)重心肺、肝腎功能不全等患者。以血糖正常的健康志愿者為正常對(duì)照。收集空腹血漿，按照既往報(bào)道的方法[10]提取LDL，并采用ELISA法檢測(cè)其中的CML含量以評(píng)價(jià)其糖基化程度。實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)泰山醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)審議并通過，所有患者均簽署知情同意書。

2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與實(shí)驗(yàn)分組 小鼠源RAW264.7巨噬細(xì)胞(中國(guó)科學(xué)院上海生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫(kù))用含10%胎牛血清、100 mg/L鏈霉素和1×105U/L青霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基，于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。細(xì)胞處理前用無血清培養(yǎng)基處理12 h，隨機(jī)分為：(1)正常對(duì)照 (control) 組：培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)；(2)正常人來源低密度脂蛋白(normal LDL,n-LDL)處理組：培養(yǎng)液中加入50 mg/L n-LDL；(3) DM-LDL處理組：培養(yǎng)液中加入不同濃度 (25、50和100 mg/L) 的DM-LDL；(4) ERS誘導(dǎo)劑TM處理組：培養(yǎng)液中加入4 mg/L TM；(5) ERS抑制劑PBA預(yù)處理組：培養(yǎng)液中預(yù)先加入5 mmol/L PBA作用1 h，再加入100 mg/L DM-LDL。處理24 h后收集細(xì)胞。

2.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 接種于96孔板的細(xì)胞經(jīng)處理后，按既往報(bào)道的MTT分析方法[11]，檢測(cè)各孔吸光度(A)值。以正常對(duì)照組細(xì)胞A值為100%，其余各實(shí)驗(yàn)組A值以其各自占正常對(duì)照組A值的百分比表示。

2.4 LDH活性測(cè)定 接種于6孔板的細(xì)胞經(jīng)處理后，收集上清培養(yǎng)液，2 500 r/min離心10 min，按照LDH試劑盒說明書檢測(cè)上清液中LDH活性，以U/L表示。

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞經(jīng)過處理后，用不含EDTA的胰酶消化收集，冷PBS洗滌細(xì)胞2次，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入500 μL的Binding Buffer懸浮細(xì)胞；加入5 μL Annexin V-FITC混勻，再加入5 μL PI混勻；室溫、避光反應(yīng)15 min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.6 Western blot分析 按本課題組以前報(bào)道的方法[11]，即采用RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，BCA法蛋白定量，并加入4×上樣緩沖液，95 ℃中變性5 min。等量的各組總蛋白行SDS-PAGE分離并電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，根據(jù)Marker條帶裁剪所需目的蛋白和內(nèi)參照蛋白所對(duì)應(yīng)的膜，經(jīng)5%脫脂奶粉封閉4 h后，分別用兔多克隆抗體caspase-12(1 600)和鼠單克隆抗體β-actin(1 1 500)4 ℃孵育過夜(或室溫4～6 h孵育)，1×TBS-T洗膜3次,每次10 min，再與相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的 II 抗室溫孵育2 h。以β-actin作為內(nèi)參照。增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法顯色，應(yīng)用化學(xué)發(fā)光成像儀(上海歐翔科學(xué)儀器有限公司)進(jìn)行圖像采集。各蛋白條帶積分吸光度(integral absorbance，IA)值采用Image-Pro Plus軟件分析，并以靶蛋白IA值/β-actinIA值的比值反映靶蛋白的相對(duì)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用Student’st檢驗(yàn)分析兩組間差異，單因素方差分析(one-way ANOVA)檢驗(yàn)多組間差異，組間兩兩比較應(yīng)用SNK法。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 糖尿病患者和健康對(duì)照者的血糖、血脂及LDL中CML水平的比較

糖尿病患者符合2型糖尿病的診斷標(biāo)準(zhǔn)，其空腹血糖、甘油三酯和LDL均高于健康對(duì)照組(P<0.05)，且與健康對(duì)照組比較，糖尿病患者血漿LDL中的CML水平明顯增高(P<0.01)，見表1。

2 DM-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞損傷

分別采用MTT法和LDH試劑盒測(cè)定RAW264.7細(xì)胞的活力和LDH漏出情況，結(jié)果顯示與正常對(duì)照組相比，n-LDL處理組細(xì)胞活力和培養(yǎng)基中LDH活性的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)；而DM-LDL可明顯導(dǎo)致細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞活力降低，LDH漏出增加，尤其以50和100 mg/L濃度時(shí)更為顯著(P<0.01)，其對(duì)細(xì)胞的損傷作用與ERS誘導(dǎo)劑TM相似，見圖1。

表1 糖尿病患者和健康對(duì)照者空腹血糖、血脂和LDL中CML水平

Table 1. Fasting glucose and lipids in plasma and CML level in LDL of DM patients and healthy controls (Mean±SD)

*P<0.05,**P<0.01vshealthy controls.

Figure 1. DM-LDL induced RAW264.7 cell injury. The cell viability (A) and LDH activity (B) in media were determined. Mean±SD.n=8.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖1 DM-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞損傷

3 DM-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞凋亡

與正常對(duì)照組比較，n-LDL處理組的細(xì)胞凋亡率無明顯增加(P>0.05)；而50和100 mg/L的DM-LDL分別使凋亡率增加2.68和4.91倍(P<0.01)；TM作為陽性對(duì)照組，其細(xì)胞凋亡率為正常對(duì)照組的4.14倍(P<0.01)，見圖2。

Figure 2. DM-LDL induced apoptosis of RAW264.7 cells.The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry with Annexin V-FITC staining and expressed as the percentage of the number of Annexin V-FITC-positive cells to total cells. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group.

圖2 DM-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞凋亡

4 DM-LDL誘導(dǎo)caspase-12活化

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，n-LDL處理組的cleaved caspase-12水平與正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P>0.05)。50和100 mg/L DM-LDL處理組的cleaved caspase-12水平較正常對(duì)照組顯著增加(P<0.01)，TM組cleaved caspase-12水平亦較正常對(duì)照組顯著增加(P<0.05),見圖3。

5 PBA抑制DM-LDL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞損傷

與DM-LDL組比較，ERS抑制劑PBA預(yù)處理可明顯減輕DM-LDL所致的RAW264.7細(xì)胞損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞活力增加，LDH漏出減少(P<0.05)，見圖4。

6 PBA抑制DM-LDL誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞凋亡

與DM-LDL組比較，PBA預(yù)處理組的細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)，提示PBA可減少DM-LDL所致的RAW264.7細(xì)胞凋亡，見圖5。

Figure 3. DM-LDL induced activation of caspase-12. The protein levels of caspase-12 were examined by Western blot analysis. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖3 DM-LDL誘導(dǎo)caspase-12活化

Figure 4. PBA inhibited DM-LDL-induced RAW264.7 cell injury. The cells were pretreated with PBA (5 mmol/L) for 1 h and then incubated with DM-LDL at 100 mg/L for 24 h. The cell viability (A) and LDH activity (B) in the media were measured, respectively. Mean±SD.n=8.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsDM-LDL group.

圖4 PBA抑制DM-LDL誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞損傷

7 PBA抑制DM-LDL誘導(dǎo)的caspase-12活化

PBA明顯抑制DM-LDL所誘導(dǎo)的caspase-12活化，與DM-LDL組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖6。

討 論

AS 作為心腦血管疾病的主要病因，對(duì)人類的健康產(chǎn)生嚴(yán)重危害，而巨噬細(xì)胞作為粥樣斑塊中的主要炎性細(xì)胞，與AS進(jìn)展尤其晚期粥樣斑塊的破裂緊密相關(guān)。在AS晚期病變中，巨噬細(xì)胞過度凋亡通過分泌細(xì)胞炎性因子和蛋白水解酶促進(jìn)脂質(zhì)核心的增大，加劇炎癥反應(yīng)和壞死，導(dǎo)致粥樣斑塊穩(wěn)定性下降、破裂以及繼發(fā)血栓的形成，最終引起急性缺血性事件如心肌梗死、中風(fēng)的發(fā)生[12]。DM是AS的主要獨(dú)立危險(xiǎn)因素，研究表明AS在DM患者中的發(fā)生率是非DM患者的4～8倍[13]，其機(jī)制與晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)關(guān)系密切。DM患者血漿蛋白長(zhǎng)期處于高血糖環(huán)境中，通過非酶促糖基化反應(yīng)形成AGEs，從而通過損傷內(nèi)皮屏障、促進(jìn)泡沫細(xì)胞形成和凋亡以及鈣的沉積而破壞血管壁的完整性，同時(shí)還能通過受體依賴和非受體依賴途徑啟動(dòng)氧化應(yīng)激和炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)斑塊從穩(wěn)態(tài)發(fā)展到易損狀態(tài)并最終趨于破裂和血栓形成[14]。研究表明晚期糖基化白蛋白(advanced glycated albumin，AGE-alb)通過誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激等途徑促進(jìn)冠狀動(dòng)脈粥樣硬化，加速血管病變的進(jìn)展[15-16]，本課題組既往研究也證實(shí)，AGE-alb可誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡[17]。 LDL作為血漿中主要的脂蛋白，除被氧化修飾外，也可在糖尿病環(huán)境中被糖基化修飾。文獻(xiàn)報(bào)道在體外與糖共孵育制備的糖基化LDL可誘導(dǎo)氧化應(yīng)激、血管平滑肌源性泡沫細(xì)胞形成，促進(jìn)炎癥因子表達(dá)和巨噬細(xì)胞黏附并導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷[5-8]。本研究結(jié)果顯示，提取的DM-LDL中CML水平明顯增高，表明其已被糖基化修飾，并能夠?qū)е滦∈缶奘杉?xì)胞損傷，表現(xiàn)為細(xì)胞活力降低，LDH漏出和細(xì)胞凋亡增加，且其作用與ERS誘導(dǎo)劑衣霉素相似，提示DM-LDL可能通過激活ERS凋亡途徑誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞凋亡。

Figure 5. PBA inhibited DM-LDL-induced apoptosis of RAW264.7 cells. The cell apoptosis was analyzed by Annexin V-FITC/PI staining and expressed as the percentage of the number of Annexin V-FITC-positive cells to the total cells. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsDM-LDL group.

圖5 PBA抑制DM-LDL所致的RAW264.7細(xì)胞凋亡

Figure 6. PBA inhibited DM-LDL-induced activation of caspase-12. The protein levels of caspase-12 were examined by Western blot analysis. Mean±SD.n=3.**P<0.01vscontrol group;#P<0.05vsDM-LDL group.

圖6 PBA抑制DM-LDL所誘導(dǎo)的caspase-12活化

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)蛋白、脂質(zhì)合成的重要細(xì)胞器，同時(shí)也是Ca2+儲(chǔ)存的重要場(chǎng)所，其對(duì)環(huán)境變化十分敏感。氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過度聚集和高血糖等多種因素均可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能失衡，從而出現(xiàn)以未折疊/錯(cuò)誤折疊蛋白聚集和鈣穩(wěn)態(tài)失衡為主要特征的ERS反應(yīng)。一定程度的ERS通過暫時(shí)性抑制蛋白合成、激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)蛋白降解途徑和上調(diào)分子伴侶調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，達(dá)到維持細(xì)胞生存的目的[18-19]。但是過強(qiáng)或長(zhǎng)時(shí)間ERS則通過激活ERS凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致不可逆損傷，已有研究表明該過程可介導(dǎo)糖尿病患者內(nèi)皮細(xì)胞功能失調(diào)和AS的進(jìn)展[20]。Caspase-12是介導(dǎo)ERS凋亡機(jī)制的關(guān)鍵分子之一，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜以酶原形式存在，在ERS過程中被特異性剪切激活，進(jìn)而通過激活 caspase-3和caspase-9誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[21]。文獻(xiàn)報(bào)道[21]和我們既往研究[17]表明，ox-LDL和AGE-alb通過激活caspase-12途徑誘導(dǎo)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞凋亡，而成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子21[22]和大蒜素[23]可通過抑制caspase-12介導(dǎo)的ERS凋亡途徑減輕ApoE-/-小鼠AS斑塊細(xì)胞凋亡和巨噬源性泡沫細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與ERS誘導(dǎo)劑TM相似，給予RAW264.7巨噬細(xì)胞DM-LDL處理24 h，caspase-12活化水平明顯上調(diào)，而給予ERS 抑制劑 PBA預(yù)處理則顯著抑制DM-LDL所致的caspase-12活化，并可減輕小鼠巨噬細(xì)胞損傷和凋亡，表明caspase-12途徑可能是介導(dǎo)DM-LDL所誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制。PBA預(yù)處理雖然可減輕DM-LDL所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，但其凋亡率仍顯著高于正常對(duì)照組，表明可能還有其它機(jī)制參與該凋亡過程。CHOP是介導(dǎo)ERS凋亡途徑的另一關(guān)鍵分子，并在AS易損斑塊形成中具有重要作用[3, 10, 19]，其是否介導(dǎo)DM-LDL所誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞凋亡，還有待進(jìn)一步闡明。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DM-LDL可誘導(dǎo)RAW264.7巨噬細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與激活caspase-12介導(dǎo)的ERS 凋亡途徑有關(guān)。