羅丹 朱瀟邦 蔣明 鄔子珉 王昌明

桂林市人民醫(yī)院（廣西桂林541000）

慢性阻塞性肺疾?。╟hronic observation pulmonary disease，COPD）是一種常見、多發(fā)、高致殘率和高致死率的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，肺血管重塑是COPD繼發(fā)肺動(dòng)脈高壓形成的主要機(jī)制和病理表現(xiàn)，肺動(dòng)脈高壓直接影響COPD的預(yù)后，目前缺乏有效的防治手段。通過多個(gè)途徑探究肺血管重塑的發(fā)病機(jī)制，并阻止之，將為COPD繼發(fā)肺動(dòng)脈高壓的防治探尋新的干預(yù)靶點(diǎn)提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，是目前肺動(dòng)脈高壓發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)，亦是本研究的出發(fā)點(diǎn)。

肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（pulmonary artery smooth muscle cells，PASMCs）是肺血管重塑的重要效應(yīng)細(xì)胞，受到炎癥、缺氧、創(chuàng)傷等刺激因素后通過表型轉(zhuǎn)化參與肺血管重塑。本課題組的前期研究［1］證實(shí)無低氧血癥的COPD大鼠已出現(xiàn)以肌化型肺小動(dòng)脈百分比增高、肺小動(dòng)脈周圍炎癥細(xì)胞聚集的病理學(xué)改變；以核因子-κB（NF-κB）為核心的肺內(nèi)、全身炎癥反應(yīng)是早期COPD模型大鼠肺血管重塑的核心機(jī)制；并證實(shí)PASMCs發(fā)生表型轉(zhuǎn)化，具合成分泌功能，LPS通過介導(dǎo)TLR4信號(hào)誘導(dǎo)PASMCs合成分泌IL-6、IFN-γ、PDGF-AB，進(jìn)而加重炎癥反應(yīng)及肺血管重塑，而單核巨噬細(xì)胞趨化因子、TGF-β1并非通過TLR4信號(hào)通路調(diào)控，其相應(yīng)信號(hào)通路及調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究探索。

自噬是一種溶酶體依賴性降解途徑，普遍存在于細(xì)胞內(nèi)，對(duì)細(xì)胞維持自身穩(wěn)態(tài)十分重要［2-3］。LC3蛋白是自噬體膜上標(biāo)志性蛋白，是反映自噬活性較特異的指標(biāo)，細(xì)胞中自噬標(biāo)記蛋白LC3有兩種存在形式（LC3Ⅰ、LC3Ⅱ），前體LC3合成后經(jīng)加工形成LC3Ⅰ，后者與自噬體膜上的磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3Ⅱ，當(dāng)自噬形成時(shí)LC3Ⅰ會(huì)減少而LC3Ⅱ會(huì)增加?？梢酝ㄟ^檢測(cè)LC3的表達(dá)、分析LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值變化來判斷細(xì)胞的自噬活性［4］。本研究將通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)探索PASMCs自噬與其合成分泌功能的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、主要試劑和儀器SPF級(jí)健康的雄性SD大鼠30只體質(zhì)量（250±20）g，周齡一般為8～10周，桂林醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：SYXK桂2013-0001。黃果樹牌香煙（貴陽卷煙廠生產(chǎn)，焦油量：15 mg，煙氣煙堿量1.2 mg），脂多糖（購自美國sigma公司），雷帕霉素（購于美國MCE公司），3-MA（購于美國MCE公司），胎牛血清［購自美國GIBCO（500 mL/瓶）］，DMEM/F12培養(yǎng)基［購自GIBCO公司（500 mL/瓶）］，Ⅰ型膠原酶（購自Hyclone公司），ELISA試劑盒（購于美國abcam公司），抗-LC3抗體（購于美國abcam公司），抗-Beclin1抗體（購于美國abcam公司），山羊抗兔二抗（購于Proteintech公司），BCA蛋白測(cè)定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），RIPA（蛋白裂解液）（北京Solarbio公司），PVDF膜（購于美國Millipore公司），自制的香煙煙霧暴露及低氧有機(jī)玻璃艙（規(guī)格：0.90 m×0.40 m×0.60 m），二氧化碳培養(yǎng)箱（德國hereus公司），倒置熒光相差顯微鏡（日本奧林巴斯IXTIFL公司），NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)（日本Thermo公司），BP-221S電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司），超微量紫外分光光度計(jì)（BP-221S北京賽多利斯儀器有限公司），微量臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（日本Thermo公司）。

1.2 酶消化聯(lián)合組織塊貼壁法分離、培養(yǎng)原代COPD大鼠遠(yuǎn)端肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（1）用注射器吸取配制好的10%水合氯醛，行腹腔注射麻醉大鼠（0.3～0.4 mL/100 g），將其浸泡于75%酒精中5 min；（2）將老鼠四肢用注射器針頭固定在自制的泡沫盒上，逐層剪開皮膚-肌肉-肋骨，將心肺取出，放入含1%雙抗的PBS中，將血水洗凈，一般漂洗3～4次；（3）將心肺迅速轉(zhuǎn)移到超凈臺(tái)培養(yǎng)皿中，固定心臟，找到肺動(dòng)脈起始端，逐層分離肺動(dòng)脈至3級(jí)以下分支，剝?nèi)パ芾w維層及外膜，再次漂洗血管后移至新的培養(yǎng)皿；（4）用鑷子固定血管一端，用眼科剪從固定端縱向剖開大鼠肺動(dòng)脈，將內(nèi)膜面向上，用彎鑷刮除內(nèi)膜；將組織漂洗干凈；（5）將洗凈的中膜轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，將其剪成1 mm3的小塊，加入配制好的0.2%的Ⅰ型膠原酶（約3 mL），充分混勻，擰緊管蓋，將離心管置于37℃水浴箱中進(jìn)行消化約20 min，每5 min輕輕搖晃一次，確保組織塊充分消化；（6）消化完成后加入含20%胎牛血清（FBS）DMEM/F12培養(yǎng)基（3 mL）終止消化，離心（1 000 r/m，5 min）；（7）輕輕棄掉上清，加入約1.5 mL完全培養(yǎng)基（20%FBS，1%雙抗），輕柔重懸混勻，用巴氏吸管將其鋪于培養(yǎng)瓶底，稍靜置十幾秒，輕輕立起培養(yǎng)瓶，待組織塊與瓶底貼緊（約10 min）輕輕把培養(yǎng)瓶放平，再補(bǔ)足培養(yǎng)液至3 mL；放入培養(yǎng)箱（37 ℃，5%CO2，3%O2）進(jìn)行培養(yǎng)；（8）3 d后換液1次，在第5～8天左右顯微鏡下觀察，可見少許細(xì)胞從組織塊周圍爬出，9～10 d左右，細(xì)胞可鋪滿瓶底。進(jìn)行消化傳代。將第4、5代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞按1×106/孔的比列接種于6孔板中，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組（1）對(duì)照組：不加入任何干預(yù)劑；（2）LPS組：加入LPS后培養(yǎng)（終濃度為1 μg/mL）；（3）Rapamycin+LPS組：Rapamycin預(yù)處理30 min后（終濃度為5 μg/L）加入LPS后培養(yǎng)（終濃度為1 μg/mL）；（4）3-MA+LPS 組：3-MA預(yù)處理30 min后（終濃度為5 mmol/L）加入LPS后培養(yǎng)（終濃度為 1 μg/mL）；（5）Rapamycin 單獨(dú)處理組：加入Rapamycin培養(yǎng)（終濃度為5 μg/L）；（6）3-MA 單獨(dú)處理組：加入3-MA培養(yǎng)（終濃度為5 mmol/L）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法以上各組分別培養(yǎng)48 h后，以上每組做4個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)2次。各組分別于培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞或細(xì)胞培養(yǎng)上清液測(cè)定以下指標(biāo)：（1）Western Blot檢測(cè) PASMCs自噬標(biāo)記蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Beclin-1的蛋白表達(dá)量；（2）酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）方法檢測(cè)各組培養(yǎng)上清液中IL-6及PDGF的含量變化。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。多樣樣本均數(shù)間的比較用單因素ANOVA分析，方差齊用SNK法，不齊時(shí)用Welch校正檢驗(yàn)；P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分別分析自噬與合成分泌細(xì)胞因子的相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在不同時(shí)期的生長狀態(tài)如圖1所示：在第5～8天左右顯微鏡下觀察，可見少許細(xì)胞從組織塊周圍爬出，9～10 d左右，細(xì)胞可鋪滿瓶底。進(jìn)行消化傳代。將第4、5代生長狀態(tài)良好的細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)用細(xì)胞。

圖1 細(xì)胞生長不同時(shí)期的狀態(tài)（×40）Fig.1 State of cell growth in different periods

2.2 自噬調(diào)控劑（RA+3-MA）對(duì)LPS誘導(dǎo)下大鼠PASMCs中LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ及Beclin-1的表達(dá)量的影響如圖2所示：LPS組、Rapamycin+LPS組與對(duì)照組相比LC3-Ⅱ/β-actin灰度比、Beclin-1/β-actin灰度比升高（P＜ 0.05），LC3-Ⅰ/β-actin灰度比降低，LC3Ⅱ/LC3I比值升高；Rapamycin+LPS組與LPS組相比LC3-Ⅱ/β-actin灰度比、Beclin-1/β-actin灰度比及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值升高明顯升高（P＜0.05），3-MA+LPS組與LPS組相比LC3-Ⅱ/β-actin灰度比、Beclin-1/β-actin灰度比及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值降低（P＜ 0.05）。

2.3 自噬調(diào)控劑（RA+3-MA）對(duì)LPS誘導(dǎo)下大鼠PASMCs合成分泌相關(guān)因子PDGF-AB、IL-6分泌量的影響如表1、圖3所示：LPS組、Rapamycin+LPS組與3-MA+LPS對(duì)照組相比增加，Rapamycin+LPS組與LPS組相比明顯升高，3-MA+LPS組與LPS組相比降低。

表1 細(xì)胞上清液中PDGF-AB、IL-6在不同干預(yù)條件下分泌量的比較Tab.1 The comparison of PDGF-AB，IL-6 secretion on the cell culture supernatant at different intervention x±s

圖2 不同干預(yù)條件下LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值以及Beclin1/β-actin的灰度比Fig.2 The ratio of LC3Ⅱ/LC3Ⅰ and the grayscale ratio of Beclin1/beta-actin in different intervention conditions

2.4 相關(guān)性分析如表2所示：LPS誘導(dǎo)下COPD大鼠肺動(dòng)脈平滑肌中自噬相關(guān)基因LC3-Ⅱ、Beclin-1的表達(dá)量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ與COPD大鼠PASMCs合成分泌功能存在相關(guān)性。

表2 COPD大鼠肺動(dòng)脈平滑肌中LC3-Ⅱ、Beclin-1的表達(dá)量及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ與PDGF-AB、IL-6的相關(guān)性分析Tab.2 correlation analysis among LC3-Ⅱ，Beclin-1 expression and LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰwith PDGF-AB，IL-6 in pulmonary artery smooth muscle of COPD rats

圖3 PASMCs在不同干預(yù)條件下PDGF-AB及IL-6分泌量Fig.3 expression of PDGF-AB in PASMCs under different intervention conditions

3 討論

COPD是一種炎癥性疾病，后期繼發(fā)為肺動(dòng)脈高壓，而肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞在肺動(dòng)脈高壓形成過程中占有重要作用，是肺動(dòng)脈高壓中肺血管重塑的主要效應(yīng)細(xì)胞［1-2］。因此，本實(shí)驗(yàn)采用COPD大鼠提取的原代肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞為研究對(duì)象［5-8］，探索LPS誘導(dǎo)下大鼠PASMCs自噬與表型轉(zhuǎn)化的相關(guān)性，進(jìn)而研究其在肺血管重塑中的相互作用。

近年來羅金泰等［8］致力于LPS對(duì)VSMCs表型轉(zhuǎn)化的影響，他們使用不同濃度的LPS處理VSMCs，結(jié)果顯示收縮型表型標(biāo)志物-SMA、SMMHC的表達(dá)在24和48 h時(shí)相關(guān)炎癥因子均能不同程度地下調(diào)，說明炎癥可誘導(dǎo)VSMCs細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化并具有合成分泌功能。并且他們認(rèn)為，LPS誘導(dǎo)VSMCs合成分泌功能［5-11］，證實(shí)了炎癥因子對(duì)自噬誘導(dǎo)作用，如PDGF-AB、IL-6，但關(guān)于在PASMCs中的研究尚未見報(bào)道。本課題組前期研究證明LPS誘導(dǎo)下 PDGF-AB、IL-6的分泌在48 h達(dá)到高峰［1］。且受TLR4信號(hào)通路調(diào)控，而TGF-β1及巨噬細(xì)胞趨化因子不受TLR4信號(hào)通路調(diào)控［11］，其調(diào)控機(jī)制有待進(jìn)一步研究。對(duì)于炎癥因子對(duì)自噬的誘導(dǎo)［7-8］，以及其所誘導(dǎo)的自噬對(duì)PASMCs合成分泌功能的影響，目前研究尚處于起步階段，具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步探索。

目前VSMCs表型轉(zhuǎn)化領(lǐng)域面臨的問題主要包括：（1）不同VSMCs表型之間的明確標(biāo)志還有待發(fā)現(xiàn)；（2）VSMCs表型轉(zhuǎn)化的細(xì)胞內(nèi)分子機(jī)制有待進(jìn)一步闡明；（3）VSMCs自噬與表型轉(zhuǎn)化的相關(guān)性有待進(jìn)一步探索。這也是當(dāng)今VSMCs表型轉(zhuǎn)化研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)［9-10］。本研究以自噬調(diào)控劑為工具藥，通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)LPS誘導(dǎo)下PASMCs自噬與其合成分泌功能可能相關(guān)，PASMCs可能通過改變自噬水平，調(diào)節(jié)其合成分泌功能參與肺血管重塑。COPD大鼠PASMCs合成分泌功能與肺血管重塑的相關(guān)性及作用機(jī)制尚不明確，有待進(jìn)一步研究。