周祥明，楊兵，賴巧，李樂，董軍，廖建友，朱爽

(1.廣東藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，廣東 廣州 511400； 2.中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院，廣東 廣州 510030)

非編碼RNA(non-coding RNA，ncRNA)是指不編碼蛋白質(zhì)的RNA，包括長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)、核糖體RNA(ribosomal RNA，rRNA)、核小RNA(small nuclear RNA，snRNA)和microRNA 等等[1-4]。它們參與調(diào)控了幾乎所有的細(xì)胞生命活動過程。ncRNA主要通過與其結(jié)合蛋白的互作來發(fā)揮調(diào)控功能。例如，各種lncRNA都是通過與常規(guī)的和非常規(guī)的RNA結(jié)合蛋白(RNA binding protein，RBP)的互作來調(diào)控各種生命活動過程[5]，rRNA通過與蛋白質(zhì)翻譯機(jī)器蛋白的互作來行使翻譯功能，而microRNA則通過與AGO蛋白的結(jié)合來抑制mRNA翻譯或者促進(jìn)mRNA降解來調(diào)控基因表達(dá)[6]。因此確定ncRNA的RBP對理解ncRNA功能至關(guān)重要。由于每個ncRNA都不止與一種蛋白發(fā)生互作，極大地增加了ncRNA功能和調(diào)控機(jī)制的研究難度。例如，近期研究顯示U1 snRNA在體內(nèi)與超過400種RNA結(jié)合蛋白互作[7]。而目前絕大多數(shù)ncRNA的互作蛋白都是未知的，嚴(yán)重阻礙了我們對ncRNA在細(xì)胞生命活動中所扮演角色的理解，因此亟需系統(tǒng)地去鑒定各種ncRNA的互作蛋白組。

5S rRNA是一個長度為120 nt的小RNA,在原核生物和真核生物中都具有高保守性的二級和三級結(jié)構(gòu)。在1960年，5S rRNA在核糖體中首次被發(fā)現(xiàn)[8]。在1971年，首次報道了大腸桿菌在缺失5S rRNA的情況下不能合成多肽從而導(dǎo)致翻譯終止，證明5S rRNA是核糖體的重要組成部分。在真核生物細(xì)胞中，5S rRNA與eL5/L18家族蛋白，23S rRNA結(jié)合構(gòu)成了核糖體的主要成分[9]。進(jìn)一步研究表明，5S rRNA除了參與蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控外，還可能具有其它的調(diào)控功能。例如，Andria Pelava等[10]發(fā)現(xiàn)5S rRNA可以通過結(jié)合腫瘤抑制因子p53來參與腫瘤發(fā)生發(fā)展的調(diào)控。然而目前還缺乏對5S rRNA相互蛋白的系統(tǒng)研究工作，不清楚5S rRNA的互作蛋白組全貌是怎樣的，所以對5S rRNA的互作蛋白組系統(tǒng)解析將可以幫助我們更全面地認(rèn)識5S rRNA這種細(xì)胞生命活動過程中最重要調(diào)控因子之一的功能和調(diào)控機(jī)制。

本研究將利用國際上最先進(jìn)的ncRNA互作蛋白組研究技術(shù)ChIRP-MS[7](chromatin isolation by RNA purification-mass spectrometry，圖1A)首次鑒定出5S rRNA互作蛋白組，并采用系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析方法(圖1B)探究5S rRNA 新的調(diào)控功能和分子機(jī)制。

圖1 ChIRP-MS流程及生物信息學(xué)分析流程Fig.1 Procedures of ChIRP-MS and Bioinformatics analysis

1 材料與方法

1.1 ChIRP-MS實驗

1.1.1 探針設(shè)計 在UCSC網(wǎng)站上查詢目的基因序列。根據(jù)目的基因序列設(shè)計探針，并在上海生工合成生物素標(biāo)記探針。

1.1.2 收集細(xì)胞并交聯(lián) 收細(xì)胞后計數(shù)。加入φ=3%甲醛溶液(用PBS按照107個細(xì)胞10 mL配置)重懸細(xì)胞，顛倒混勻，在搖床上室溫混勻30 min。加入1/10體積的1.25 mol/L甘氨酸(glycine)，混勻后在搖床上室溫?fù)u5 min。4 ℃離心棄上清。預(yù)冷PBS洗一次，4 ℃離心棄上清。按每2×107個細(xì)胞的1 mL PBS的量加入預(yù)冷PBS并重懸。每個1.5 mL管加入1 mL細(xì)胞懸浮液分裝，4 ℃離心棄上清。

1.1.3 裂解細(xì)胞 細(xì)胞稱重，加入Lysis Buffer重懸細(xì)胞(0.05 mol/L Tris-HCl pH7.0，10 mmol/L EDTA，w=1% SDS。按照每100 mg細(xì)胞添加1 mL Lysis Buffer。Lysis Buffer中提前加入蛋白酶抑制劑、PMSF和RNasin)。

1.1.4 超聲打斷DNA和RNA 4 ℃水浴中用最高能量以30 s ON，45 s OFF條件超聲細(xì)胞。取5 μL檢測超聲效果，如果DNA大小在100～500 bp，說明超聲完成，如果不是，則繼續(xù)超聲。

1.1.5 雜交 將超聲樣品4 ℃離心取上清，取細(xì)胞裂解液體積的1/100作為Input對照。取10 μL鏈霉親和素磁珠用100 μL Lysis Buffer洗三次(該磁珠用于去除非特異結(jié)合的蛋白)。將細(xì)胞裂解液轉(zhuǎn)移到15 mL管中，加入Hybridization Buffer(750 mmol/L NaCl,w=1% SDS,50 mmol/L Tris-HCl pH7.0,1 mmol/L EDTA pH 8.0,w=15% Formamide。每1 mL Lysis Buffer添加2 mL Hybridization Buffer，并提前加入蛋白酶抑制劑、PMSF和RNasin)。加入10 μL洗過的磁珠，在雜交爐中37 ℃洗30 min后棄磁珠。每2×107個細(xì)胞加入1 μL 100 μmol/L探針，在雜交爐中37 ℃孵育過夜。取100 μL磁珠，用Lysis Buffer洗三次。用裂解細(xì)胞相同體積的Lysis Buffer(加入蛋白酶抑制劑、PMSF和RNasin)來將磁珠懸浮。在雜交結(jié)束后，將磁珠懸浮液加到每個管中，在雜交爐中37 ℃旋轉(zhuǎn)混勻30 min。用1 mL Wash Buffer(2×SSC,w=0.5% SDS)洗5次磁珠。在最后一次洗脫完成后，先加入與磁珠等體積的Wash Buffer，取10 μL磁珠用于提RNA，剩下所有磁珠用于提蛋白。

1.1.6 qRT-PCR檢測ncRNA是否被探針捕獲 在10 μL RNA Input中加入85 μL RNA PK Buffer pH7.0(100 mmol/L NaCl,10 mmol/L Tris-HCl pH.7.0,1 mmol/L EDTA pH8.0，w=0.5% SDS)，加入5 μL Proteinease K。10 μL磁珠中加入95 μL的RNA PK Buffer pH7.0，加入5 μL Proteinease K。在雜交爐中50 ℃孵育45 min。加入100 μL DEPC水，加入200 μL酚氯仿(苯酚∶氯仿=1∶1)，劇烈渦旋5 s。4 ℃離心取上清加入等體積氯仿，劇烈渦旋5 s。4 ℃離心取上清，加入1/10體積3 mol/L NaAc，0.5 μL 糖元(glycogen blue)，3倍體積無水乙醇，-20 ℃沉淀過夜。4 ℃離心棄上清，真空抽干后用10 μL DEPC處理水回溶。qRT-PCR檢測目標(biāo)ncRNA和GAPDH mRNA的豐度。

1.1.7 回收蛋白用于MS 棄上清留磁珠，加入與磁珠等體積的Biotin elution Buffer(12.5 mmol/L D-biotin，7.5 mmol/L HEPES pH7.5，75 mmol/L NaCl，1.5 mmol/L EDTA pH8.0，w=0.15% SDS，w=0.075% sarkosyl，w=0.02%Na-Deoxycholate，6.4×10-3mol/L NaOH)，渦旋混勻后室溫靜置20 min，65 ℃干浴10 min，收集上清。再次加入與磁珠等體積的Biotin elution Buffer，室溫靜置20 min，65 ℃干浴10 min，合并兩次上清。加入4倍體積預(yù)冷丙酮，-20 ℃沉淀過夜。4 ℃離心棄上清，室溫靜置1 min，立刻加入30 μL 1×laemmli sample buffer (biorad)。95 ℃干浴30 min，每5 min混勻一次，最終獲得蛋白樣品。蛋白樣品跑w=10% SDS-PAGE膠后銀染并用于質(zhì)譜檢測。

1.2 蛋白序號轉(zhuǎn)換基因名

Uniport(The Universal Protein Resource)是一個蛋白序列和蛋白功能的綜合性數(shù)據(jù)庫[11]，并且是目前信息最豐富、資源最廣的免費蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫。本研究利用uniprot在線轉(zhuǎn)換工具將蛋白序號(protein accession)轉(zhuǎn)換成基因名(gene symbol)。

1.3 蛋白復(fù)合體富集分析與PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

了解細(xì)胞內(nèi)的不同分子間的互作有助于健康和疾病的深入研究，所以急需一個可以將不同分子互作數(shù)據(jù)庫整合起來的綜合性數(shù)據(jù)庫。ConsensusPathDB就是這樣的一個數(shù)據(jù)庫，它整合了超過30個分子互作相關(guān)的人、鼠和酵母數(shù)據(jù)庫，總共包括了215 541個分子互作(蛋白與蛋白互作、生化反應(yīng)、基因調(diào)控互作)和4 601條通路信息，并可將這些信息可視化[12-13]。文章中利用ConsensusPathDB分析獲得5S rRNA互作蛋白組的蛋白復(fù)合體富集信息。

STRING 數(shù)據(jù)庫(Search Tool for the Retrival of Interacting Genes/Proteins Database) 是一個搜尋蛋白質(zhì)之間互作的數(shù)據(jù)庫。它能夠幫助用戶輕松獲取獨特的、覆蓋范圍廣的實驗以及預(yù)測的互作關(guān)系信息，既包括蛋白質(zhì)之間的直接物理互作，也包括蛋白質(zhì)之間的間接功能相關(guān)性。它除了包含有實驗數(shù)據(jù)、從PubMed摘要中挖掘的結(jié)果和綜合其他數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)外，還可利用生物信息學(xué)方法預(yù)測結(jié)果。Cytoscape 是一款圖形化顯示網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析和編輯的軟件，我們利用Cytoscap 將STRING數(shù)據(jù)庫查詢的蛋白互作信息可視化并構(gòu)建蛋白與蛋白互作(protein-protein interaction network,PPI)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 GO 注釋富集和KEGG信號通路富集

GO(Gene Ontology)是一個提供基因及產(chǎn)物功能注釋信息的數(shù)據(jù)庫。KEGG(Kyoto Encyclopediaof Gene and Genome)是一個包含基因、通路、疾病、藥物的綜合數(shù)據(jù)庫[12]。利用GO和KEGG對目標(biāo)基因進(jìn)行分析，從而預(yù)測該基因參與的生物過程(biological process，BP)、細(xì)胞分布(components of cells,CC)、分子功能(molecular function，MF)及參與通路(pathway)。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)源5S rRNA互作蛋白的捕獲和檢測

ChIRP-MS技術(shù)是近年發(fā)展起來的一種系統(tǒng)鑒定特定RNA內(nèi)源互作蛋白組的技術(shù)。它首先利用甲醛交聯(lián)細(xì)胞，再用生物素修飾DNA 探針捕獲目標(biāo)RNA，然后經(jīng)過鏈霉親和素磁珠吸附純化和洗脫，結(jié)合高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(HPLC-MS)技術(shù)，最終獲得目標(biāo)RNA內(nèi)源互作蛋白組[14](圖1A)。使用人模式細(xì)胞Hela來研究5S rRNA的內(nèi)源互作蛋白組，細(xì)胞培養(yǎng)后利用φ=3%甲醛對細(xì)胞做了交聯(lián)處理并進(jìn)行超聲。利用在線ChIRP探針設(shè)計軟件ChIRP-Designer，設(shè)計了針對5S rRNA的特異探針(表1)。為了減少質(zhì)譜結(jié)果的非特異性，我們同時設(shè)計了一條靶向細(xì)菌RNA的NC對照組探針(表1)。在利用所設(shè)計的探針捕獲5S rRNA互作蛋白后，取一部分去提RNA。通過實時定量PCR(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測，發(fā)現(xiàn)5S rRNA探針捕獲到的5S rRNA占input 5S rRNA的(23±2.3)%(圖2A)，而5S rRNA探針幾乎沒有捕獲到GAPDH mRNA。NC對照組探針幾乎沒有捕獲到5S rRNA和GAPDH mRNA。該結(jié)果說明我們成功地利用所合成的5S rRNA探針特異地捕獲到了5S rRNA，且NC對照組探針的特異性是非常高的。將探針捕獲到的5S rRNA互作蛋白跑SDS-PAGE膠后銀染。銀染結(jié)果顯示5S rRNA互作蛋白分布于整個泳道，相比之下NC對照組探針泳道沒有明顯信號，這說明5S rRNA在細(xì)胞內(nèi)可能結(jié)合有大量的蛋白，而這里面的絕大部分蛋白可能都是未知的(圖2B)。

表1 本研究中的序列Table 1 The sequences in this study

雖然qRT-PCR結(jié)果顯示此次實驗所使用的5S rRNA探針捕獲到的5S rRNA達(dá)到了input 5S rRNA的(23±2.3)%(圖2A)。但是在以后的ChIRP-MS實驗中，需要進(jìn)一步提高5S rRNA探針的捕獲效率從而提高實驗成功率。可考慮同時設(shè)計多條探針并比較他們捕獲效率后，再選取捕獲效率最高的探針進(jìn)行實驗。

圖2 5S rRNA捕獲效率檢測及銀染Fig.2 5S rRNA captured efficiency detection and silver staining

2.2 HPLC-MS鑒定5S rRNA互作蛋白組

隨后用HPLC-MS系統(tǒng)鑒定了NC對照組探針和5S rRNA特異探針捕獲到的蛋白。NC對照組共檢測出266個蛋白質(zhì)，5S rRNA組共檢測出334個蛋白質(zhì)。為了進(jìn)一步減少質(zhì)譜結(jié)果的非特異性，提高質(zhì)譜結(jié)果可信度，首先去除兩組蛋白中質(zhì)譜信號低的蛋白，也即protein match<3的蛋白；隨后再去除樣品組和NC對照組中所有的角蛋白；最后在5S rRNA的蛋白列表中移除NC中同樣存在的蛋白；最終獲得了162個高可信度的5S rRNA內(nèi)源互作蛋白,并用uniprot在線轉(zhuǎn)換工具將protein accession轉(zhuǎn)換為gene symbol。表2展示了5S rRNA互作蛋白組中質(zhì)譜信號排名前20的蛋白。

表2 5S rRNA互作蛋白組中質(zhì)譜信號排名前20的蛋白
Table 2 The top 20 proteins of MS signal in the 5S rRNA interactome

Protein accessionGene symbolProtein matchMUC19_HUMANMUC1984SSF1_HUMANPPAN73RAB7B_HUMANRAB7B62MYH7_HUMANMYH743DYHC1_HUMANDYNC1H135CE290_HUMANCEP29032DYH10_HUMANDNAH1030DMD_HUMANDMD29MDN1_HUMANMDN128SRSF7_HUMANSRSF726SCNND_HUMANSCNN1D26RL5_HUMANRPL525NUCL_HUMANNCL24ACTB_HUMANACTB23RL13_HUMANRPL1321HNRPM_HUMANHNRNPM21MYOF_HUMANMYOF21CRYAA_HUMANCRYAA21SPAT1_HUMANSPATA121HNRPC_HUMANHNRNPC20

2.3 5S rRNA互作蛋白組復(fù)合體富集分析和PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

利用ConsensusPathDB數(shù)據(jù)庫中的復(fù)合體富集分析(protein complex-based gene sets analysis)對5S rRNA的互作蛋白組成分進(jìn)行了系統(tǒng)分析(圖3A)。分析結(jié)果顯示5S rRNA的互作蛋白組顯著富集了核糖體、蛋白質(zhì)翻譯相關(guān)的蛋白復(fù)合體。例如，Nop56p-associated pre-rRNA complex[15]、PGC-1-SRp40-SRp55-SRp75 complex[16]、Ribosome, cytoplasmic、60S ribosomal subunit，cytoplasmic、40S ribosomal subunit，cytoplasmic等。這與人們熟知的5S rRNA蛋白翻譯調(diào)控功能相一致。此外，還可以看到5S rRNA互作蛋白組中還包含其它蛋白復(fù)合體，包括：TRBP containing complex[17]、TNF-α/NF-κB signaling complex 6、Spliceosome、capped, methylated pre-mRNP: CBC complex[18]、DGCR8 multiprotein complex[19]、Large Drosha complex[20]、TLE1 corepressor complex[21]、p54nrb/PSF/Matrin3/inosine RNA[22]、H2AX complex, isolated from cells without IR exposure[23]、Emerin complex 25[24]、SNW1 complex[25]等等。以上結(jié)果說明5S rRNA可能不僅僅參與了蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控，可能還參與了microRNA加工成熟調(diào)控和RNA轉(zhuǎn)錄調(diào)控、mRNA剪接調(diào)控、細(xì)胞信號通路調(diào)控、DNA損傷修復(fù)等過程。進(jìn)一步利用STRING數(shù)據(jù)庫對5S rRNA互作蛋白組中質(zhì)譜信號排名前50的蛋白繪制了PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3B)。結(jié)果顯示，5S rRNA互作蛋白組間也有復(fù)雜的互作模式，并且其構(gòu)成的PPI網(wǎng)絡(luò)是由HNRNP家族[27]、SR蛋白家族[27]、核糖體蛋白RPL家族與DDX5蛋白[28-29]構(gòu)成網(wǎng)絡(luò)主體。這些蛋白都是我們所熟知的，其在細(xì)胞中發(fā)揮著重要生物學(xué)功能。這些功能包括：核糖體構(gòu)成和mRNA剪接。這些互作網(wǎng)絡(luò)在5S rRNA的參與下很有可能會變的更復(fù)雜。

圖3 5S rRNA互作蛋白組復(fù)合體富集及其蛋白與蛋白互作網(wǎng)絡(luò)Fig.3 Protein complex enrichment and PPI network of 5S rRNA interactome

2.4 GO和KEGG通路富集顯示5S rRNA參與mRNA剪接調(diào)控

將5S rRNA互作蛋白組在ConsensusPathDB數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行GO分析，設(shè)定p<0.01,并用R軟件作圖(圖4)。GO的BP分析結(jié)果顯示：5S rRNA互作蛋白組顯著富集于核糖體蛋白復(fù)合體起源、翻譯啟動(圖4)，此外還富集多種復(fù)合物代謝調(diào)控過程和染色質(zhì)調(diào)控過程。GO細(xì)胞成分(CC)分析顯示5S rRNA與大量細(xì)胞核蛋白(nuclear part)有互作。這些蛋白可能跟5S rRNA的加工成熟相關(guān)，但也有可能意味著5S rRNA不僅在細(xì)胞質(zhì)中參與蛋白質(zhì)的翻譯調(diào)控，還可能進(jìn)入細(xì)胞核中參與各種基因表達(dá)或者加工的調(diào)控?？梢灶A(yù)計5S rRNA互作蛋白組中應(yīng)該主要為核酸結(jié)合蛋白，這點得到了GO分子功能(MF)分析結(jié)果的支持。MF分析顯示5S rRNA互作蛋白組主要富集了核酸結(jié)合蛋白，這說明我們的數(shù)據(jù)可信度較高。MF分析也顯示5S rRNA也結(jié)合了其它功能的蛋白，這些功能蛋白有可能是非典型的RNA結(jié)合蛋白(圖4)。對5S rRNA互作蛋白組進(jìn)行KEGG通路富集分析(表3)，并根據(jù)p值排序(p值越小，富集該通路的可信度越高)，5S rRNA相互作用蛋白組富集到的通路可信度最高的是核糖體通路，與蛋白復(fù)合體富集分析結(jié)果一致。值得注意的是mRNA剪接通路富集可信度排名第二，僅次于核糖體通路。5S rRNA與包括各類SRSF系列蛋白在內(nèi)的14個mRNA剪接相關(guān)蛋白有互作，表明mRNA剪接調(diào)控功能可能是5S rRNA翻譯調(diào)控功能之外的又一重要功能。除了核糖體通路和mRNA剪接通路外，5S rRNA相互作用蛋白組還富集了單純皰疹病毒感染和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工通路。隨著p值的增大，5S rRNA互作蛋白組富集到單純皰疹病毒感染和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白加工通路可信度變低，富集到這兩個通路中的蛋白也隨之變少。

綜上所述，結(jié)合蛋白復(fù)合體富集分析、PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、GO分析、KEGG通路富集分析，我們得出5S rRNA參與mRNA剪接調(diào)控的結(jié)論。

圖4 5S rRNA互作蛋白組的GO分析Fig.4 Genetic ontology analysis of 5S rRNA interactome

p1)q2)TermGenes1.04E-244.46E-23hsa03010:Ribosome-Homo sapiens (human)RPS13; RPL37A; RPL8; RPS14; RPL6; RPL7; RPL4; RPS18; RPS15A; RPS3; RPS8; RPL7A; RPL29; RPL23A; RPL24; RPL5; RPL14; RPL17; RPL11; RPL13; RPS4X; RPL18; RPL19; RPL26L1; RPS3A; RPL10L3.13E-143.37E-13hsa03040:Spliceosome-Homo sapiens (human)SRSF5; SRSF4; SRSF7; SRSF6; SRSF1; HNRNPA3; HNRNPA1; HNRNPU; SRSF8; RBMXL1; DDX5; RB-MXL3; HNRNPK; HNRNPM; RBMX; HNRNPC; TRA2B0.003 075 650.022 042hsa05168:Herpes simplex in-fection-Homo sapiens (hu-man)SRSF5; SRSF4; SRSF7; SRSF6; SRSF1; SRSF8; HNRN-PK0.007 294 180.039 206hsa04141:Protein processing in endoplasmic reticulum-Ho-mo sapiens (human)SYVN1; CRYAB; CRYAA; HSP90AB1; HSP90AA1; RRNP1

1)，2)E-n: ×10-n

3 討 論

RNA互作蛋白組研究是RNA研究的前沿領(lǐng)域之一，迅速確定RNA內(nèi)源互作蛋白組圖譜可以幫助我們?nèi)胬斫釸NA的功能和調(diào)控機(jī)制。采用傳統(tǒng)體外的標(biāo)記RNA Pull-Down方法對RNA互作蛋白進(jìn)行研究具有通量低、實驗繁瑣耗時和效率低等缺點，并且一次只能鑒定一到幾種RNA結(jié)合蛋白。利用傳統(tǒng)的RNA結(jié)合蛋白鑒定方法是很難對RNA的結(jié)合蛋白譜有全面的了解。例如，從mRNA發(fā)現(xiàn)后的幾十年間，人們總共才鑒定出了500多種mRNA結(jié)合蛋白。而在2012年，Castello等[26]利用和我們使用的類似策略系統(tǒng)分離了mRBP，并利用HPLC-MS做鑒定，將mRNA結(jié)合蛋白成員迅速增加到了接近900種，極大地提高了RNA結(jié)合蛋白的鑒定效率。再比如調(diào)控X染色體失活的lncRNA Xist，通過ChIRP-MS技術(shù)將其互作蛋白從不到10種一下增加到了81種[7]，使得Xist的功能和調(diào)控機(jī)制得以重新認(rèn)識。

在本研究中，利用ChIRP-MS這種RNA互作蛋白組高通量鑒定技術(shù)系統(tǒng)地鑒定了5S rRNA的互作蛋白組圖譜。共鑒定出162個5S rRNA互作蛋白，極大地拓展了對5S rRNA互作蛋白的認(rèn)識。結(jié)果顯示ChIRP-MS不僅鑒定到了大量已知的5S rRNA互作蛋白(表2，圖2,3)，還鑒定出了大量新的5S rRNA互作蛋白。這些新的5S rRNA互作蛋白來自各種細(xì)胞功能蛋白復(fù)合體，包括mRNA剪接復(fù)合體、TNF-α信號通路調(diào)控復(fù)合體、microRNA加工成熟相關(guān)的DGCR8復(fù)合體等等(圖3A)。5S rRNA的這些相互作用蛋白暗示5S rRNA可能參與了mRNA剪接調(diào)控、TNF-α信號通路調(diào)控和microRNA加工成熟調(diào)控等正常生理調(diào)控過程。此外還發(fā)現(xiàn)5S rRNA可能參與了一些病理過程的調(diào)控，比如病毒感染(表3)。這些發(fā)現(xiàn)極大地擴(kuò)展了5S rRNA的可能功能范圍，為未來5S rRNA的具體功能和調(diào)控機(jī)制研究指明了新的方向。

基于蛋白復(fù)合體富集分析、PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建、GO分析、KEGG通路富集分析，我們發(fā)現(xiàn)5S rRNA與mRNA剪接復(fù)合體有明顯的互作，暗示它可能參與了mRNA剪接調(diào)控。在5S rRNA互作蛋白組中大量存在SR蛋白家族、HNRNP蛋白家族和DDX5等跟mRNA剪接密切相關(guān)的蛋白[27-29]，結(jié)果暗示這些蛋白可能需要通過與5S rRNA的互作來發(fā)揮正常的功能。此外，SR蛋白家族、HNRNP蛋白家族除了與mRNA剪接相關(guān)外，還參與調(diào)控RNA穩(wěn)定性、翻譯和蛋白降解等等[27]，這也暗示了5S rRNA可能也具有同樣的功能。綜上所述，我們的5S rRNA互作蛋白組研究表明5S rRNA的功能可能遠(yuǎn)不局限于蛋白質(zhì)翻譯調(diào)控，可能還參與了mRNA剪接、信號通路調(diào)控等過程。研究也說明互作蛋白組研究是ncRNA功能和調(diào)控機(jī)制研究的有力工具，能幫助揭示ncRNA在生命活動過程中所扮演角色的全貌?；诒疚牡膬?nèi)容，我們計劃更深層次研究5S rRNA如何參與mRNA剪接調(diào)控，并將在相關(guān)已知發(fā)生mRNA剪接生物學(xué)表型的病理細(xì)胞或組織樣品進(jìn)行一系列工作。這樣會使我們的工作更有臨床價值和生物學(xué)意義。接下來的工作可以包括：對可信度較高的蛋白進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)RNA免疫沉淀(RNA immunoprecipitation，RIP)與免疫共沉淀(protein complex immunoprecipitation，Co-IP)實驗以證明該組合的有效性，截斷實驗確定5S rRNA與其互作蛋白的結(jié)合位點，RNA干擾(RNA interference，RNAi)實驗研究5S rRNA調(diào)控其互作蛋白發(fā)揮功能的模式。