王 帆， 王 豪▲， 宋雪斌， 孫慧珍， 光姣娜， 南文濱△， 張其清,2△

(1 新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院,生命科學(xué)與健康研究院， 河南 新鄉(xiāng) 453003； 2中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程研究所， 天津 300000)

糖尿病足是一種典型的慢性皮膚損傷，其臨床特征是創(chuàng)面長期不愈合、皮膚組織感染、缺損或壞死，無法經(jīng)過常規(guī)修復(fù)過程而及時修復(fù)。創(chuàng)面局部炎癥反應(yīng)是高血糖慢性皮膚損傷難愈合的主要原因之一[1-2]。巨噬細胞作為先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在維持機體炎癥反應(yīng)中發(fā)揮不可替代的作用，除了在炎癥期清除壞死組織外，還可以通過釋放一些炎癥因子來調(diào)節(jié)創(chuàng)面修復(fù)[3]。

巨噬細胞可以通過2種不同的方式來調(diào)節(jié)創(chuàng)面愈合，即經(jīng)典巨噬細胞活化(M1極化)和替代性巨噬細胞活化(M2極化)。在機體炎癥期時，巨噬細胞趨向于M1極化，分泌白細胞介素(interleukin, IL)-1、IL-6和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)等促炎性細胞因子；當(dāng)機體炎癥消散時，巨噬細胞趨向于M2極化，分泌IL-10和IL-13等抑炎性細胞因子，極化的變化過程影響了創(chuàng)面愈合過程中的炎癥反應(yīng)[4]。研究影響巨噬細胞極化的因素，調(diào)控巨噬細胞極化過程，無疑是解決難愈創(chuàng)面炎癥失衡問題的有效途徑。自噬是一種高度保守的細胞內(nèi)降解途徑，細胞通過溶酶體系統(tǒng)對胞內(nèi)集聚的蛋白質(zhì)和受損細胞器進行降解，從而使細胞維持自身穩(wěn)態(tài)。自噬是細胞應(yīng)對各種危險刺激時的保護機制[5-6]，近期多項研究表明其在調(diào)控機體炎癥水平方面發(fā)揮舉足輕重的作用[7]，然而自噬是否通過影響巨噬細胞極化過程，進而影響機體炎癥水平，亟待驗證。本研究以此為切入點，用自噬下游抑制劑巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1，Baf A1)干預(yù)巨噬細胞，觀察其對RAW264.7細胞極化的影響，同時用自噬激活劑雷帕霉素(rapamycin，Rapa)以及巨噬細胞M1極化激活劑脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)處理細胞，觀察細胞自噬情況，探討B(tài)af A1影響巨噬細胞極化的機制。

材 料 和 方 法

1 細胞與材料

1.1 細胞培養(yǎng)與實驗分組 鼠源RAW264.7巨噬細胞購自ATCC，用含10%胎牛血清、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)液在 37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細胞隨機分為如下4組：正常對照(control)組：培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng)；LPS組：培養(yǎng)液中LPS濃度100 mg/L；Rapa組：培養(yǎng)液中Rapa濃度100 μmol/L；Baf A1組：培養(yǎng)液中Baf A1濃度100 μmol/L。各組于加入藥物后12 h對細胞進行后續(xù)處理。

1.2 材料與試劑 Baf A1、LPS、Rapa和DMSO均購自Sigma；FITC標(biāo)記的HLA-DR抗體購自Novus; PE標(biāo)記的CD197、PE標(biāo)記的CD36和Alexa Fluor? 647標(biāo)記的CD206抗體購自BD;磷酸酶抑制劑、PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、Triton X-100和DAPI均購自碧云天公司；自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和P62抗體購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；GAPDH抗體購自杭州賢至生物有限公司；HRP標(biāo)記的羊抗兔Ⅱ抗、各細胞因子ELISA試劑盒、濃縮型正常山羊血清和Cy3標(biāo)記的羊抗兔IgG均購自武漢博士德生物工程有限公司；ECL底物液購自Thermo；抗熒光淬滅封片劑購自Southernbiotech。

2 觀察指標(biāo)及方法

2.1 ELISA測定炎癥相關(guān)因子的含量 按試劑盒說明書步驟操作，用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測吸光度(A)值；采用Originpro 8進行數(shù)據(jù)分析。

2.2 流式細胞術(shù)檢測細胞表面相關(guān)抗原表達 用不含EDTA的0.25%胰酶消化細胞后，終止消化，離心(500 ×g，4 ℃，5 min)去上清收集細胞，加PBS重懸細胞；離心后用含0.5%牛血清白蛋白(BSA)的PBS清洗2遍；每流式小管添加I抗，4 ℃孵育30 min；再次離心(500 ×g， 4 ℃，2 min)，PBS清洗2遍；最后用0.5 mL含0.5% BSA的PBS重懸后進行流式細胞儀檢測分析。用CD197和HLA-DR雙陽性率定量細胞M1極化程度，用CD36和CD206雙陽性率定量細胞M2極化程度。

2.3 免疫熒光化學(xué)法檢測LC3-Ⅱ的表達 在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用PBS清洗3次，每次3 min；用4%的多聚甲醛固定15 min，PBS清洗玻片3次，每次3 min；0.5% Triton X-100室溫通透20 min；PBS清洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸去多余水分，在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉30 min；吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的LC3-Ⅱ抗體并放入濕盒，4 ℃孵育過夜；PBST清洗爬片3次，每次3 min，吸去多余水分，滴加稀釋好的熒光Ⅱ抗(熒光Cy3標(biāo)記羊抗兔IgG)，于濕盒中37 ℃避光孵育1 h，PBST清洗爬片3次，每次3 min；滴加DAPI避光孵育5 min，PBST清洗4次，每次5 min；吸去多余水分，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，用ImageJ分析處理圖像。

2.4 Western blot檢測LC3-Ⅱ和P62表達 各組RAW264.7細胞經(jīng)RIPA處理后，采用BCA蛋白定量法檢測各組蛋白濃度，以保證各組樣品上樣量相同。待測蛋白與5×上樣緩沖液按4 1混合，100 ℃變性10 min。每組取蛋白40 mg，進行SDS-PAGE分離，然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，再用含5%脫脂奶粉的1×TBST緩沖液在搖床上室溫封閉1 h，TBST緩沖液漂洗后，分別加入LC3-Ⅱ、P62和GAPDH的Ⅰ抗(11 000)4 ℃孵育過夜，TBST漂洗PVDF膜3次，每次10 min，封閉液稀釋相應(yīng)的Ⅱ抗(12 000)后，常溫下孵育1 h。TBST漂洗PVDF膜3次，每次10 min，ECL發(fā)光試劑在曝光儀中進行曝光，以GAPDH為內(nèi)參照，實驗重復(fù)3次。采用Image Station 2000R圖像工作站采集圖像，進行灰度分析。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法(LSD法)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各處理組細胞相關(guān)炎癥因子的表達

ELISA結(jié)果顯示，與control組相比，LPS處理組中促炎細胞因子TNF-α短時間內(nèi)表達顯著升高(P<0.01)，Baf A1處理組4 h后顯著升高(P<0.05)，16 h時其表達量與LPS組無顯著差異；而Rapa組和control組促炎細胞因子TNF-α表達量無顯著差異。各處理組抑炎細胞因子IL-10和IL-13的分泌與control組相比無顯著差異，見圖1。

2 流式細胞術(shù)檢測各處理組細胞表面極化相關(guān)標(biāo)志物

結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS處理組和Baf A1處理組巨噬細胞表面CD197和HLA-DR的雙陽性率顯著升高(P<0.05)，Rapa處理組CD197和HLA-DR雙陽性率亦顯著升高(P<0.05)；LPS處理組和Baf A1處理組的細胞表面CD36和CD206表達與對照組相比均無顯著差異，Rapa處理組CD36和C206雙陽性率顯著升高(P<0.05)，見圖2。

3 免疫熒光化學(xué)法檢測各處理組細胞LC3-II表達

應(yīng)用免疫熒光技術(shù)檢測各處理組自噬小體形成情況，結(jié)果顯示，Baf A1處理組、Rapa處理組和LPS處理組自噬體形成較對照組顯著增多(P<0.05)，見圖3。

4 Western blot法檢測各組細胞自噬相關(guān)蛋白表達的變化

Western blot法檢測各組LC3-Ⅱ/Ⅰ和P62蛋白的表達，結(jié)果顯示，LPS處理組、Rapa處理組和Baf A1處理組與control組相比LC3-Ⅱ/Ⅰ蛋白表達量顯著升高(P<0.05)；與control組相比，LPS處理組P62水平顯著升高(P<0.05)，Rapa處理組P62水平顯著降低(P<0.05)，而Baf A1處理組P62水平無顯著改變，見圖4。

Figure 1. Effects of different treatments on expression of macrophage polarization related cytokines.Mean±SD.n=3.*P<0.05，**P<0.01vscontrol group.

圖1 不同處理對巨噬細胞極化相關(guān)細胞因子表達的影響

討 論

糖尿病足通常在創(chuàng)面表現(xiàn)出持續(xù)炎癥反應(yīng)，是一種炎癥反應(yīng)失衡的現(xiàn)象，也是導(dǎo)致創(chuàng)面難愈合的原因之一[8]。巨噬細胞是先天免疫系統(tǒng)的主要組成部分，在不同微環(huán)境中功能特性不同，按照其表型和分泌的細胞因子可分為兩大類，即經(jīng)典活化型巨噬細胞(M1型)和替代活化型巨噬細胞(M2型)。由細菌脂多糖和Th1細胞分泌的γ干擾素(interferon γ，IFN-γ)激活的巨噬細胞被稱為經(jīng)典激活的巨噬細胞，亦稱M1型巨噬細胞，主要分泌促炎性細胞因子；由Th2細胞因子激活的巨噬細胞稱為替代激活的巨噬細胞，亦稱M2型巨噬細胞，分泌抑炎性細胞因子，巨噬細胞在創(chuàng)面愈合過程的不同階段顯示不同的極化特征，在組織損傷修復(fù)和重塑中起到重要作用。然而影響巨噬細胞極化的因素有很多，例如在糖尿病患者機體中，晚期糖基化終末產(chǎn)物能夠使創(chuàng)面組織炎癥反應(yīng)持續(xù)[9]，因此，研究巨噬細胞極化的影響因素，通過藥物調(diào)控巨噬細胞極化過程來緩解炎癥失衡現(xiàn)象，進而促進難愈創(chuàng)面的愈合，是一種有效途徑。

Figure 2. Effects of different treatments on the surface polarization characteristics of macrophages. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2 不同處理對巨噬細胞表面極化特征的影響

細胞自噬是一種高度保守的細胞內(nèi)降解途徑，是細胞在應(yīng)對各種危險刺激時的一種保護機制，通過降解胞內(nèi)受損的大分子蛋白或細胞器，可以維持細胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)[10-11]。多項研究表明，自噬通路及其相關(guān)蛋白能夠參與調(diào)控免疫應(yīng)答和調(diào)控過度炎癥反應(yīng)。Salminen等[12]的研究發(fā)現(xiàn)伴隨著衰老過程，自噬功能逐漸減弱，引起炎癥小體，尤其是NLPR3的激活增加，說明自噬在炎癥小體的激活過程中起到負向調(diào)控的作用。然而自噬過程是否通過影響巨噬細胞的極化過程從而參與調(diào)控免疫應(yīng)答，相關(guān)的研究尚少。

本研究顯示，Baf A1可以阻斷自噬流，同時可以誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞RAW264.7分泌大量的促炎細胞因子TNF-α，且細胞表面抗原多表達CD197和HLA-DR等M1極化的特征標(biāo)志物，該結(jié)果與LPS誘導(dǎo)巨噬細胞M1極化的結(jié)果相似，同時，結(jié)合流式結(jié)果，Baf A1處理細胞后，M1極化相關(guān)標(biāo)志物明顯增加，故可說明Baf A1確實可以誘導(dǎo)巨噬細胞M1極化。一些相關(guān)研究也報道了類似結(jié)果，例如，在肥胖小鼠動物實驗中，自噬過程異常可導(dǎo)致巨噬細胞M1極化，引起肝臟過度炎癥進而導(dǎo)致肝損傷[13]。因此，我們推測，Baf A1抑制自噬過程導(dǎo)致的巨噬細胞M1極化，可能是使難愈創(chuàng)面炎癥失衡的原因之一。為進一步明確Baf A1誘導(dǎo)巨噬細胞M1極化的機制，我們用自噬激活劑Rapa、巨噬細胞M1極化誘導(dǎo)劑LPS作為對照，觀察各組藥物對巨噬細胞自噬小體形成的影響。免疫熒光結(jié)果顯示：Rapa組、Baf A1組和LPS組在藥物干預(yù)12 h后，均可觀察到巨噬細胞自噬小體的增加。該結(jié)果與預(yù)期一致，即Rapa作為自噬激活劑，可以增加巨噬細胞自噬小體的形成，而Baf A1是一種囊泡性H+-ATP酶質(zhì)子泵抑制劑，通過抑制液泡膜V-ATP酶的活性來抑制自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體，導(dǎo)致自噬體堆積，然而我們并不能確認LPS處理組自噬小體增多的原因。進一步用Western blot檢測各處理組細胞LC3-Ⅱ和P62表達水平，評估各組自噬流變化，結(jié)果顯示，Rapa組LC3-Ⅱ升高，而P62顯著降低，提示自噬流通暢且被激活，結(jié)合前面的結(jié)果，Rapa處理細胞對巨噬細胞的極化過程，并無規(guī)律性促進作用；而對于LPS處理組，LC3-Ⅱ蛋白表達升高，且同時P62大量累積，提示自噬流下游自噬溶酶體的形成被顯著抑制，造成大量自噬體累積，該抑制方式與Baf A1類似，結(jié)合前面有關(guān)Baf A1處理后巨噬細胞的極化特征數(shù)據(jù)，說明抑制自噬下游自噬溶酶體的形成可以導(dǎo)致巨噬細胞向M1方向極化。

Figure 3. The change of autophagy vesicles in RAW264.7 were detected by immunofluorescence (×400). Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖3 免疫熒光化學(xué)法檢測各處理組細胞自噬的變化

綜上所述，本實驗初步表明Baf A1作為自噬抑制劑可能參與抑制自噬溶酶體形成，并導(dǎo)致巨噬細胞向M1方向極化。該結(jié)論為解釋自噬過程調(diào)控炎癥平衡的機制提供了參考資料。能否通過調(diào)控自噬過程來影響巨噬細胞極化，進而調(diào)節(jié)慢性炎癥疾病的炎癥失衡現(xiàn)象，仍需進一步探討。

Figure 4. The changes of autophagy related proteins in each treatment group were detected by Western blot.Mean±SD.n=3.*P<0.05vscontrol group.

圖4 Western blot檢測各處理組細胞自噬相關(guān)蛋白的變化