賈 瑋， 張 榮， 陳雪峰， 儲(chǔ)曉剛, 2

(1.陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院， 陜西 西安 710021; 2.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院， 北京 100123)

0 引言

近十年來(lái)，在世界乳制品貿(mào)易持續(xù)擴(kuò)張的背景下，我國(guó)乳制品行業(yè)迅猛發(fā)展，而陜西為其主要產(chǎn)區(qū)[1-3].因奶牛在飼養(yǎng)過(guò)程中食用含有農(nóng)藥殘留的飼料，使得乳制品中含有部分農(nóng)藥殘留[4-7]，同時(shí)農(nóng)藥的種類和使用范圍逐漸增加[8,9]，現(xiàn)有的方法難以同時(shí)分析乳制品基質(zhì)中不同類型的農(nóng)藥殘留[10,11].目前，常用于農(nóng)藥殘留的前處理方法有凝膠滲透色譜法[12]、分散固相萃取法[13]、固相萃取法[14]、快速溶劑萃取[15]等，而分散固相萃取法因簡(jiǎn)便、快速、高效等特點(diǎn)，廣泛地應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的分析中[16-18].

實(shí)驗(yàn)使用分散固相萃取技術(shù)將巴氏殺菌乳進(jìn)行提取凈化后，利用超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜建立同時(shí)測(cè)定巴氏殺菌乳中24種農(nóng)藥殘留的篩查方法，旨在為監(jiān)控乳制品中農(nóng)藥殘留同時(shí)降低乳制品質(zhì)量安全危機(jī)提供技術(shù)支持.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈、甲苯(色譜純)購(gòu)自德國(guó)Merck公司；甲酸、甲酸銨、乙酸、乙酸銨購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；無(wú)水硫酸鎂、無(wú)水乙酸鈉購(gòu)自美國(guó)Supelco公司；氯化鈉(GR)購(gòu)自荷蘭Akzo Nobel公司；滅多蟲、多菌靈、草特靈、毒草安、莠滅凈、唑蟲酰胺、甲氧噻草胺、溴丁酰草胺、三嗪茚草胺、甲草胺、猛殺威、滅草煙、伏草隆、氟啶草酮、嗪氨靈、乙蟲腈、胺丙畏、燕麥靈、敵樂(lè)胺、戊草丹、禾草靈、氟胺氰菊酯、聯(lián)苯菊酯和丁基嘧啶磷共24種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品(純度均大于95%)購(gòu)自德國(guó)Sigma-Aldrich公司及德國(guó)Dr.Erenstofer公司.

1.2 儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜，配備有電噴霧離子源(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；Accucore C-18 aQ色譜柱預(yù)柱與Hypersil Gold aQ C-18色譜柱(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；Avnti J-26×PI型高速冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)；Milli-R04純水儀(德國(guó)Millipore公司)；Vortex.Genie2T型旋渦混合器(美國(guó)Scientific Industries公司).

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

稱取24種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，選用甲醇、乙腈或甲苯配制成1 000 mg/L的單一化合物標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，避光保存于-20 ℃.移取12份各5 mL巴氏殺菌乳空白樣品(實(shí)驗(yàn)前測(cè)定)提取液配制基質(zhì)匹配混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，運(yùn)用真空氮?dú)獯蹈蓛x吹至近干后，配制1～500μg/L的基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液.實(shí)驗(yàn)所用所有標(biāo)準(zhǔn)溶液均現(xiàn)用現(xiàn)配.

1.3.2 樣品前處理

稱取混勻巴氏殺菌乳5 g(精確至0.01 g)，加入10 mL 1%乙酸-乙腈/水(84∶16)溶液至50 mL離心管中，渦旋振蕩30 s后加入1.45 g無(wú)水乙酸鈉、6.0 g無(wú)水硫酸鎂與陶瓷均質(zhì)石，渦旋30 s后振蕩提取1 min，離心5 min(4 ℃、10 000 r/min)，取濾液200μL至進(jìn)樣小瓶中，加入甲醇300μL及8 mmol/L甲酸銨水溶液500μL.渦旋30 s后經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾，進(jìn)行測(cè)定.

1.3.3 色譜質(zhì)譜條件

使用Accucore C-18 aQ預(yù)柱(10 mm×2.1 mm，1.9μm，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)與Hypersil Gold aQ C-18色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9μm，美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量5μL.流動(dòng)相為水+0.1%甲酸+4 mmol/L甲酸銨(A)與甲醇+0.1%甲酸+4 mmol/L甲酸銨(B).梯度洗脫：0 min，100% A，1～7 min，100% A～0% A，12～13 min，0% A～100% A，13～15 min，100% A，流速為0.3 mL/min.電噴霧離子化(ESI)離子源，正離子模式，鞘氣流速為18 L/min，鞘氣壓力為275 Kpa，輔助氣流速為3 L/min；毛細(xì)管電壓為3 500 V，毛細(xì)管溫度為320 ℃.全掃描模式分辨率設(shè)定為70 000 FWHM，自動(dòng)增益控制的目標(biāo)值(AGC)設(shè)定為10×106，二級(jí)掃描模式Full MS/dd-MS2分辨率設(shè)定為17 500 FWHM，AGC為50×105，TOP 5模式.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜方法的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

色譜柱采用Thermo Scientific Hypersil Gold系列，填料顆粒為1.9μm表面多孔實(shí)心核.實(shí)驗(yàn)考察了Hypersil Gold系列中C18、C8和aQ這3種不同選擇性的超高效液相色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.9μm)，三種柱子都是將優(yōu)化的長(zhǎng)鏈烷基鍵合于多孔硅膠表面，Hypersil Gold C18色譜柱pH工作范圍為1～11，載碳量為10%；Hypersil Gold C8為中等極性分析柱，pH工作范圍為2～9，載碳量為8%；C8分析柱比C18分析柱提供更高的分析通量，疏水性弱于C18柱，化合物能更快地從多硅膠層中洗脫出來(lái)；Hypersil Gold aQ色譜柱，pH工作范圍為2～9，載碳量為12%，固定相為中端極性封端的C18鍵合多孔硅膠，在鍵合相為單純的碳鏈時(shí)，分配機(jī)制為主要的保留機(jī)制，促使在C18鍵合相上無(wú)保留或保留弱的極性目標(biāo)分析物得以保留.

實(shí)驗(yàn)中滅多蟲(Methomyl)、多菌靈(Carbendazim)、草特靈(Isocarbamid)、毒草安(Propachlor)、莠滅凈(Ametryn)和唑蟲酰胺(Tolfenpyrad)的加標(biāo)濃度為10μg/kg，以巴氏殺菌乳為基質(zhì)，進(jìn)行前處理后，以目標(biāo)化合物峰面積為考察指標(biāo)，結(jié)果(如圖1所示)表明采用Hypersil Gold aQ色譜柱對(duì)不同類型的分析物分離效果好，對(duì)于雜質(zhì)和目標(biāo)化合物的分離能力強(qiáng)，C8分析柱對(duì)于毒草安中等極性分析物保留較好，對(duì)滅多蟲和多菌靈極性較強(qiáng)的目標(biāo)分析物保留能力較弱，aQ分析柱中極性官能團(tuán)引入鍵合相，增加了反向基質(zhì)的水可潤(rùn)性，可用于100%水溶液流動(dòng)相，而不會(huì)造成“疏水塌陷”，此外aQ分析柱屏蔽了殘余的硅醇基，確保了所有類型分析物都具有較高的分離度與靈敏度.

圖1 6種農(nóng)藥經(jīng)不同色譜柱分離的色譜峰響應(yīng)值(n=6)

2.1.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)分別以不同濃度甲酸-甲酸銨和乙酸-乙酸銨作為流動(dòng)相緩沖體系考察目標(biāo)分析物響應(yīng)值，以巴氏殺菌乳為基質(zhì)，加標(biāo)濃度為10μg/kg，以滅多蟲(Methomyl)、多菌靈(Carbendazim)、草特靈(Isocarbamid)、毒草安(Propachlor)、莠滅凈(Ametryn)和唑蟲酰胺(Tolfenpyrad)為例，從圖2中可以看出，兩種緩沖體系都在0.1%酸量與4 mmol/L鹽量時(shí)獲得最佳效果，從圖3可以看出，在以巴氏殺菌乳為基質(zhì)時(shí)，甲酸-甲酸銨體系比乙酸-乙酸銨體系的離子化效果好.因此確定以0.1%甲酸+4 mmol/L甲酸銨水溶液和0.1%甲酸+4 mmol/L甲酸銨甲醇溶液為流動(dòng)相.

(a)甲酸-甲酸銨緩沖體系

(b)乙酸-乙酸銨緩沖體系圖2 6種農(nóng)藥在不同緩沖體系組合下的色譜峰響應(yīng)(n=6)

圖3 6種農(nóng)藥在兩種緩沖體系下的色譜峰響應(yīng)(n=6)

2.2 質(zhì)譜方法的優(yōu)化

目標(biāo)化合物在四極桿-軌道離子阱質(zhì)譜中的離子傳輸軌跡如圖4所示，在離子束經(jīng)透鏡聚焦后進(jìn)入四極桿時(shí)，若離子的質(zhì)荷比在四極桿設(shè)定的質(zhì)荷比范圍內(nèi)，則通過(guò)八級(jí)桿聚焦后進(jìn)入C-Trap，C-Trap中的真空度為4.0×10-10，低于軌道離子阱質(zhì)譜的真空度2.4×10-10，當(dāng)C-Trap中離子數(shù)目累積至設(shè)定的AGC即10×106時(shí)，離子通過(guò)真空度壓差進(jìn)入軌道離子阱，軌道離子阱運(yùn)用靜電場(chǎng)實(shí)現(xiàn)離子分離與質(zhì)荷比測(cè)定.二級(jí)掃描在全掃描的基礎(chǔ)上得到更具針對(duì)性的碎裂片段數(shù)據(jù)，單位分辨率的四極桿將信息列表中的離子傳輸至C-Trap，C-Trap將離子壓縮后進(jìn)入加有電壓的碰撞池，分子離子在電壓勢(shì)能的推進(jìn)下高速運(yùn)動(dòng)，與壓力為0.8 MPa的高純氮?dú)馀鲎?，斷裂為碎片離子.

若在同一時(shí)間段多個(gè)色譜峰滿足碎裂條件，打碎色譜峰的數(shù)目由TOP N確定(同一時(shí)間打碎響應(yīng)值較高的N個(gè)分子離子)，理論上N=Multiplex×Loop Count，其中Multiplex為增益值，實(shí)驗(yàn)中對(duì)測(cè)定峰響應(yīng)值不進(jìn)行放大，即Multiplex設(shè)定為1.當(dāng)設(shè)定Loop Count等于3，即采用TOP 3采集模式，三種共流出化合物甲氧噻草胺、溴丁酰草胺、三嗪茚草胺的保留時(shí)間分別為8.66 min、8.67 min、8.67 min，四極桿-軌道離子阱質(zhì)譜儀依次對(duì)三種化合物的分子離子進(jìn)行了一次全掃描和三個(gè)分子離子的碎片進(jìn)行了一次二級(jí)片段掃描.隨著N的增大，二級(jí)碎片質(zhì)譜掃描信息(準(zhǔn)確性)逐漸豐富，但用于每個(gè)片段的掃描時(shí)間(精確性)逐漸減少，實(shí)驗(yàn)中，對(duì)Loop Count的設(shè)定進(jìn)行了優(yōu)化，當(dāng)采用TOP 5模式時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性與精確性滿足巴氏殺菌乳中農(nóng)藥殘留分析工作的需要.

圖4 四極桿-軌道離子阱質(zhì)譜儀離子軌跡

2.3 前處理方法優(yōu)化

分散固相萃取前處理方法的本質(zhì)為樣品稀釋的過(guò)程，回收率的主要影響因素為除水劑及用量選擇、緩沖體系的選擇和固體分散凈化劑的選擇與用量，實(shí)驗(yàn)中對(duì)以上參數(shù)進(jìn)行了考察.

2.3.1 除水劑及用量選擇

分散固相萃取前處理方法中，使用無(wú)水硫酸鈉或無(wú)水硫酸鎂除去經(jīng)氯化鈉鹽析重新分配到有機(jī)萃取相中的水分.實(shí)驗(yàn)中除水劑無(wú)水硫酸鈉或無(wú)水硫酸鎂的使用量都為6.0 g，以滅多蟲(Methomyl)、多菌靈(Carbendazim)、草特靈(Isocarbamid)、毒草安(Propachlor)、莠滅凈(Ametryn)和唑蟲酰胺(Tolfenpyrad)的回收率為研究指標(biāo)，加標(biāo)水平為10μg/kg，考察無(wú)水硫酸鈉和無(wú)水硫酸鎂對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥化合物提取效率的影響.從圖5可以看出，使用無(wú)水硫酸鎂時(shí)目標(biāo)化合物的回收率高于無(wú)水硫酸鈉.

圖5 2種分散固相萃取樣品前處理方法對(duì)10 μg/kg加標(biāo)巴氏殺菌乳樣品的回收率比較(n=6)

以滅多蟲(Methomyl)、多菌靈(Carbendazim)、草特靈(Isocarbamid)、毒草安(Propachlor)、莠滅凈(Ametryn)和唑蟲酰胺(Tolfenpyrad)的回收率為研究指標(biāo)，加標(biāo)水平為10μg/kg，考察無(wú)水硫酸鎂用量對(duì)目標(biāo)農(nóng)藥化合物提取效率的影響.由圖6所示，無(wú)水硫酸鎂的使用量為6.0 g時(shí)，目標(biāo)化合物的回收率較好.

圖6 6種農(nóng)藥在不同無(wú)水硫酸鎂使用量下的回收率比較(n=6)

2.3.2 緩沖體系的選擇

在已頒布的官方標(biāo)準(zhǔn)中，分散固相萃取前處理方法通過(guò)使用乙酸-乙酸鈉或倍半水合檸檬酸二鈉-二水合檸檬酸鈉緩沖體系使萃取環(huán)境的pH值變化控制在一定范圍內(nèi)，防止酸性或堿性不穩(wěn)定目標(biāo)物質(zhì)在樣品提取與凈化過(guò)程中因體系離子強(qiáng)度與pH變化造成分解.實(shí)驗(yàn)對(duì)緩沖鹽體系種類與使用量進(jìn)行了研究.以酸環(huán)境不穩(wěn)定農(nóng)藥草特靈(Isocarbamid)與毒草安(Propachlor)、堿環(huán)境不穩(wěn)定農(nóng)藥滅多蟲(Methomyl)與唑蟲酰胺(Tolfenpyrad)、酸或堿環(huán)境均不穩(wěn)定農(nóng)藥莠滅凈(Ametryn)與酸和堿都穩(wěn)定的農(nóng)藥多菌靈(Carbendazim)為目標(biāo)化合物，選擇巴氏殺菌乳基質(zhì)，加標(biāo)水平為10μg/kg，以6種目標(biāo)分析物的回收率作為緩沖鹽體系選擇的評(píng)價(jià)指標(biāo).由圖7所示，萃取環(huán)境構(gòu)成緩沖體系后，前處理過(guò)程pH變化在一定范圍內(nèi)，為提高酸環(huán)境不穩(wěn)定農(nóng)藥、堿環(huán)境不穩(wěn)定農(nóng)藥、酸或堿環(huán)境均不穩(wěn)定農(nóng)藥的穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)選擇乙酸-乙酸鈉緩沖鹽體系.

圖7 3種分散固相萃取樣品前處理方法對(duì)10 μg/kg加標(biāo)巴氏殺菌乳樣品的回收率比較(n=6)

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍與相關(guān)系數(shù)

精密移取24種農(nóng)藥的混合標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液，配制濃度為0.1、0.5、1、2、4、8、10、20、40、80、100、200、400、500μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液.以標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度(μg/kg)為橫坐標(biāo)，農(nóng)藥殘留定量離子色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)校準(zhǔn)曲線.線性結(jié)果(如表1所示)顯示，各農(nóng)藥殘留物質(zhì)在各自線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.99，線性關(guān)系良好.

2.4.2 準(zhǔn)確性和精密度

24種農(nóng)藥殘留物質(zhì)的確定限(CCα)和檢測(cè)容量(CCβ)分別為0.04 ～4.2μg/kg與0.07 ～7.27μg/kg.通過(guò)回收率評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性.利用6次平行實(shí)驗(yàn)的回收率結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的精密度，在巴氏殺菌乳中添加CCβ、2倍CCβ和4倍CCβ的農(nóng)藥殘留物質(zhì)的系列混合標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液，按照1.3.2的步驟處理后檢測(cè)分析，結(jié)果如表1所示.24種農(nóng)藥殘留物質(zhì)的平均回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為78%～110%和0.8%～7.4%，在方法準(zhǔn)確性和精密度均滿足定量分析的要求，同時(shí)均低于已發(fā)表文獻(xiàn)[19]對(duì)于乳制品中農(nóng)藥多殘留檢測(cè)結(jié)果.

表1 巴氏殺菌乳中24種農(nóng)藥的線性范圍、確定限、檢測(cè)容量、相關(guān)系數(shù)、平均回收率及精密度(n=6)

3 結(jié)論

本文建立了超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道離子阱質(zhì)譜聯(lián)用快速分析測(cè)定巴氏殺菌乳中24種農(nóng)藥殘留的方法，同時(shí)采用優(yōu)化的分散固相萃取法對(duì)樣品進(jìn)行前處理.對(duì)實(shí)驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線、準(zhǔn)確度、精密度方面進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果均滿足定量分析的要求，能滿足目前乳制品中對(duì)多種農(nóng)藥殘留分析的要求.