摘 要： 旨在通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白組聯(lián)合分析來挖掘五龍鵝產(chǎn)蛋量相關(guān)候選基因，為其產(chǎn)蛋性能遺傳機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)。本研究選取200只體重相近的36周齡健康五龍鵝種鵝，記錄其36～54周齡產(chǎn)蛋情況。在產(chǎn)蛋后期（54周齡）時(shí)，根據(jù)產(chǎn)蛋水平，將產(chǎn)蛋量最高的30只鵝定為高產(chǎn)組，產(chǎn)蛋量最低的30只鵝定為低產(chǎn)組，從高產(chǎn)組（H）和低產(chǎn)組（L）鵝中各采集3個(gè)卵巢組織，提取RNA和蛋白質(zhì)，通過轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-Seq）和4D-DIA蛋白組定量分析篩選差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）和差異表達(dá)蛋白（differentially expressed proteins，DEPs）。之后對(duì)篩選的差異基因和蛋白進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證、功能富集分析和蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析，篩選鵝產(chǎn)蛋性能相關(guān)的候選基因。結(jié)果：共鑒定到450個(gè)DEGs和333個(gè)DEPs，其中，AFAP1、INHA、FNDC1、INHBB在基因和蛋白水平上表達(dá)出相同的差異趨勢。富集分析顯示，DEGs和DEPs顯著富集到364個(gè)GO條目和75個(gè)KEGG通路，涉及生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育（gland development）、性別分化（sex differentiation）、性激素活性（hormone activity）、TGF-β通路（TGF-β signaling pathway）、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂（oocyte meiosis）、GnRH信號(hào)通路（GnRH signaling pathway）、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟（progesterone-mediated oocyte maturation）等多個(gè)與產(chǎn)蛋相關(guān)的通路和關(guān)鍵生物過程。選取9個(gè)潛在候選基因，對(duì)高產(chǎn)組和低產(chǎn)組（包含轉(zhuǎn)錄組測序樣品）各8個(gè)卵巢組織進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，表達(dá)趨勢與測序結(jié)果一致?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，本研究最終篩選到6個(gè)與五龍鵝產(chǎn)蛋性能密切相關(guān)的候選基因（PTTG1、LRP2、TNFSF10、INHA、INHBB、FST），豐富了五龍鵝產(chǎn)蛋性能的相關(guān)分子機(jī)制。

關(guān)鍵詞： 五龍鵝；轉(zhuǎn)錄組；蛋白組；產(chǎn)蛋量；候選基因

中圖分類號(hào)：S835.3""""" 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A""""" 文章編號(hào)： 0366-6964（2025）01-0232-14

收稿日期：2024-07-22

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2023YFD1300300）；國家水禽產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-43-11）；山東省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2021CXGC010805）；農(nóng)業(yè)農(nóng)村部政府購買服務(wù)：鵝高繁性狀精準(zhǔn)評(píng)價(jià)和分子鑒定（19230551）

作者簡介：魯 秀（1997-），女，山東新泰人，碩士生，主要從事動(dòng)物遺傳與育種研究，E-mail： luxiu911@163.com

*通信作者：凡文磊，主要從事動(dòng)物遺傳與育種方向的研究，E-mail： fanwenlei@qau.edu.cn；王寶維，主要從事動(dòng)物營養(yǎng)與保健方向的研究，E-mail： wangbw1959@qq.com

Screening for Candidate Genes Related to Egg Production in Wulong Geese Based on Transcriptome

and Proteome Analyses

LU" Xiu ZHANG" Ming’ai 2022年商品鵝出欄量達(dá)到4.68億只，肉鵝產(chǎn)值高達(dá)526.73億元^［1］。然而，在鵝產(chǎn)業(yè)快速發(fā)展的同時(shí)，正在面臨著繁殖性能差的卡脖子問題^［2］。因此，深入挖掘影響鵝產(chǎn)蛋量的關(guān)鍵基因，對(duì)鵝產(chǎn)蛋性狀分子標(biāo)記輔助育種與鵝產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

家禽產(chǎn)蛋量受卵巢和卵泡發(fā)育水平的影響，而生長因子、激素以及卵泡閉鎖等多個(gè)因素均能通過調(diào)控卵泡發(fā)育水平影響家禽的繁殖性能。利用基因組學(xué)技術(shù)對(duì)揚(yáng)州鵝、四川白鵝的基因進(jìn)行測序，發(fā)現(xiàn)了大量與產(chǎn)蛋相關(guān)的SNPs位點(diǎn)，以及GnRH和GnIH等基因^［3］，證實(shí)這些基因在性腺軸中起關(guān)鍵作用，揭示了與產(chǎn)蛋量之間的關(guān)聯(lián)性。通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)對(duì)山麻鴨^［4］、浙東白鵝^［5］等產(chǎn)蛋性狀進(jìn)行研究，篩選出了INHA、GDF9、FST^［6］、BMP、EGR^［7］等基因，這些基因在卵泡發(fā)育和閉鎖過程中發(fā)揮重要作用，對(duì)于維持繁殖功能的穩(wěn)定具有重要意義。黃宣等^［8］采用蛋白組學(xué)技術(shù)對(duì)高低產(chǎn)雞卵巢進(jìn)行深度分析后發(fā)現(xiàn)，CYP11A1、HSD3B1等蛋白可能與類固醇激素合成過程有關(guān)，對(duì)卵泡的發(fā)育和排卵過程具有重要作用。盡管，目前對(duì)家禽產(chǎn)蛋調(diào)控機(jī)制已經(jīng)有了一定程度的了解，但仍存在很多問題有待闡明，如具體影響產(chǎn)蛋量的基因和通路，高產(chǎn)和低產(chǎn)鵝在卵巢表達(dá)上有何差異等。

豁眼鵝（五龍鵝）是我國產(chǎn)蛋性能最優(yōu)秀的地方鵝品種之一，年產(chǎn)蛋量可達(dá)100枚左右。但是在生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)，同一群體中的不同個(gè)體，在產(chǎn)蛋水平上存在較大差異，群體內(nèi)變異較大^［9］。因此，本研究通過在同一五龍鵝群體中篩選高產(chǎn)和低產(chǎn)個(gè)體，對(duì)其卵巢組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白組聯(lián)合分析，旨在篩選影響五龍鵝產(chǎn)蛋量的關(guān)鍵候選基因，為后續(xù)利用分子標(biāo)記輔助育種培育鵝高繁配套系奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及樣本采集

選擇200只36周齡體重相近、健康的五龍鵝母鵝為研究對(duì)象，試驗(yàn)群體飼養(yǎng)于青島農(nóng)業(yè)大學(xué)優(yōu)質(zhì)水禽研究所育種基地，飼養(yǎng)模式為單籠飼養(yǎng)。在36～54周齡期間記錄全部產(chǎn)蛋量，根據(jù)產(chǎn)蛋水平分為高產(chǎn)組和低產(chǎn)組，其中產(chǎn)蛋量最高的30只鵝定為高產(chǎn)組，產(chǎn)蛋量最低的30只鵝定為低產(chǎn)組。在產(chǎn)蛋后期（54周齡）屠宰，屠宰前12 h內(nèi)禁食、自由飲水。屠宰后，采集卵巢組織（去除等級(jí)卵泡），用RNase-free水沖洗干凈，吸干表面水分，迅速放入液氮速凍，置于-80 ℃保存?zhèn)溆?。每組隨機(jī)選取3個(gè)卵巢組織，即3個(gè)高產(chǎn)組（H）樣品和3個(gè)低產(chǎn)組（L）樣品，送至武漢邁特維爾生物科技有限公司，將卵巢樣勻漿后取部分樣品進(jìn)行RNA和蛋白質(zhì)提取，用于后續(xù)轉(zhuǎn)錄組測序與蛋白質(zhì)測序。

1.2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)處理

采用Trizol法提取總RNA，利用Qsep400生物分析儀精確檢測RNA完整性，質(zhì)檢合格后，用帶有Oligo（dT）的磁珠富集mRNA，隨后用fragmentation buffer將RNA打斷成短片段，以此為模板，用六堿基隨機(jī)引物和逆轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，并以第一鏈cDNA為模板進(jìn)行第二鏈cDNA的合成。最后用PCR法富集cDNA，構(gòu)建鵝卵巢cDNA文庫。構(gòu)建完成后，使用高通量核酸蛋白分析系統(tǒng)對(duì)文庫的insert size進(jìn)行檢測，完成文庫質(zhì)檢。采用Illumina平臺(tái)測序，使用fastp 0.23.2對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；利用Hisat2 2.2.1將樣本clean reads與鵝參考基因組進(jìn)行序列比對(duì)。建庫及測序過程均由武漢邁特維爾生物科技有限公司完成。

1.3 蛋白組測序數(shù)據(jù)處理

取勻漿后的樣品，加入含有1 mmol·L^-1 PMSF（苯甲基磺酰氟）和2 mmol·L^-1 EDTA（乙二胺四乙酸）以及8 mol·L^-1尿素的混合裂解緩沖液中孵育5 min，充分裂解，離心取上清。通過BCA法測定總蛋白濃度后，根據(jù)濃度取等量蛋白溶液，用8 mol·L^-1尿素將體積補(bǔ)全至200 μL，經(jīng)10 mmol·L^-1 DTT（二硫蘇糖醇）還原、50 mmol·L^-1 IAM（碘乙酰胺）烷基化處理后，用預(yù)冷丙酮沉淀蛋白。離心后，將蛋白沉淀風(fēng)干并重懸于碳酸氫銨溶液和胰蛋白酶（Promega）中，37℃消化過夜。消化產(chǎn)物經(jīng)C 18柱料脫鹽，真空離心濃縮，并溶解于1 mL·L^-1甲酸中。此后，使用NanoElute高效液相色譜儀和timsTOF Pro2質(zhì)譜儀進(jìn)行分析；使用DIA-NN軟件以Library free方法搜庫，進(jìn)行質(zhì)譜解析，完成蛋白定量。

1.4 DEGs、DEPs篩選及功能富集分析

使用String Tie進(jìn)行新基因預(yù)測，使用Feature Counts計(jì)算基因在樣本中的表達(dá)量。使用DESeq2對(duì)基因表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理和差異分析，差異表達(dá)基因（differentially expressed genes，DEGs）篩選的標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05且log 2FC≥1.0。利用t檢驗(yàn)對(duì)兩組樣本間蛋白表達(dá)量進(jìn)行組間差異顯著性的檢驗(yàn)，差異表達(dá)蛋白（differentially expressed proteins，DEPs）篩選的標(biāo)準(zhǔn)為P＜0.05且FC≥1.2或FC≤0.83。合并DEGs和DEPs，并通過在線網(wǎng)站DAVID進(jìn)行GO功能富集和KEGG信號(hào)通路分析。

1.5 熒光定量PCR驗(yàn)證

在篩選出的與產(chǎn)蛋相關(guān)候選基因中隨機(jī)選擇出9個(gè)DEGs（LRP2、TNFSF10、A2M、SNRPA1、PTTG1、BMP5、FST、PRLHR、INHBB），以GAPDH作為內(nèi)參基因，并且在高產(chǎn)組和低產(chǎn)組的卵巢組織中進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。利用NCBI Primer-BLAST （https：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/）在線工具設(shè)計(jì)引物，引物由青島蔚來生物科技有限公司合成。熒光定量PCR試劑盒采購自湖南艾科瑞生物工程有限公司，熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：上、下游引物（表1）各0.4 μL，cDNA模板2 μL，酶Mix 10 μL，ddH 2O 7.2 μL；反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。采用2^-ΔΔCt方法計(jì)算基因的相對(duì)mRNA表達(dá)量，并通過t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 DEGs、DEPs蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化

利用在線數(shù)據(jù)庫STRING對(duì)與產(chǎn)蛋相關(guān)的候選基因和候選蛋白進(jìn)行檢索，并結(jié)合Cytoscape軟件構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，利用Cyto Hubba插件統(tǒng)計(jì)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)（degree）和節(jié)點(diǎn)的中介中心性（between centrality），探究互作網(wǎng)絡(luò)的結(jié)構(gòu)特征，并進(jìn)行可視化與分析，進(jìn)一步篩選產(chǎn)蛋相關(guān)的關(guān)鍵候選基因。

2 結(jié) 果

2.1 高、低產(chǎn)鵝產(chǎn)蛋情況

在36～54周齡的產(chǎn)蛋周期內(nèi)，將200只鵝根據(jù)產(chǎn)蛋量進(jìn)行排序，排名前30的鵝劃分為高產(chǎn)組，排名后30的鵝劃分為低產(chǎn)組，其中高產(chǎn)組平均產(chǎn)蛋量為73個(gè)，低產(chǎn)組平均產(chǎn)蛋量為22個(gè)（表2）。

2.2 DEGs和DEPs篩選

經(jīng)過對(duì)原始轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)控，平均每個(gè)樣品獲得4.37×107條clean reads，平均注釋效率為90.94%，最終獲得23 324個(gè)基因的mRNA表達(dá)量。利用DESeq2包進(jìn)行基因表達(dá)量差異分析，成功鑒定出450個(gè)DEGs，其中有146個(gè)基因高產(chǎn)組表達(dá)量顯著高于低產(chǎn)組，304個(gè)基因高產(chǎn)組表達(dá)量顯著低于低產(chǎn)組（圖1A）。

樣本蛋白的質(zhì)譜分析結(jié)果經(jīng)過定量后獲得8 266個(gè)基因的蛋白表達(dá)量數(shù)據(jù)。對(duì)兩組樣本的蛋白表達(dá)量進(jìn)行t檢驗(yàn)，共篩選到333個(gè)DEPs，其中156個(gè)蛋白的表達(dá)量高產(chǎn)組顯著高于低產(chǎn)組，177個(gè)蛋白的表達(dá)量高產(chǎn)組顯著低于低產(chǎn)組（圖1B）。

此外，在DEGs和DEPs聯(lián)合分析中，特別關(guān)注到同時(shí)在基因和蛋白層面均表現(xiàn)出差異表達(dá)的交集基因（圖1C），經(jīng)過仔細(xì)比對(duì)，共得到8個(gè)基因AFAP1、MSC、CFAP206、MRPL51、INHA、FNDC1、INHBB和CNGB1（表3）。值得注意的是，其中AFAP1、INHA、FNDC1、INHBB這4個(gè)基因的mRNA和蛋白表達(dá)趨勢完全一致，為后續(xù)的研究提供了重要線索。

2.3 DEGs、DEPs的功能富集分析

對(duì)DEGs進(jìn)行KEGG富集分析，共富集到108條通路，發(fā)現(xiàn)DEGs主要富集于代謝途徑（metabolic pathways）、神經(jīng)活性配體-受體相互作用（neuroactive ligand-receptor interaction）、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、TGF-β信號(hào)通路（TGF-β signaling pathway）等通路，其中與卵泡發(fā)育相關(guān)的通路有TGF-β信號(hào)通路（TGF-β signaling pathway）、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂（oocyte meiosis）、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟（progesterone-mediated oocyte maturation）、GnRH信號(hào)通路（GnRH signaling pathway）等。根據(jù)顯著性通路進(jìn)一步篩選到INHBB、BMP5、PTTG1等與調(diào)控產(chǎn)蛋性狀相關(guān)的DEGs（圖2A）。其中，TGF-β信號(hào)通路的分支，激活素通路可能是調(diào)控產(chǎn)蛋的關(guān)鍵通路。在激活素信號(hào)通路中，F(xiàn)ST通過作用于抑制素（INHA、INHBB）阻礙激活素與受體相結(jié)合，使SMAD2/3磷酸化增強(qiáng)，從而促進(jìn)性腺生長以及胚胎分化（圖3）。對(duì)DEPs進(jìn)行KEGG富集分析，共富集到101個(gè)相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，排名前50的信號(hào)通路（圖2B）顯示，DEPs主要富集于肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架（regulation of actin cytoskeleton）、MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、胰島素信號(hào)通路（insulin signaling pathway）、TGF-β信號(hào)等通路（TGF-β signaling pathway）等。

將DEGs和DEPs進(jìn)行共同富集，分析結(jié)果顯示，共有364個(gè)顯著的GO條目（209個(gè)生物學(xué)過程，61個(gè)細(xì)胞組分，94個(gè)分子功能）和75個(gè)顯著的KEGG通路（圖4）。其中，GO條目主要涉及生殖結(jié)構(gòu)發(fā)育（gland development）、性別分化（sex differentiation）、性激素活性（hormone activity）等，KEGG通路主要富集到TGF-β信號(hào)通路（TGF-β signaling pathway）、卵母細(xì)胞減數(shù)分裂（oocyte meiosis）、GnRH信號(hào)通路（GnRH signaling pathway）、孕激素介導(dǎo)的卵母細(xì)胞成熟（progesterone-mediated oocyte maturation）等，它們與產(chǎn)蛋性能高度相關(guān)，這些相關(guān)條目和通路主要涉及INHBB、FST、BMP5、PITX2、PTTG1、PRKCA、INHA、INSR、PPP3CB、PPP2R5D、EGR1、AKT3和MSC等基因。

2.4 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

基于GO和KEGG的分析結(jié)果，將篩出的產(chǎn)蛋性能相關(guān)的候選基因和交集基因，利用在線數(shù)據(jù)庫STRING構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（圖5），結(jié)果共匹配到38個(gè)編碼蛋白，富集到36個(gè)節(jié)點(diǎn)。經(jīng)過對(duì)網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)數(shù)和節(jié)點(diǎn)中心性的評(píng)估與分析，發(fā)現(xiàn)AKT3位于網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)中心，周圍與INSR、INHBB、INHA等多個(gè)蛋白節(jié)點(diǎn)連接，從而揭示其在產(chǎn)蛋過程的核心樞紐地位。綜合以上分析，最終確定了AKT3、INSR、INHBB、FST、BMP5、INHA、PPP2R5D、PTTG1、LRP2、TNFSF10、EGR1這11個(gè)基因?yàn)楫a(chǎn)蛋性能相關(guān)的核心基因，極有可能與產(chǎn)蛋量之間存在顯著且重要的關(guān)聯(lián)。

2.5 熒光定量PCR驗(yàn)證

在產(chǎn)蛋相關(guān)的潛在候選基因中，由于轉(zhuǎn)錄組測序中，AFAP1、INHA、FNDC1基因的FPKM值和原始reads數(shù)值較低，可能對(duì)驗(yàn)證結(jié)果的精確性構(gòu)成不利影響，因此，在GO注釋和KEGG分析結(jié)果等的綜合考慮下，決定選擇9個(gè)DEGs對(duì)高產(chǎn)組和低產(chǎn)組的卵巢組織樣本（每組8個(gè)，且包含轉(zhuǎn)錄組測序的樣品）進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證，以L組為對(duì)照做均一化處理，結(jié)果表明，9個(gè)基因的表達(dá)量變化趨勢與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果相同，并且表達(dá)水平在高低產(chǎn)五龍鵝卵巢組織中均呈現(xiàn)顯著差異，其中PTTG1、PRLHR、TNFSF10、INHBB基因表現(xiàn)出極顯著差異（P＜0.01）（圖6）。

3 討 論

家禽產(chǎn)蛋量與卵泡發(fā)育密切相關(guān)，卵泡發(fā)育包括原始卵泡、生長卵泡、成熟卵泡三個(gè)階段的發(fā)育，其中涉及生長因子、激素、血管生成和肌肉組織等相關(guān)基因的交互作用。為解析影響產(chǎn)蛋量的分子機(jī)制，本研究利用高、低產(chǎn)蛋水平的五龍鵝進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和蛋白組聯(lián)合分析，篩選與產(chǎn)蛋量相關(guān)的候選基因，為后續(xù)利用分子標(biāo)記輔助育種培育鵝高繁配套系奠定基礎(chǔ)。

在本研究中，通過對(duì)五龍鵝高產(chǎn)組和低產(chǎn)組轉(zhuǎn)錄組和蛋白組差異比較，發(fā)現(xiàn)DEGs主要富集在細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、鈣離子信號(hào)通路（calcium signaling pathway）、MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、TGF-β信號(hào)（TGF-β signaling pathway）、黏著斑（focal adhesion）等通路。有研究發(fā)現(xiàn)，王瑩等^［10-11］在雞卵巢顆粒細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組調(diào)控研究中，也顯著富集到GnRH信號(hào)通路（GnRH signaling pathway）、鈣離子信號(hào)通路（calcium signaling pathway）、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）、TGF-β信號(hào)通路（TGF-β signaling pathway）、MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、VEGF信號(hào)通路（VEGF signaling pathway）等通路。兩者在通路富集結(jié)果種類中有相同之處，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了這些通路的在卵巢發(fā)育中的重要性。其中，細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用（cytokine-cytokine receptor interaction）通路可能在促進(jìn)雞卵泡顆粒細(xì)胞增殖起關(guān)鍵作用，而且參與輸卵管的收縮和蛋殼的形成，影響蛋的排出和蛋殼的質(zhì)量^［12-13］。劉建高^［14］通過蛋白組學(xué)技術(shù)在蛋鴨卵泡發(fā)育調(diào)控研究中發(fā)現(xiàn)，鈣離子信號(hào)通路（calcium signaling pathway）可能通過影響卵泡顆粒細(xì)胞的凋亡和能量代謝來調(diào)控卵泡的發(fā)育和排卵；并且通過影響輸卵管上皮細(xì)胞的鈣吸收和分泌功能來確保蛋殼的正常形成。MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）的激活可以促進(jìn)顆粒細(xì)胞分泌FSH（促卵泡激素）和LH（促黃體生成素）受體等多種生長因子和激素，促進(jìn)卵泡的生長發(fā)育；并且通過調(diào)控卵泡壁細(xì)胞的收縮和卵泡液的分泌，確保卵泡正常破裂釋放卵母細(xì)胞，完成排卵^［15］。綜上研究表明，這些通路在卵泡發(fā)育、蛋殼形成以及排卵等過程中具有重要作用。

卵泡發(fā)育是一個(gè)復(fù)雜的過程，在這個(gè)過程中細(xì)胞凋亡起著重要的調(diào)控作用，卵泡中的顆粒細(xì)胞和卵母細(xì)胞之間的相互作用以及卵泡微環(huán)境的變化均會(huì)影響卵泡的發(fā)育和成熟^［16-17］。TNFSF10作為一種促凋亡因子，屬于腫瘤壞死因子（TNF）配體家族的成員，通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來清除異?；蚴軗p細(xì)胞，減少炎癥因子的來源，從而間接調(diào)控炎癥反應(yīng)^［18］。已有研究發(fā)現(xiàn)，炎癥因子如腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）^［19］、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）等通過影響HPO軸（下丘腦-垂體-卵巢軸）的神經(jīng)內(nèi)分泌活動(dòng)來調(diào)控卵泡的發(fā)育和排卵。本研究發(fā)現(xiàn)，TNFSF10在五龍鵝卵巢的表達(dá)量高產(chǎn)組顯著低于低產(chǎn)組，提示該基因可能在五龍鵝卵泡顆粒細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，進(jìn)而對(duì)卵泡的發(fā)育產(chǎn)生影響。因此推測，低產(chǎn)組鵝體內(nèi)可能存在炎癥反應(yīng)，進(jìn)而影響其卵泡發(fā)育質(zhì)量，導(dǎo)致產(chǎn)蛋量降低。

卵母細(xì)胞減數(shù)分裂是卵母細(xì)胞發(fā)育成熟的最后一個(gè)階段，是受精、胚胎著床前不可或缺的先決條件，PTTG1、PPP2R5D、PPP3CB這3個(gè)基因均在此過程中發(fā)揮重要作用。PTTG1在豬胚胎發(fā)生過程中參與卵母細(xì)胞成熟和合子基因組激活的過程^［20］，并且在馬和驢等動(dòng)物的GV期和MⅡ期的卵母細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)PTTG1都有高豐度表達(dá)^［21］。與之相似，本研究也發(fā)現(xiàn)了PTTG1在高產(chǎn)組鵝卵巢中高豐度表達(dá)。由此推測，該基因可能通過促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟發(fā)育，進(jìn)而影響五龍鵝的產(chǎn)蛋水平。此外，PPP2R5D、PPP3CB這兩個(gè)基因是磷蛋白磷酸酶（PPP）家族重要成員。有研究證實(shí)，PPP3CB參與調(diào)控豬青春期卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程^［22］，而且，當(dāng)PPP2R5D亞基中的絲氨酸-丙氨酸發(fā)生突變時(shí)，會(huì)抑制小鼠卵泡的正常去磷酸化^［23］，從而影響正常的卵母細(xì)胞減數(shù)分裂過程，提示該基因可能通過干預(yù)卵泡生長發(fā)育影響五龍鵝產(chǎn)蛋水平。

產(chǎn)蛋量與蛋重之間存在一定的關(guān)系，但這種關(guān)系受多種因素的影響。多項(xiàng)研究證實(shí)，蛋重與產(chǎn)蛋量之間存在較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)^［24］。Yi等^［25］也在蛋清形成的膨大部發(fā)現(xiàn)，LRP2是影響蛋重的重要基因。LRP2作為一種多功能內(nèi)吞受體^［26］，通過內(nèi)吞作用有效攝取與其載體蛋白相結(jié)合的重要維生素和激素，包括維生素D結(jié)合蛋白^［27］、視黃醇結(jié)合蛋白^［28］和性激素結(jié)合球蛋白^［29-30］等，這些物質(zhì)的攝取對(duì)卵巢的發(fā)育具有重要作用。當(dāng)維生素D攝取不足時(shí)，會(huì)影響抗繆勒管激素的分泌，這是一種由卵巢顆粒細(xì)胞分泌的激素，對(duì)卵巢的儲(chǔ)備功能和排卵過程有重要影響^［31-33］。此外，維生素D的缺乏還可能導(dǎo)致生殖系統(tǒng)微血管功能異常，影響子宮內(nèi)膜的營養(yǎng)供應(yīng)和修復(fù)過程，從而影響卵巢的正常功能^［34］。因此，LRP2作為母胎脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)途徑的胚胎脂蛋白受體，介導(dǎo)脂蛋白攝取到卵黃囊中，對(duì)卵泡的發(fā)育具有重要意義。在本研究中，低產(chǎn)組LRP2表達(dá)量顯著高于高產(chǎn)組，這種高表達(dá)促進(jìn)了營養(yǎng)物質(zhì)向卵泡的有效輸送，確保了卵泡發(fā)育過程中獲得充足的營養(yǎng)支持。因此，這種營養(yǎng)分配的差異可能是導(dǎo)致低產(chǎn)鵝的種蛋較重、產(chǎn)蛋量較低的重要因素之一。

通過蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析得知，INHBB、INHA、FST（卵泡抑素）這3個(gè)基因相互之間有著密切的關(guān)聯(lián)，有研究證實(shí)其在影響產(chǎn)蛋性狀中起重要作用。在雌性動(dòng)物卵巢發(fā)育過程中，抑制素、激活素和卵泡抑素都是重要的調(diào)節(jié)因子，這三者組成的抑制素-激活素-卵泡抑素系統(tǒng)在動(dòng)物的各個(gè)生殖階段都發(fā)揮著重要的調(diào)控作用^［35］。有研究證實(shí)，在激活素信號(hào)通路中，F(xiàn)ST作用于抑制素，從而阻止激活素與其受體的結(jié)合^［36］，導(dǎo)致SMAD2/3磷酸化增強(qiáng)，這進(jìn)一步促進(jìn)了性腺的生長和胚胎的分化（圖3）^［37-38］。本研究中，這3個(gè)基因在高產(chǎn)組的mRNA表達(dá)水平高于低產(chǎn)組，當(dāng)敲除INHBB時(shí)，會(huì)影響顆粒細(xì)胞的生長和凋亡^［39-40］，而過表達(dá)時(shí)，其會(huì)和FSH相互作用影響類固醇激素下調(diào)，導(dǎo)致卵泡發(fā)育受阻^［41］。當(dāng)然，在正常情況下，一定水平的INHBB會(huì)適當(dāng)?shù)囊种艶SH分泌。由此推斷，在產(chǎn)蛋過程中，這3個(gè)基因通過促進(jìn)性腺生長發(fā)育和調(diào)控生殖激素平衡，從而促進(jìn)產(chǎn)蛋量增加。

4 結(jié) 論

本研究通過轉(zhuǎn)錄組和蛋白組進(jìn)行聯(lián)合分析，最終篩選到6個(gè)與產(chǎn)蛋性能相關(guān)的候選基因（PTTG1、LRP2、TNFSF10、INHA、INHBB、FST），為五龍鵝產(chǎn)蛋性能的分子育種和產(chǎn)蛋性能調(diào)控機(jī)制的闡明提供參考。

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（編輯 郭云雁）