吳源周， 王秋平， 肖 丹， 朱亞如， 方 舜△

(南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院 1心胸外科， 2病理科， 廣東 廣州 510280)

肺癌患者術(shù)后的復發(fā)和轉(zhuǎn)移是影響肺癌患者整體預后的重要因素，也是導致肺癌進展、致死的主要原因，嚴重影響患者的療效和生存質(zhì)量[1]。目前研究表明，腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)的激活和增多過程在肺癌等惡性腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移和復發(fā)中具有重要作用，因此探尋肺癌干細胞調(diào)控的相關(guān)分子，開發(fā)可以有效抑制肺癌CSCs的治療手段，對抑制肺癌的復發(fā)轉(zhuǎn)移，改善肺癌總體療效具有重要的臨床應(yīng)用價值[2]。本團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，let-7a-3p可能具有對腫瘤干細胞的確切抑制效果，有望成為肺癌的惡性腫瘤治療的有效手段[3]。然而，let-7a-3p對肺癌干細胞是否具有確切的抑制效果仍不明確，而且，其抑制腫瘤的起效機制也尚不明確[4]。何曉燕等[5]研究提示，let-7a-3p的同源類似物let-7a能顯著抑制肺癌細胞在裸鼠體內(nèi)的生長能力。這讓我們對進一步探討let-7a-3p在肺癌中的作用及其機制產(chǎn)生了興趣。Let-7a-3p是一種來自let-7a-1或let-7a-3干環(huán)左臂的成熟微小RNA(microRNA，miRNA，miR)。另外，也有報道認為，let-7a-3p也是let-7a-2的成熟miRNA之一，所以也被稱為let-7a-2-3p。 所以，let-7a前體經(jīng)一種核糖核酸內(nèi)切酶(Dicer酶)進一步加工，轉(zhuǎn)化為成熟的let-7a雙鏈體，隨后由真核翻譯起始因子Argonaute 3(Ago3)介導產(chǎn)生let-7a-3p。本團隊對let-7a-3p的靶基因進行生物信息學預測后發(fā)現(xiàn)，與多種惡性腫瘤生物學行為相關(guān)的胰島素樣生長因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)可能是其在肺癌細胞中的作用靶蛋白。本研究首先比較了肺癌細胞與正常支氣管上皮細胞中l(wèi)et-7a-3p表達水平的差異，進而采用let-7a-3p模擬物(let-7a-3p mimics)轉(zhuǎn)染人肺癌細胞系A(chǔ)549細胞，觀察其對肺癌細胞中CSCs功能和比例的影響，并通過研究其對CSCs相關(guān)功能蛋白及IGF1R蛋白表達水平的影響，進一步明確其分子生物學機制。

材 料 和 方 法

1 材料

人肺癌細胞株A549、NCI-H1299、SPC-A1、H1650和HCC-827及人正常支氣管上皮細胞株BEAS-2B購自美國模式培養(yǎng)物集存庫(American Type Culture Collection，ATCC)。DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清購自GIBCO；轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000購自Invitrogen；Real-time PCR逆轉(zhuǎn)錄-聚合鏈酶反應(yīng)試劑盒購自TaKaRa；兔抗人IGF1R、NANOG、OCT4、和GAPDH抗體購自Abcam；let-7a-3p mimics及其陰性對照(negative control mimic)、let-7a-3p及內(nèi)參照U6的PCR引物購自廣州亞科生物技術(shù)有限公司；雙螢光素酶檢驗試劑盒、野生型的WT-IGF1R-3’-UTR載體、3’-UTR定點突變后的MT-IGF1R-3’UTR載體及IGF1R過表達質(zhì)粒購自購自廣州松楊生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 miRNA轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染前后各組細胞系中l(wèi)et-7a-3p水平的RT-qPCR檢測 以含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)A549、NCI-H1299、SPC-A1、H1650、HCC-827和BEAS-2B細胞。按照轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000試劑說明書，在細胞融合度約60%～70%時以miRNA mimics終濃度為75 nmol/L轉(zhuǎn)染let-7a-3p mimics和negative control mimic，分別作為let-7a-3p組和negative control組， 轉(zhuǎn)染48 h；以未轉(zhuǎn)染的A549細胞作為對照(non-transfected)組。提取各組總細胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以U6 作為內(nèi)參照，進行RT-qPCR檢測。PCR條件按照課題組既往報道方法進行，所得數(shù)據(jù)用2-ΔΔCt法進行分析計算。Let-7a-3p的上游引物序列為5’-GCGCGTAGTCTGAGAGGTTG-3’, 下游引物序列為5’-CCAGGGAGTGTCCGAGGT-3’；U6的上游引物序列為5’-CTCCGGCGCTTAGCACA-3’，下游引物序列為5’-AACTTACGAATCGCTTGCGT-3’。

2.2 瘤球形成實驗檢測腫瘤干細胞特性 分別取轉(zhuǎn)染后各組肺癌A549細胞，胰酶消化，反復PBS洗滌離心后，采用DMEM高糖培養(yǎng)基重懸制成1×108/L的單細胞懸液。取低吸附6孔板，每孔加入細胞懸液2 mL細胞懸液，同前培養(yǎng)條件培養(yǎng)。12 d后計數(shù)培養(yǎng)板中出現(xiàn)的懸浮、透亮細胞球數(shù)量。每組細胞鏡下隨機計數(shù)3個視野。對每組3個視野瘤球數(shù)量的平均值進行統(tǒng)計比較。

2.3 流式細胞術(shù)檢測腫瘤干細胞比例 同前法，取轉(zhuǎn)染后各組肺癌A549細胞，胰酶消化，反復PBS洗滌離心后，PBS重懸制成1×108/L的單細胞懸液。同本團對研究報道方法[3]，加入CD133-FITC 熒光抗體避光孵育0.5 h 后，流式細胞術(shù)檢測CD133 陽性細胞率。

2.4 Let-7a-3p靶基因預測 運用生物信息學方法在miRBase數(shù)據(jù)庫中搜索let-7a-3p的序列, 進而分析let-7a-3p序列的特征并預測其可能的靶基因[6]。

2.5 Western blot法檢測細胞蛋白表達的變化 肺癌細胞分組轉(zhuǎn)染后48 h，按照既往報道方法[3]收集細胞，提取總蛋白，用Western blot法檢測IGF1R、NANOG和OCT4的蛋白水平，以GAPDH為內(nèi)參照。

2.6 雙螢光素酶實驗檢測let-7a-3p與IGF1R的關(guān)系 采用野生型的IGF1R psiCHECKTM-2載體及定點突變后的IGF1R psiCHECKTM-2載體，分別和let-7a-3p mimics一起通過脂質(zhì)體共轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后行雙螢光素酶活性檢測[3]。

2.7 IGF1R過表達對let-7a-3p抑制CSCs的拮抗作用 采用IGF1R過表達質(zhì)粒轉(zhuǎn)染let-7a-3p組A549細胞系，并通過Western blot檢測IGF1R過表達后let-7a-3p組細胞中相關(guān)蛋白的表達情況。

2.8 建立皮下移植瘤模型，觀察let-7a-3p對體內(nèi)腫瘤細胞的抑制作用 同本課題組前期研究報道的方法[7]，將經(jīng)過慢病毒包裝的let-7a-3p質(zhì)粒和經(jīng)過慢病毒包裝的negative control對照質(zhì)粒感染肺癌A549細胞。經(jīng)嘌呤霉素篩選，建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系。無免疫力的BALB/c裸鼠飼養(yǎng)于南方醫(yī)科大學實驗動物中心SPF環(huán)境下，動物合格證號為SCXK (粵) 2012-0002。分別收集3組對數(shù)生長期的細胞1×106個，于裸鼠左脅部皮下注射建立皮下移植瘤，設(shè)定21 d為觀察終點，取出移植瘤進行觀察。

3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行分析。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差分析后各組均數(shù)間的兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗。以P<0.01為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 肺癌細胞系和正常支氣管上皮細胞系中l(wèi)et-7a-3p表達水平的比較

采用RT-qPCR法檢測肺癌細胞系A(chǔ)549、NCI-H1299、SPC-A1、H1650和HCC-827及正常支氣管上皮細胞系BEAS-2B中l(wèi)et-7a-3p表達水平后發(fā)現(xiàn)，肺癌細胞系中l(wèi)et-7a-3p表達水平均明顯低于正常支氣管上皮細胞系(P<0.01)，見圖1。

Figure 1. Relative expression level of let-7a-3p in the lung can-cer cell lines and normal bronchial epithelial cell line was detected by RT-pCR. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsBEAS-2B cells.

圖1 肺癌細胞系和正常支氣管上皮細胞系中l(wèi)et-7a-3p表達水平檢測

2 轉(zhuǎn)染后A549細胞let-7a-3p表達水平的變化

分組轉(zhuǎn)染A549細胞48 h后，分別檢測3組細胞中l(wèi)et-7a-3p的表達水平，結(jié)果顯示let-7a-3p組的let-7a-3p表達水平明顯上調(diào)(P<0.01)，而negative control組的let-7a-3p表達水平與non-transfected組的差異沒有統(tǒng)計學顯著性，見圖2。

3 Let-7a-3p對A549細胞中的腫瘤干細胞潛能的影響

瘤球形成實驗發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過12 d的培養(yǎng)，可觀察到懸浮、透亮細胞球形成。研究發(fā)現(xiàn)let-7a-3p組瘤球數(shù)量明顯低于non-transfected組(P<0.01)，而negative control組與non-transfected組之間瘤球數(shù)量的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖3。

Figure 2. The expression levels of Let-7a-3p in the A549 cells after transfection. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnon-transfected group.

圖2 轉(zhuǎn)染后A549細胞中的let-7a-3p水平

4 Let-7a-3p對A549細胞中腫瘤干細胞比例的影響

流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)， let-7a-3p組的CD133+細胞比例[(0.32±0.03)%]明顯低于non-transfected組[(2.37±0.36)%，P<0.01]，而negative control組的CD133+細胞比例[(2.42±0.45)%]與non-transfected組之間的差異無統(tǒng)計學顯著性(P>0.05)，見圖4。

5 Let-7a-3p對A549細胞中CSCs相關(guān)功能蛋白表達的影響

Western blot實驗顯示，與non-transfected組相比，let-7a-3p組NANOG蛋白和OCT4蛋白表達量明顯降低(P<0.01)，而negative control組與對照組之間的蛋白表達的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖5。

6 Let-7a-3p靶基因的預測及與靶基因相互作用關(guān)系的雙螢光素酶實驗檢測

miRBase生物信息學預測結(jié)果表明，let-7a-3p與IGF1R的3’-UTR部分互補，IGF1R可能是let-7a-3p的靶基因，見圖6。進一步構(gòu)建3’-UTR定點突變型MUT-IGF1R-3’UTR載體和野生型WT-IGF1R-3’UTR載體，在let-7a-3p共轉(zhuǎn)染條件下，進行雙螢光素酶檢驗，結(jié)果顯示let-7a-3p能明顯抑制野生型WT-IGF1R-3’UTR載體的發(fā)光強度(P<0.01)，而無法抑制3’UTR定點突變型MUT-IGF1R-3’UTR載體的發(fā)光強度，說明IGF1R為let-7a-3p的下游靶基因，見圖7。

Figure 3. Sphere formation capacity in various groups. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnon-transfected group.

圖3 不同處理組細胞單克隆瘤球形成能力的比較

Figure 4. The proportion of CD133+cells in different treatment groups.

圖4 不同處理組CD133+細胞比例的比較

Figure 5. The effect of let-7a-3p on the protein expression of CSCs-related functional proteins in the A549 cells. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnon-transfected group.

圖5 Let-7a-3p對A549細胞CSCs相關(guān)功能蛋白表達的影響

Figure 6. Target gene of let-7a-3p predicted by bioinformatic method.

圖6 生物信息學預測let-7a-3p的靶基因

7 Let-7a-3p對A549細胞IGF1R蛋白表達水平的影響

轉(zhuǎn)染試劑脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染含有綠色熒光蛋白表達序列的IGF1R過表達質(zhì)粒載體48 h后，采用流式細胞術(shù)檢測綠色熒光蛋白陽性細胞比例為(87.52±3.06)%，與文獻報道的比例[8]接近，顯示轉(zhuǎn)染成功。進一步的Western blot結(jié)果顯示，與non-transfected組相比， let-7a-3p組的IGF1R蛋白表達量明顯降低，而negative control組與對照組之間的IGF1R蛋白表達水平的差異無統(tǒng)計學顯著性；IGF1R蛋白表達量的Western blot結(jié)果與let-7a-3p的PCR結(jié)果表現(xiàn)出負向相關(guān)關(guān)系，這說明let-7a-3p抑制IGF1R蛋白表達的效果顯著；并且，由圖5可見，經(jīng)過IGF1R質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染之后，let-7a-3p對NANOG和OCT4等腫瘤干細胞標志物的抑制作用受到明顯的拮抗，見圖5。

8 Let-7a-3p對A549細胞體內(nèi)皮下移植瘤生長能力的影響

第21 天時切取皮下移植瘤進行觀察，可見let-7a-3p組的皮下移植瘤明顯小于non-transfected組(P<0.01)，而2個對照組之間腫瘤大小的差異無統(tǒng)計學顯著性，見圖8。這表明升高let-7a-3p的表達水平可以抑制A549細胞皮下成瘤的增生能力。

Figure 7. The relative luciferase activity. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnon-transfected group.

圖7 Let-7a-3p與IGF1R相互作用關(guān)系的螢光素酶活性檢測

討 論

miRNA為相對保守的內(nèi)源性非編碼RNA，參與調(diào)控人類基因組中半數(shù)以上功能基因的表達。miRNA可以結(jié)合到靶蛋白mRNA的3’-UTR，引起靶mRNA的降解，進而抑制目的蛋白的翻譯。目前研究顯示，miRNA參與所有惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移等過程[4]。不同的miRNA在腫瘤的生物學過程中發(fā)揮“癌miRNA”或“抑癌miRNA”的功能。Let-7a在目前抑癌miRNA研究中受到關(guān)注[3-4]。

肺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移和復發(fā)是目前肺癌患者綜合治療失敗甚至致死的主因，如何有效抑制肺癌細胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和復發(fā)一直是肺癌研究的重要方向[1]。目前腫瘤干細胞理論認為，腫瘤干細胞是惡性腫瘤組織中存在的一小群具有干細胞特性的細胞，是腫瘤細胞中具有無限增殖和轉(zhuǎn)移潛能的重要亞群，是惡性腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移和復發(fā)的重要始動因素[9]。如果能夠?qū)Ψ伟└杉毎M行有效的基因治療抑制，可望實現(xiàn)良好的治療效果。 本團隊在前期研究中證實，miRNA let-7a可以抑制CD133+肝癌干細胞活性，實現(xiàn)對肝癌干細胞增殖轉(zhuǎn)移潛能的高效抑制[3]。所以，在后續(xù)研究中，我們希望驗證let-7a對肺癌腫瘤干細胞的作用及其起效機制，以開發(fā)有效的肺癌干細胞抑制手段。

Figure 8. The effect of let-7a-3p on the volume of A549 cell subcutaneously transplanted tumors. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsnon-transfected group.

圖8 Let-7a-3p對A549細胞皮下移植瘤體積的影響

本研究證實，let-7a-3p在多種肺癌細胞中的表達量明顯低于肺正常細胞系。該結(jié)果與既往相關(guān)研究報道相符。進而，我們采用let-7a-3p mimics轉(zhuǎn)染的方法，成功地提高了肺癌細胞中l(wèi)et-7a-3p的水平。進而發(fā)現(xiàn)let-7a-3p水平的升高可通過對肺癌干細胞標志物NANOG和OCT4表達水平的抑制，實現(xiàn)對肺癌干細胞的單克隆瘤球形成能力的抑制和肺癌干細胞比例的下調(diào)，表明let-7a-3p mimic具有抑制肺癌干細胞的潛能。

進而，我們對其抑制肺癌干細胞潛能的機制進行深入探索。通過生物信息學預測發(fā)現(xiàn)，let-7a-3p與IGF1R蛋白可能存在靶向調(diào)控關(guān)系，且其熱穩(wěn)定型和基因保守性較高。但是該靶向調(diào)控關(guān)系在肺癌細胞中是否存在，仍需要進一步的研究證明。IGF1R是一種跨膜酪氨酸受體蛋白[10]，它通過與其配體胰島素樣生長因子特異性結(jié)合誘導細胞有絲分裂，進而在腫瘤細胞中，產(chǎn)生對增殖、凋亡、血管生成及侵襲轉(zhuǎn)移有關(guān)的調(diào)控作用[11]。IGF1R與前列腺癌、乳腺癌和肺癌等惡性腫瘤密切相關(guān)[12-13]。我們采用構(gòu)建3’-UTR突變的真核載體，進行螢光素酶活性檢測發(fā)現(xiàn)，let-7a-3p確實通過靶向IGF1R蛋白的3’-UTR區(qū)產(chǎn)生作用，且let-7a-3p對肺癌干細胞中肺癌干細胞標志物NANOG和OCT4表達水平的抑制作用，可以被IGF1R的真核異位表達有效拮抗。同時，我們在體內(nèi)實驗研究中初步證明了let-7a-3p在體內(nèi)對A549細胞的抑制作用。前述研究說明，在肺癌細胞中，IGF1R為let-7a-3p直接的下游靶基因，且其靶向調(diào)控作用最終產(chǎn)生了對肺癌干細胞的調(diào)控作用。

綜上所述，let-7a-3p可能通過降低下游靶基因IGF1R水平影響肺癌干細胞相關(guān)標志物表達，進而實現(xiàn)對人肺癌A549細胞干性的抑制。該miRNA有可能成為高效肺癌基因治療的靶點。