賀瓊，郝佳琪，崔佳彬，劉云峰

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新型細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)漂染裝置探討＊

賀瓊1，郝佳琪1，崔佳彬1，劉云峰2

（1.山西醫(yī)科大學(xué)，山西 太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，山西 太原 030001）

細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)具有重要的醫(yī)學(xué)和生物學(xué)應(yīng)用價(jià)值，自發(fā)熒光的離體細(xì)胞可以間接反映在體細(xì)胞的生理狀態(tài)，是新藥研發(fā)、致病機(jī)制研究中的關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)步驟。熒光實(shí)驗(yàn)技術(shù)過程復(fù)雜，尤其是全程對細(xì)胞活性的高要求和暗室操作環(huán)境給實(shí)驗(yàn)人員帶來了極大挑戰(zhàn)。在黑暗環(huán)境中對活細(xì)胞進(jìn)行熒光染液漂洗是整個(gè)流程中最復(fù)雜的環(huán)節(jié)，漂染結(jié)果直接決定了實(shí)驗(yàn)?zāi)芊袢〉贸晒?。目前的漂染裝置僅適用于普通細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，無法實(shí)現(xiàn)黑暗中精準(zhǔn)操作。新型細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)漂染裝置通過玻片、六孔板盒、齒狀?yuàn)A的組合使用，解決了快速定位染液區(qū)，保證細(xì)胞活性良好的技術(shù)難題，為實(shí)驗(yàn)的高效成功進(jìn)行提供合理的工具支持。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)；熒光染液；實(shí)驗(yàn)裝置；細(xì)胞漂染

1 研究背景

細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)是生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域里一項(xiàng)復(fù)雜且意義深遠(yuǎn)的技術(shù)，其原理是將活體細(xì)胞浸泡在熒光染液中，通過化學(xué)反應(yīng)使細(xì)胞膜、核膜結(jié)構(gòu)脫致密化，便于脂溶性熒光探針通過細(xì)胞膜、核膜上開放的疏松小孔直達(dá)染色體，與DNA緊密連接，實(shí)現(xiàn)整個(gè)活體細(xì)胞自發(fā)熒光。高亮顯像大大方便了科研人員觀察細(xì)胞運(yùn)動、分裂、凋亡等生理過程，是醫(yī)學(xué)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)發(fā)展史上里程碑式的突破[1]。

為了避免日光對熒光探針發(fā)光亮度的削弱，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程包括反復(fù)熒光染料漂染及熒光顯微鏡觀察，都需在暗室中進(jìn)行。暗室環(huán)境如圖1所示。

此外，細(xì)胞離體后存活時(shí)間短，為實(shí)現(xiàn)客觀反映細(xì)胞的生理狀態(tài)，實(shí)驗(yàn)通常需要在2 h內(nèi)完成[2]。黑暗環(huán)境和有效窗口期短兩個(gè)特點(diǎn)共同要求實(shí)驗(yàn)員精準(zhǔn)且高效地完成每一個(gè)步驟。但是目前尚缺乏暗室細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)專用裝置，各課題組多將普通細(xì)胞實(shí)驗(yàn)裝置簡單改造后用于暗室熒光實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)流程缺乏規(guī)范性且效率低下。顯微鏡下細(xì)胞自發(fā)熒光如圖2所示。

圖1 暗室環(huán)境（開燈）

圖2 顯微鏡下細(xì)胞自發(fā)熒光

2 目的和意義

現(xiàn)有細(xì)胞漂染過程是用鑷子捏夾附著有細(xì)胞的玻片，在染色皿、培養(yǎng)液皿中反復(fù)淘洗，完成染色、固色和脫色流程。本新型細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)漂染裝置實(shí)現(xiàn)了全程固定玻片，簡化漂染流程的目的。本設(shè)計(jì)方案以期為相關(guān)實(shí)驗(yàn)室提升科研效率、降低實(shí)驗(yàn)成本、保證實(shí)驗(yàn)規(guī)范性提供有益幫助。

3 技術(shù)方案說明

使用的新型細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)漂染裝置由包括玻片、六孔板盒和齒狀?yuàn)A三部分構(gòu)成，三種構(gòu)件配合使用完成實(shí)驗(yàn)操作。

3.1 玻片部分

玻片主體為圓形，分為中央凹槽狀細(xì)胞區(qū)和外周平臺區(qū)。中央凹槽狀細(xì)胞區(qū)為熒光染液存儲和細(xì)胞染色區(qū)域，局部凹陷設(shè)計(jì)縮小了實(shí)際工作區(qū)，有助于節(jié)省染液，同時(shí)限制細(xì)胞移動，便于固色。外周平臺區(qū)由4個(gè)符號和玻片耳柄構(gòu)成，3個(gè)“+”號和一個(gè)“P”號共同圍出細(xì)胞區(qū)，有助于顯微鏡下快速定位細(xì)胞，“P”形符號用于維持玻片正向，當(dāng)“P”號始終向上時(shí)，代表整個(gè)玻片和內(nèi)部細(xì)胞朝向固定向上。玻片兩端有一對半圓形耳柄，與齒狀?yuàn)A配合使用移動玻片。玻片共設(shè)3種規(guī)格，每種規(guī)格玻片外形一致，內(nèi)部凹槽直徑不同，分別為5 mm、10 mm、15 mm，適用于不同大小、不同密度、不同種類細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)場景。玻片俯視圖如圖3所示。

熒光染色實(shí)驗(yàn)需進(jìn)行多次染色、漂洗、脫色、固色環(huán)節(jié)。為了防止細(xì)胞在液體反復(fù)沖刷下產(chǎn)生移位和損傷，玻片中央細(xì)胞凹槽內(nèi)部進(jìn)一步對兩處細(xì)節(jié)進(jìn)行設(shè)計(jì)：①凹槽側(cè)壁為自外下向內(nèi)上的斜形走向，與凹槽底面呈60°夾角，內(nèi)壓形側(cè)壁結(jié)構(gòu)形成物理屏障，防止染色和漂洗過程中細(xì)胞沖出凹槽；②凹槽底部附有多聚賴氨酸涂層，用于黏附細(xì)胞，防止細(xì)胞脫落。多具賴氨酸是一種新型生物涂層，具有黏附作用，同時(shí)不損傷細(xì)胞活性。玻片側(cè)視圖如圖4所示。

1—玻片；2—直徑5 mm的凹槽；3—直徑10 mm的凹槽；4—直徑15 mm的凹槽；5—玻片耳柄；6—十字標(biāo)志；7—“P”形標(biāo)志。

1—玻片；2—直徑5 mm的凹槽；3—直徑10 mm的凹槽；4—直徑15 mm的凹槽；5—玻片耳柄；8—凹槽側(cè)壁。

3.2 六孔板盒部分

六孔板盒的盒體為中空長方體，內(nèi)部設(shè)置中隔將盒體分為左右兩個(gè)結(jié)構(gòu)完全相同的區(qū)域。兩個(gè)區(qū)域頂部均有玻片架，玻片架上共有6對半圓形玻片卡槽，可同時(shí)承托固定6個(gè)圓形玻片，具體如圖5、圖6、圖7所示，實(shí)驗(yàn)員可以在六孔板上同時(shí)對6個(gè)玻片進(jìn)行操作，大大提高了實(shí)驗(yàn)效率，此玻片的有序盒內(nèi)收納也減少了混淆、漏染、誤染、重染情況的發(fā)生。

1—玻片；9—六孔板盒；10—玻片架。

9—六孔板；10—玻片架；11—中隔；12—玻片卡槽。

在染色和漂洗細(xì)胞時(shí)，中空的盒體設(shè)計(jì)可簡化換液流程。染色時(shí)，用移液槍將染液注射到玻片中央凹槽，待細(xì)胞著色完成后，用移液槍吸走染液，再向凹槽內(nèi)緩慢持續(xù)注入細(xì)胞培養(yǎng)液，當(dāng)培養(yǎng)液體積超過凹槽容積，液體流經(jīng)玻片外圍直接流入中空盒體內(nèi)?？涨缓畜w可暫時(shí)儲存漂洗液，無須在水槽中反復(fù)進(jìn)行換液清洗，待實(shí)驗(yàn)徹底完成后，取下玻片，倒空盒體即可。

9—六孔板；10—玻片架；11—中隔；12—玻片卡槽。

3.3 齒狀?yuàn)A部分

齒狀?yuàn)A由夾臂、彈簧、中軸、齒狀突起幾個(gè)部分構(gòu)成，具體如圖8所示。夾臂、彈簧、中軸為塑料材質(zhì)，齒狀突起為軟橡膠材質(zhì)。齒狀?yuàn)A夾臂末端有防滑磨砂紋，防止實(shí)驗(yàn)員戴手套后操作滑脫。齒狀突起有利于增大夾臂與玻片的接觸點(diǎn)摩擦力，可有效降低玻片側(cè)翻、滑脫的可能性，與使用傳統(tǒng)方法，即鑷子單點(diǎn)平夾玻片相比，玻片耳柄兩端同時(shí)受力可實(shí)現(xiàn)玻片平穩(wěn)移動，有助于減少對細(xì)胞的物理震蕩。同時(shí)，質(zhì)軟的突起設(shè)計(jì)便于鉗夾玻片耳柄且不易損傷玻片，延長使用壽命。

13—齒狀?yuàn)A；14—夾臂；15—彈簧；16—中軸；17—齒狀突起。

4 實(shí)施過程

首先評估實(shí)驗(yàn)最終需觀察的細(xì)胞數(shù)目和密度，以此為依據(jù)選擇相應(yīng)直徑凹槽的玻片，并放入六孔板盒。接下來將活體細(xì)胞放入玻片中央的凹槽，用移液槍吸取熒光染液和細(xì)胞培養(yǎng)液，反復(fù)對細(xì)胞進(jìn)行固色漂洗，洗脫液可直接流入六孔板盒空腔，全程無須移動玻片，僅吸換液體即可完成操作。待染色過程完成后，用齒狀?yuàn)A鉗夾住玻片兩端耳柄，水平移動到顯微鏡下進(jìn)行觀察。

5 裝置優(yōu)點(diǎn)

5.1 精準(zhǔn)性

熒光實(shí)驗(yàn)在黑暗環(huán)境中進(jìn)行，科研工作者將實(shí)驗(yàn)細(xì)節(jié)諳熟于心和使用得心應(yīng)手的工具是實(shí)現(xiàn)精確無誤操作的雙重保險(xiǎn)。為配合實(shí)驗(yàn)人員順利完成操作，本裝置在玻片凹槽、玻片表面標(biāo)志兩方面進(jìn)行創(chuàng)新：①玻片凹槽。梯形凹槽使細(xì)胞局限在固定區(qū)域，防止細(xì)胞移動滑脫，便于精確觀察細(xì)胞。②表面標(biāo)志。玻片表面“+”和“P”形符號有助于顯微鏡下快速準(zhǔn)確定位細(xì)胞區(qū)域，便于查找。

5.2 穩(wěn)定性

離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)最重要的是保證細(xì)胞的活性良好，才能認(rèn)為所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)客觀真實(shí)地反映了細(xì)胞的在體狀態(tài)。而確保細(xì)胞活性的關(guān)鍵是減少細(xì)胞移動，但是漂洗過程中多次移動玻片于不同培養(yǎng)皿以及液體反復(fù)沖刷，均易對細(xì)胞活性造成破壞，導(dǎo)致失活甚至死亡[3]。本裝置不需移動玻片即可完成細(xì)胞漂染、縮小的凹槽細(xì)胞區(qū)減少流動液體量、齒狀?yuàn)A平穩(wěn)移動玻片，有效穩(wěn)固細(xì)胞，減少對細(xì)胞的人為損傷。

5.3 普適性

玻片凹槽設(shè)置3種規(guī)格，六孔板盒可同時(shí)容納1～6個(gè)玻片，科研人員可根據(jù)需要自行選擇玻片規(guī)格和數(shù)量，以適應(yīng)不同實(shí)驗(yàn)場景。

6 結(jié)束語

細(xì)胞熒光試驗(yàn)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重大突破中扮演著重要角色，諸如糖尿病藥物研發(fā)、艾滋病防治、人工受精技術(shù)研究中都涉及到細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)[4-5]。細(xì)胞漂染是整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中最關(guān)鍵的一步，染色程度直接決定了細(xì)胞自發(fā)熒光的強(qiáng)弱。染色過淺，細(xì)胞發(fā)光弱難以定位，染色過深，容易損傷細(xì)胞活性，只有染色適當(dāng)?shù)募?xì)胞，才能在顯微鏡下呈現(xiàn)最佳生理觀察效果[6]。本新型漂染裝置是一種專為細(xì)胞熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)明的輔助工具，旨在簡化、精確化、規(guī)范化細(xì)胞漂染操作。希望以合理的細(xì)節(jié)設(shè)計(jì)幫助相關(guān)領(lǐng)域的科研人員提高實(shí)驗(yàn)效率，減少人為誤差，得出科學(xué)、真實(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)論。

［1］季宇彬.熱激活延遲熒光分子探針在生物成像中的研究進(jìn)展［J］.中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2018（13）：532-538.

［2］楊媛.熒光探針在細(xì)胞成像領(lǐng)域的研究進(jìn)展［J］.功能材料，2018（9）：31-37.

［3］孫靜靜.雜交瘤細(xì)胞體外大規(guī)模培養(yǎng)研究進(jìn)展［J］.中國生物工程雜志，2018（10）：82-89.

［4］劉原.間接免疫熒光法在艾滋病合并肺孢子菌肺炎診斷中的應(yīng)用［J］.中華實(shí)驗(yàn)和臨床病毒學(xué)雜志，2014（2）：139-141.

［5］采麗.縱隔原發(fā)生殖細(xì)胞腫瘤56例臨床病理分析［J］.臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2018（2）：162-165.

［6］賈永梅.核酸熒光探針在單細(xì)胞成像中的應(yīng)用研究［J］. 分析化學(xué)，2019（46）：1329-1338.

2095－6835（2019）05－0037－03

Q2-33

A

10.15913/j.cnki.kjycx.2019.05.037

賀瓊，碩士研究生

劉云峰，研究生導(dǎo)師。

2018年山西省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目“鞘氨醇-1-磷酸促進(jìn)胰島素釋放的鈣濃度調(diào)節(jié)機(jī)制研究”（編號：2018165）

〔編輯：王霞〕