曹云剛， 陳星怡， 齊夢(mèng)恬， 李 穎， 趙倩倩

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院, 陜西 西安 710021)

0 引言

茶多酚(Tea Polyphenols)是茶葉中多酚類(lèi)物質(zhì)的總稱(chēng)，是目前應(yīng)用最廣泛的天然抗氧化劑之一，其主要活性成分是兒茶素類(lèi)化合物(Catechin)，約占茶多酚含量的75%～80%.兒茶素類(lèi)化合物主要分為四種：表兒茶酚(epicatechin EC)、表沒(méi)食子兒茶酚(epigallocatechin EGC)、表兒茶酚沒(méi)食子酸(epicatechin gallate ECG)和表沒(méi)食子兒茶酚沒(méi)食子酸(epigallocatechin gallate EGCG)[1-3].

其中EGCG是 2-連苯酚基苯并吡喃與沒(méi)食子酸形成的酯，結(jié)構(gòu)中含有6個(gè)鄰位酚羥基(如圖1所示)，是兒茶素中含量最高、抗氧化能力最強(qiáng)的組分.同時(shí)現(xiàn)有研究表明EGCG還具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗突變、降壓、降脂、降血糖、防止消化道和呼吸道感染、預(yù)防和治療癌癥、抑制和預(yù)防心血管疾病等生理活性功能[4,5].因此，EGCG和其他兒茶素類(lèi)化合物經(jīng)常被用做功能性食品(如乳品和飲料等)的添加劑.

然而，研究發(fā)現(xiàn)兒茶素類(lèi)物質(zhì)在中性和堿性條件下非常不穩(wěn)定，隨著pH、溫度和氧氣濃度的升高，降解速度逐漸加快[6].EGCG 的氧化物和聚合物會(huì)產(chǎn)生一種不期望的黃綠色，諸如此類(lèi)的不穩(wěn)定性限制了EGCG在食品工業(yè)中的應(yīng)用[7].如何提高EGCG在加熱等過(guò)程中的穩(wěn)定性是當(dāng)前面臨的挑戰(zhàn).

圖1 EGCG結(jié)構(gòu)示意圖

酪蛋白是牛乳中含量最高的蛋白質(zhì)，約占牛乳中總蛋白的80%左右，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和良好的加工性能.牛乳酪蛋白包含四種主要蛋白質(zhì)：αs1-酪蛋白,αs2-酪蛋白,β-酪蛋白和κ-酪蛋白，這四種蛋白的摩爾比約為4∶1∶4∶1.3，在酪蛋白中的含量分別為：αs1-酪蛋白≥22%、αs2-酪蛋白≥5.5%、β-酪蛋白≥22%、κ-酪蛋白≥7.15%[7-9].這四種酪蛋白分子量接近(均約為24 kDa)，并含有很大比例的脯氨酸殘基.其中β-酪蛋白由209個(gè)氨基酸組成且不含二硫鍵，其相對(duì)靈活(松散、自然展開(kāi))的結(jié)構(gòu)使得其對(duì)熱更加穩(wěn)定，且易于與其他物質(zhì)結(jié)合[9].現(xiàn)有研究已經(jīng)表明，β-酪蛋白可以與疏水性和雙親化合物如維生素D、槲皮素、白藜蘆醇、黃酮、姜黃素和丹寧酸等相互作用，從而作為它們的天然納米運(yùn)載工具[7].蛋白質(zhì)與多酚類(lèi)物質(zhì)相互作用受蛋白質(zhì)和多酚結(jié)構(gòu)、溫度、pH等因素的影響，二者結(jié)合又會(huì)影響各自的功能特性及生物利用率.

因此，本研究采用熒光猝滅法探究不同溫度下β-酪蛋白與EGCG的相互作用機(jī)制，以期為合理控制食品加工條件改善EGCG的穩(wěn)定性、科學(xué)設(shè)計(jì)天然活性組分的蛋白納米載體等提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

(1)主要材料與試劑：β-酪蛋白(≥98%)，Sigma-Aldrich公司；EGCG(>98%)，上海純優(yōu)生物科技有限公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氫氧化鈉、鹽酸，天津市天力化學(xué)試劑有限公司；純凈水，娃哈哈集團(tuán).

(2)主要儀器設(shè)備：PHS-25型數(shù)顯pH計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；微量移液器，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；DK-98-Ⅱ電熱恒溫水浴鍋,天津市泰斯特儀器有限公司； FS5熒光光譜儀,英國(guó)愛(ài)丁堡儀器公司；MIX-25P型迷你混合儀，杭州米歐儀器有限公司；TP-350S型智能磁力加熱攪拌器，杭州米歐儀器有限公司.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品溶液的配置

β-酪蛋白存儲(chǔ)液(10.0μmol/L)：用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH6.5)配制濃度為10.0μmol/Lβ-酪蛋白溶液，置于4 ℃冰箱中儲(chǔ)存?zhèn)溆?

EGCG工作液(100.0μmol/L)：用20 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS，pH6.5)配制濃度為100.0μmol/L EGCG溶液.用PBS溶液稀釋出一系列濃度梯度的EGCG溶液：0、1μmol/L、2μmol/L、4μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、60μmol/L、80μmol/L和100μmol/L.所有EGCG溶液現(xiàn)配現(xiàn)用.

1.2.2 熒光猝滅分析

將不同濃度EGCG 溶液(0、1、2、4、10、20、40、60、80和100μmol/L)與β-酪蛋白溶液(10.0μmol/L)按照1∶1比例混合均勻(各2.5 mL)，在不同溫度(25 ℃、35 ℃和45 ℃)水浴中加熱30 min后，迅速冷卻至室溫.最終混合液中，β-酪蛋白終濃度為：5.0μmol/L，EGCG終濃度梯度為：0、0.5μmol/L、1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、30μmol/L、40μmol/L和50μmol/L.同時(shí)將不同濃度EGCG 溶液(0、1、2、4、10、20、40、60、80和100μmol/L)與20 mmol/L磷酸鹽緩沖液按照1∶1比例混合均勻(各2.5 mL)作為空白對(duì)照.參考范志飛等人描述的方法[10]，在室溫下利用熒光光譜儀記錄混合液體和相應(yīng)空白對(duì)照的熒光強(qiáng)度，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)為 280 nm，掃描波長(zhǎng)為 300～500 nm，激發(fā)狹縫寬度為3.3 nm，發(fā)射狹縫寬度為2.0 nm.

2 結(jié)果與討論

2.1 不同加熱處理對(duì)β-酪蛋白內(nèi)源熒光的影響

β-酪蛋白含有一個(gè)位于蛋白表面的色氨酸殘基(Trp143)，Trp143受激發(fā)后發(fā)射的熒光是β-酪蛋白內(nèi)源熒光的主要來(lái)源[11].蛋白質(zhì)最大內(nèi)源熒光強(qiáng)度(Fmax)和對(duì)應(yīng)的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)(λmax)的變化可以間接反映蛋白構(gòu)象的變化[12].

如表1所示，無(wú)EGCG存在時(shí)，不同溫度處理對(duì)β-酪蛋白的Fmax和λmax具有不同的影響：與對(duì)照(25 ℃)相比，35 ℃處理幾乎無(wú)影響；45 ℃處理30 min導(dǎo)致β-酪蛋白的Fmax升高約3.0%，同時(shí)λmax紅移動(dòng)約2 nm；這說(shuō)明45 ℃處理30 min對(duì)β-酪蛋白中的Trp143殘基的微環(huán)境產(chǎn)生了較為明顯的影響，或者說(shuō)該條件下處理使得β-酪蛋白中的Trp143殘基的微環(huán)境變得更加親水性或極性[7].加熱溫度對(duì)β-酪蛋白內(nèi)源熒光的影響與其自身的結(jié)構(gòu)變化以及β-酪蛋白自我締合與解離行為有關(guān)：在低溫(0～8 ℃)下，β-酪蛋白以單體的形式存在于溶液中；當(dāng)溫度高于20 ℃時(shí)，β-酪蛋白單體發(fā)生聚合和自我締合；當(dāng)溫度高于90 ℃時(shí)，β-酪蛋白聚集體發(fā)生熱解離[13].

表1 不同溫度處理后β-酪蛋白的最大內(nèi)源熒光強(qiáng)度(Fmax)和對(duì)應(yīng)最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)(λmax)

2.2 β-酪蛋白-EGCG復(fù)合物的熒光猝滅

不同溫度(25 ℃、35 ℃和45 ℃)下，β-酪蛋白與EGCG相互作用的熒光淬滅光譜如圖2所示.從圖2可以看出，隨著 EGCG 濃度的增加，β-酪蛋白的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度逐漸降低，當(dāng)EGCG終濃度為 50μmol/L時(shí)，β-酪蛋白的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度最低，由此可以推斷EGCG 與β-酪蛋白生成了復(fù)合物，同時(shí)也改變了β-酪蛋白的空間結(jié)構(gòu)[14]：與EGCG的結(jié)合導(dǎo)致β-酪蛋白的分子構(gòu)象進(jìn)一步展開(kāi)，使得色氨酸殘基(Trp143)暴露于更加親水的環(huán)境中.不同溫度下，EGCG對(duì)β-酪蛋白的熒光猝滅程度不同，比如，當(dāng)EGCG終濃度為 50μmol/L時(shí)，熒光猝滅率分別為77.8%(25 ℃)、76.5%(35 ℃)和84.6%(45 ℃)，說(shuō)明溫度升高增強(qiáng)了EGCG與β-酪蛋白之間的相互作用.與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類(lèi)似，He等[7]研究發(fā)現(xiàn)隨著溫度的升高EGCG對(duì)β-酪蛋白的熒光猝滅作用增強(qiáng).

(a)25 ℃下EGCG對(duì)β-酪蛋白的熒光猝滅光譜

(b)35 ℃下EGCG對(duì)β-酪蛋白的熒光猝滅光譜

(c)45 ℃下EGCG對(duì)β-酪蛋白的熒光猝滅光譜圖2 EGCG對(duì)β-酪蛋白的熒光猝滅光譜

熒光猝滅反應(yīng)的類(lèi)型主要有：動(dòng)態(tài)猝滅與靜態(tài)猝滅[15].無(wú)論EGCG對(duì)β-酪蛋白的熒光猝滅是一個(gè)動(dòng)態(tài)猝滅或者靜態(tài)猝滅過(guò)程，均可根據(jù)Stern-Volmer 方程(1)計(jì)算其雙分子熒光猝滅速率常數(shù)(Kq)，據(jù)此可判定其猝滅類(lèi)型.

F0/F=1+Kqτ0c(EGCG)=1+

KSVc(EGCG)

(1)

式(1)中：F0和F分別為EGCG加入前后β-酪蛋白熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)(L/(mol·s))；τ0為不存在熒光猝滅劑時(shí)的熒光壽命(對(duì)于生物大分子來(lái)說(shuō)τ0=10-8s-1)[16]；c(EGCG)是熒光猝滅劑EGCG的濃度(mol/L).KSV是Sterne-Volmer 動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)(L/mol)，可以通過(guò)F0/F對(duì)c(EGCG)做線性回歸，其線性部分的斜率即為KSV.

根據(jù)方程式(1)，對(duì)于單一的動(dòng)態(tài)猝滅或靜態(tài)猝滅過(guò)程,以β-酪蛋白與EGCG作用前后熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度變化F0/F對(duì)熒光猝滅劑濃度c(EGCG)為軸制作散點(diǎn)圖并算出趨勢(shì)線方程，方程的斜率代表Sterne-Volmer 動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)KSV.

圖3為不同溫度(25 ℃、35 ℃和45 ℃)下β-酪蛋白與不同濃度EGCG相互作用的熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度F0/F-c(EGCG) 曲線.從圖3可以看出，F(xiàn)0/F-c(EGCG)呈線性關(guān)系，隨著溫度升高熒光猝滅曲線的斜率增加，并且可以計(jì)算出25 ℃、35 ℃ 和45 ℃ 下雙分子猝滅速率常數(shù)Kq分別為0.664×1013L/(mol·s)、0.629×1013L/(mol·s)和0.945×1013L/(mol·s).

一般情況下，生物大分子的雙分子熒光動(dòng)態(tài)猝滅速率常數(shù)Kq小于2×1010L/(mol·s)，由此可以判斷 EGCG對(duì)β-酪蛋白的熒光猝滅是由于 EGCG 與β-酪蛋白形成了復(fù)合物而引起的靜態(tài)猝滅，是通過(guò)熒光基團(tuán)(Trp143)與熒光猝滅劑(EGCG)之間形成了一個(gè)復(fù)雜的循環(huán)[17,18].不同溫度下EGCG對(duì)β-酪蛋白的雙分子猝滅速率常數(shù)Kq的變化與溫度誘導(dǎo)的β-酪蛋白構(gòu)象變化等有關(guān).

圖3 不同溫度下EGCG對(duì)β-酪蛋白熒光猝滅的Stern-Volmer曲線

2.3 EGCG與β-酪蛋白的表觀結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

由于EGCG對(duì)β-酪蛋白的熒光猝滅主要是靜態(tài)猝滅，其結(jié)合常數(shù)(KA)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)可通過(guò)公式(2)計(jì)算得出：

lg[(F0-F)/F]=lgKA+nlgc(EGCG)

(2)

式(2)中：F0和F分別為EGCG加入前后β-酪蛋白熒光發(fā)射峰的強(qiáng)度；KA為結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)；c(EGCG)為EGCG濃度(mol/L).

以lg[(F0-F)/F]對(duì)lgc(EGCG)作圖，本實(shí)驗(yàn)范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，因而擬合直線的斜率為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)，截距為結(jié)合常數(shù)(KA)，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2.

由計(jì)算結(jié)果可知，EGCG與β-酪蛋白的結(jié)合常數(shù)達(dá)104數(shù)量級(jí)，并形成一個(gè)結(jié)合位點(diǎn).在25 ℃溫度條件下二者之間就能較好的結(jié)合，溫度升高有利于二者之間的結(jié)合.朱美霖等[14]在研究EGCG與人血清白蛋白(HSA)相互作用時(shí)也得到了類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果.

表2 不同溫度下EGCG 與β-酪蛋白的結(jié)合常數(shù)(KA)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)(n)

2.4 EGCG 與 β-酪蛋白的主要作用力類(lèi)型

生物大分子與小分子的作用力類(lèi)型一般包括：氫鍵、范德華力、靜電引力和疏水作用力這四種[19].根據(jù)不同溫度下的熱力學(xué)參數(shù)：焓變?chǔ)、自由能變化ΔG和熵變?chǔ)等，可以判斷EGCG與β-酪蛋白的主要作用力類(lèi)型.

在溫度變化范圍不大時(shí)，ΔH 可看作是常數(shù)，由熱力學(xué)參數(shù)方程(3，4)可以計(jì)算出EGCG和β-酪蛋白在不同溫度下相互作用的熱力學(xué)參數(shù)值,結(jié)果見(jiàn)表3所示.

ln(K2/K1)=(1/t1-1/t2)ΔH/R

(3)

ΔG=ΔH-tΔS=-RtlnK

(4)

式(3)、(4)中：K1，K2分別為不同溫度下EGCG與β-酪蛋白的結(jié)合常數(shù)(KA)；t1，t2分別為不同溫度，單位為K；R為氣體常數(shù)，R=8.314J/(mol·K)；ΔH為焓變；ΔG為自由能變化；ΔS為熵變.

表3 不同溫度下EGCG與β-酪蛋白結(jié)合過(guò)程的熱力學(xué)參數(shù)

ΔG為吉布斯自由能，是在某一個(gè)熱力學(xué)過(guò)程中，系統(tǒng)減少的內(nèi)能中可以轉(zhuǎn)化為對(duì)外做功的部分.當(dāng)ΔG<0時(shí)反應(yīng)自發(fā)；ΔG>0時(shí)反應(yīng)逆方向自發(fā)；ΔG=0時(shí)反應(yīng)平衡[20].從表3可以看出,EGCG與β-酪蛋白的復(fù)合物在形成過(guò)程中的ΔG<0，說(shuō)明結(jié)合過(guò)程是一個(gè)自發(fā)過(guò)程.生物大分子與小分子作用力類(lèi)型的熱力學(xué)規(guī)律為：(1)ΔS>0的情況下作用力類(lèi)型可能是疏水作用力與靜電作用力；(2)ΔH>0同時(shí)ΔS>0的情況下作用力類(lèi)型為疏水作用力；(3)ΔH<0的情況下作用力類(lèi)型主要為靜電相互作用[19].根據(jù)此規(guī)律并結(jié)合上述結(jié)果分析可知，該體系中EGCG與β-酪蛋白之間的作用力是以疏水作用力為主.由于ΔH

3 結(jié)論

采用熒光猝滅法研究了不同溫度下β-酪蛋白與EGCG之間的相互作用，研究結(jié)果表明： EGCG與β-酪蛋白發(fā)生了靜態(tài)熒光猝滅，形成了β-酪蛋白-EGCG復(fù)合物；當(dāng)溫度為25 ℃、35 ℃和45 ℃時(shí)，其雙分子猝滅速率常數(shù)Kq分別為0.664×1013L/(mol·s)、0.629×1013L/(mol·s) 和0.945×1013L/(mol·s)，結(jié)合位點(diǎn)數(shù)分別為0.836 6、0.922 3與0.958 6.熱力學(xué)參數(shù)分析結(jié)果顯示EGCG 與β-酪蛋白形成復(fù)合物的過(guò)程中ΔG<0，說(shuō)明該結(jié)合過(guò)程是一個(gè)自發(fā)過(guò)程，ΔH>0且ΔS>0說(shuō)明EGCG與β-酪蛋白之間的作用力是以疏水相互作用為主.