孫玉姣， 崔湘怡， 高潤凝

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021)

0 引言

可得然膠(curdlan)，又稱凝結(jié)多糖，是一種天然的直鏈型微生物發(fā)酵多糖.可得然膠是由D-葡萄糖以β-(1→3)糖苷鍵連接而成的葡聚糖.這種大分子由300～500個(gè)葡萄糖殘基組成，其平均聚合度(degree of polymerization,DP)約為450，相對(duì)分子量(Mr)約為74 000 Da，分子式為(C6H10O5)n.可得然膠作為乳化劑、穩(wěn)定劑、持水劑和增稠劑等廣泛應(yīng)用于食品領(lǐng)域[1].

近年來，多糖的化學(xué)分子修飾，尤其是硫酸化修飾受到了食品化學(xué)、醫(yī)藥科學(xué)等領(lǐng)域工作者的廣泛關(guān)注.硫酸化修飾是通過化學(xué)方法在多糖分子結(jié)構(gòu)中引入硫酸基團(tuán)，從而使多糖糖鏈中單糖分子的羥基被硫酸基團(tuán)取代.相比于天然多糖，硫酸化修飾多糖具有更加廣泛和優(yōu)越的生物活性.許多研究證實(shí)，硫酸化多糖比未進(jìn)行硫酸化修飾的多糖具有更強(qiáng)的生物特性，具有明顯的抗菌、抗病毒、抗凝血、抗氧化及抗腫瘤等生物學(xué)活性[2-7].此外，多糖經(jīng)過硫酸化修飾后，生物活性增強(qiáng)，可以有效提高多糖的利用率，對(duì)其開發(fā)與應(yīng)用具有深遠(yuǎn)意義.

細(xì)胞在正常的代謝和生長過程中會(huì)產(chǎn)生一系列活性氧(ROS)，例如超氧陰離子(·O2-)，羥自由基(·OH)和過氧化氫(H2O2)等.它們能夠破壞脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和核酸等生物大分子，導(dǎo)致癌癥、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病和組織炎癥等許多疾病的發(fā)生[8,9].一些食物的變質(zhì)也與食品中的脂質(zhì)或者不飽和脂肪酸的氧化有關(guān).由ROS引起的脂質(zhì)氧化會(huì)引起脂類食品營養(yǎng)價(jià)值的降低，不僅造成食物外觀受損，還會(huì)增加食品安全的風(fēng)險(xiǎn).抗氧化性是天然多糖本身就具備的一大生物活性，主要依賴于多糖分子上存在的大量羥基.而經(jīng)過硫酸化修飾，多糖的抗氧化性會(huì)發(fā)生不同程度的增強(qiáng)，對(duì)進(jìn)一步開發(fā)和利用多糖資源提供了有效的手段[10,11].大量研究發(fā)現(xiàn)，硫酸基團(tuán)在抗氧化活性中起著重要作用.Wang等[12]通過對(duì)沙蒿多糖進(jìn)行硫酸化修飾，獲得了取代度范圍為0.51～1.28的硫酸化沙蒿多糖，體外抗氧化研究發(fā)現(xiàn)，硫酸化沙蒿多糖的抗氧化活性包括對(duì)DPPH、·O2-、和·OH自由基的清除能力以及還原能力都隨著硫酸化取代程度的增加而增加.Jin等[13]基于細(xì)胞水平的氧化損傷模型研究發(fā)現(xiàn)，硫酸化多糖可顯著提高H2O2損傷的小鼠巨噬細(xì)胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-px)含量，表現(xiàn)出對(duì)氧化損傷細(xì)胞較強(qiáng)的保護(hù)能力.然而，目前對(duì)可得然膠的硫酸化修飾及其抗氧化評(píng)估的研究卻鮮有報(bào)道.

因此，本研究采用非選擇性硫酸化修飾、伯羥基硫酸化修飾和非伯羥基硫酸化修飾方法，分別對(duì)可得然膠進(jìn)行硫酸化修飾，進(jìn)而研究硫酸化可得然膠對(duì)DPPH、羥自由基(·OH)、超氧陰離子(·O2-)自由基的清除能力以及硫酸化可得然膠的還原力，從而評(píng)估硫酸化可得然膠的抗氧化活性.本研究將為可得然膠的進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 主要材料

可得然膠，食品級(jí)，購于日本武田-麒麟食品公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)，購于美國sigma公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 硫酸化可得然膠的制備

(1)非選擇性硫酸化修飾

分別稱取0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g三乙胺-三氧化硫，加入25 mL二甲基甲酰胺和0.5 g可然得膠粉末，于50 ℃攪拌反應(yīng)12 h.反應(yīng)完成后，用5 mol/L NaOH中和反應(yīng)物，加入三倍體積95%乙醇，靜置過夜后離心，收集沉淀物，干燥，然后溶于少量蒸餾水，用截留分子量為300 Da的透析袋透析.

(2)伯羥基硫酸化修飾

①三苯甲基保護(hù)

將0.5 g可然得膠溶解于20 mL吡啶，一小時(shí)內(nèi)分三次加入0.5 g三苯基氯乙烷，反應(yīng)4 h.共做五份.

②乙酰化反應(yīng)

將每份反應(yīng)物中加入20 mL乙酸酐，在95 ℃下反應(yīng)3 h，反應(yīng)后將混合物倒入冰水中，其間不斷攪拌，然后加水離心兩次.

③脫去三苯甲基保護(hù)層

將反應(yīng)物溶于20 mL二氯甲烷，充分溶解后蒸干，重復(fù)進(jìn)行一次.將蒸干后的反應(yīng)物溶于100 mL二氯甲烷中，加入10 mL乙酸、4 mL濃鹽酸，在0 ℃攪拌反應(yīng)3 h.反應(yīng)完成后，用飽和碳酸氫鈉將其中和，分液，得到二氯甲烷相.

④硫酸化修飾

將反應(yīng)物蒸干，再加入20 mL二氯甲烷重復(fù)蒸干一次.分別稱取0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g三乙胺-三氧化硫加入反應(yīng)物中，再各加入25 mL二甲基甲酰胺，在攪拌器中于50 ℃攪拌反應(yīng)12 h.反應(yīng)完成后，用5 mol/L NaOH中和反應(yīng)物，加入三倍體積95%乙醇，靜置過夜后離心，收集沉淀物，干燥.

⑤脫乙?；?/p>

將產(chǎn)物溶于20 mL甲醇蒸干，再加入20 mL甲醇重復(fù)蒸干一次.將蒸干后的產(chǎn)物溶于100 mL甲醇中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下加入0.1 g甲醇鈉.在氮?dú)獗Ｗo(hù)下于50 ℃攪拌反應(yīng)2 h.反應(yīng)結(jié)束后，將產(chǎn)物蒸干，溶于少量蒸餾水，用截留分子量為300 Da的透析袋透析.

(3)非伯羥基硫酸化修飾

①三苯甲基保護(hù)

將0.5 g可然得膠溶解于20 mL吡啶，一小時(shí)內(nèi)分三次加入0.5 g三苯基氯乙烷，反應(yīng)4 h.共做五份.

②硫酸化修飾

將每份反應(yīng)物蒸干，再加入20 mL甲醇重復(fù)蒸干一次.分別稱取0.1 g、0.2 g、0.3 g、0.4 g、0.5 g三乙胺-三氧化硫加入反應(yīng)物中，再各加入25 mL二甲基甲酰胺，在攪拌器中于50 ℃攪拌反應(yīng)12 h.反應(yīng)完成后，用5 mol/L NaOH中和反應(yīng)物，加入三倍體積95%乙醇，靜置過夜后離心，收集沉淀物，干燥.

③脫去三苯甲基保護(hù)層

將反應(yīng)物溶于20 mL二氯甲烷蒸干，再加入20 mL二氯甲烷重復(fù)蒸干一次.將反應(yīng)物溶于100 mL二氯甲烷中，加入10 mL乙酸、4 mL濃鹽酸，在0 ℃攪拌反應(yīng)3 h.反應(yīng)完成后，將產(chǎn)物蒸干，溶于少量蒸餾水，用截留分子量為300 Da的透析袋透析，然后用5 mol/L NaOH調(diào)pH.

1.2.2 硫酸基含量的測定

硫酸基含量的測定采用BaCl2-明膠法[14].以K2SO4為標(biāo)準(zhǔn)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.分別加入1 mL三氯乙酸，1 mL比濁液(0.5 g明膠和0.5 g BaCl2溶解在100 mL去離子水中，靜置過夜，離心除去不溶物，即為BaCl2-明膠比濁液).搖勻，室溫靜置 20 min，在360 nm處測定吸光度，記為A1.然后，以1 mL的明膠溶液代替該比濁液，測得的吸光值記為A2.繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，橫坐標(biāo)為硫酸基團(tuán)毫克數(shù)，縱坐標(biāo)為 A=A1-A2，得到線性回歸方程.

樣品的硫酸基含量測定：分別取5 mg的硫酸化產(chǎn)物溶解于1 mL的1 mol/mL HCl 溶液中，在100 ℃下消化6 h.冷卻離心后，吸取各樣品溶液 0.1 mL，按以上操作方法測定其吸光度值.根據(jù)回歸方程計(jì)算出各個(gè)樣品中的硫酸基含量.

1.2.3 硫酸化可得然膠抗氧化的評(píng)估

將可得然膠及其硫酸化產(chǎn)物配制成5 mg/mL的溶液，并稀釋為1 mg/mL、2 mg/mL、3 mg/mL、4 mg/mL、5 mg/mL的樣品待測液.

(1)DPPH自由基能力測定

將DPPH溶于甲醇中，配制成0.2 mmol/L的DPPH溶液.取1 mL不同濃度的樣品待測液，加入2 mL配制好的DPPH溶液與2 mL甲醇，震蕩均勻，室溫下避光反應(yīng)15 min，在517 nm下測定吸光值，計(jì)算對(duì)DPPH清除率[15,16].

(2)羥自由基(·OH)清除能力的測定

采用水楊酸比色法，取1 mL上述濃度的待測樣品溶液于10 mL的試管中，依次加入1 mL 9 mmol/L FeSO4溶液、1 mL 9 mmol/L水楊酸-乙醇溶液，最后加入1 mL 8.8 mmol/L H2O2啟動(dòng)反應(yīng)，震蕩混勻，于37 ℃水浴反應(yīng)37 min，冷卻，在510 nm下測定吸光值，計(jì)算對(duì)·OH清除率[15,16].

(3)超氧陰離子自由基(·O2-)清除能力的測定

取上述濃度的待測液1 mL，依次加入1 mL pH為8.2的Tris-HCl緩沖溶液(50 mmol/L)，0.2 mL 7 mmol/L的鄰苯三酚溶液，震蕩混勻，反應(yīng)10 min后，加入1 mL濃鹽酸終止反應(yīng)，在320 nm下測定吸光值，計(jì)算對(duì)·O2-清除率[15,16].

(4)還原力測定

取不同濃度的樣品溶液1 mL，加入1 mL 0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)和0.125 ml 1%(w/v)的鐵氰化鉀溶液，混合物于50 ℃下水浴20 min.然后加入0.125 mL 10%(w/v)的三氯乙酸，加入1.5 mL的氯化鐵顯色.震蕩混勻，在700 nm處測定吸光值[15,16].

2 結(jié)果與討論

2.1 可得然膠的硫酸基團(tuán)含量分析

基于非選擇性硫酸化修飾、伯羥基硫酸化修飾和非伯羥基硫酸化修飾等策略，可得到不同硫酸化修飾的可得然膠產(chǎn)物.對(duì)于非選擇性硫酸化修飾，硫酸化取代反應(yīng)會(huì)發(fā)生在β-D-葡萄糖單元的2、4或6位羥基上；對(duì)于伯羥基硫酸化修飾，硫酸化取代反應(yīng)僅發(fā)生在β-D-葡萄糖單元的6位羥基上；對(duì)于非伯羥基硫酸化修飾，硫酸化取代反應(yīng)主要發(fā)生在β-D-葡萄糖單元的2或4位羥基上，如圖1所示.

圖1 可得然膠的硫酸化取代反應(yīng)

以K2SO4為標(biāo)準(zhǔn)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過計(jì)算得出不同可得然膠硫酸化修飾產(chǎn)物的硫酸基團(tuán)含量，如表1所示.結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可得然膠均得到了良好的硫酸化修飾，并且硫酸基團(tuán)的含量隨著硫酸化試劑濃度的提高而增加.

表1 硫酸化修飾的可得然膠硫酸基含量分析

*a、b、c和d為顯著性差異分析(p<0.05).

2.2 硫酸化可得然膠對(duì)DPPH自由基的清除能力

通過比較非選擇性硫酸化修飾可得然膠產(chǎn)物(如圖2所示)、伯羥基硫酸化修飾可得然膠產(chǎn)物(如圖3所示)和非伯羥基硫酸化修飾可得然膠產(chǎn)物(如圖4所示)對(duì)DPPH自由基的清除能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，伯羥基硫酸化修飾和非伯羥基硫酸化修飾更有助于提高可得然膠對(duì)DPPH自由基的清除作用.并且，在伯羥基硫酸化修飾可得然膠產(chǎn)物中，樣品4的硫酸基團(tuán)含量為14.31±1.21%表現(xiàn)出最強(qiáng)的清除能力；在非伯羥基硫酸化修飾可得然膠產(chǎn)物中，樣品4的硫酸基團(tuán)含量為20.84±0.38%同樣表現(xiàn)出最強(qiáng)的清除能力.

圖2 非選擇性硫酸化修飾可得然膠對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖3 伯羥基硫酸化修飾可得然膠對(duì)DPPH自由基的清除能力

圖4 非伯羥基硫酸化修飾可得然膠對(duì)DPPH自由基的清除能力

2.3 硫酸化可得然膠對(duì)羥自由基(·OH)的清除能力

通過比較非選擇性硫酸化修飾可得然膠產(chǎn)物(如圖5所示)、伯羥基硫酸化修飾可得然膠產(chǎn)物(如圖6所示)和非伯羥基硫酸化修飾可得然膠產(chǎn)物(如圖7所示)對(duì)羥自由基(·OH)的清除能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非硫酸化修飾和非伯羥基硫酸化修飾更有助于提高可得然膠對(duì)·OH自由基的清除作用.并且，在不同硫酸化修飾產(chǎn)物中，各組的樣品4均對(duì)·OH自由基表現(xiàn)出了較強(qiáng)的清除能力.

圖5 非選擇性硫酸化修飾可得然膠對(duì)羥自由基的清除能力

圖6 伯羥基硫酸化修飾可得然膠對(duì)羥自由基的清除能力

圖7 非伯羥基硫酸化修飾可得然膠對(duì)羥自由基的清除能力

2.4 硫酸化可得然膠對(duì)超氧陰離子自由基(·O2-)的清除能力

通過比較非選擇性硫酸化修飾可得然膠產(chǎn)物(如圖8所示)、伯羥基硫酸化修飾可得然膠產(chǎn)物(如圖9所示)和非伯羥基硫酸化修飾可得然膠產(chǎn)物(如圖10所示)對(duì)超氧陰離子(·O2-)的清除能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硫酸化可得然膠對(duì)·O2-自由基的清除能力隨著硫酸基團(tuán)含量的增加而提高.并且，伯羥基硫酸化修飾和非伯羥基硫酸化修飾更有助于提高可得然膠對(duì)·O2-自由基的清除作用.在非選擇性硫酸化修飾產(chǎn)物中，樣品5的硫酸基團(tuán)含量為12.78±0.41%表現(xiàn)出最強(qiáng)的清除能力；在伯羥基硫酸化修飾可得然膠產(chǎn)物中，樣品3和4的硫酸基團(tuán)含量分別為12.83±0.91%和14.31±1.21%，表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力；在非伯羥基硫酸化修飾可得然膠產(chǎn)物中，樣品4同樣表現(xiàn)出最強(qiáng)的清除能力.

圖8 非選擇性硫酸化修飾可得然膠對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力

圖9 伯羥基硫酸化修飾可得然膠對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力

圖10 非伯羥基硫酸化修飾可得然膠對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力

2.5 硫酸化可得然膠的還原能力

通過比較非選擇性硫酸化修飾可得然膠產(chǎn)物(如圖11所示)、伯羥基硫酸化修飾可得然膠產(chǎn)物(如圖12所示)和非伯羥基硫酸化修飾可得然膠產(chǎn)物(如圖13所示)的還原能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，硫酸化修飾并沒有有效提高可得然膠的還原能力.對(duì)于非伯羥基硫酸化修飾產(chǎn)物，樣品3和4相較于其他硫酸化樣品有輕微增強(qiáng).

圖11 非選擇性硫酸化修飾可得然膠的還原能力

圖12 伯羥基硫酸化修飾可得然膠的還原能力

圖13 非伯羥基硫酸化修飾可得然膠的還原能力

3 結(jié)論

本文探討了不同硫酸化可得然膠產(chǎn)物的抗氧化能力，包括DPPH自由基清除能力、羥自由基清除能力、超氧陰離子自由基清除能力和還原能力.結(jié)果表明，硫酸化修飾可有效提高可得然膠對(duì)自由基的清除能力，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化活性.本研究結(jié)果將為可得然膠的進(jìn)一步開發(fā)利用提供理論依據(jù).