于鵬 紀志華 賈丙申 周立義 付昆

海南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院關節(jié)創(chuàng)傷外科，海南 ?？?570102

骨移植手術中，自體骨是最有效的材料，但將其用于修復骨缺損或脊柱融合術中存在造成取骨供體部位創(chuàng)傷及骨量有限因素限制。自體或同種異體骨可常規(guī)應用于促進骨再生[1]，但供體骨來源同樣有限，且具有病原體感染和排異的潛在風險。人工骨的研究和使用解決了這個問題，而珊瑚羥基磷灰石(coralline hydroxyapatite，CHA)人工骨的研究是其中的熱點。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)具有廣泛的骨形成潛能[2]，鑒于難以評估其在人體內(nèi)的成骨潛能，之前多采用的是免疫功能低下的動物系統(tǒng)進行實驗研究[3]，例如小鼠等模型系統(tǒng)在此類實驗中被廣泛使用，免疫缺陷小鼠的MSCs發(fā)育形成成熟的骨組織是一個長期的過程，其形成極有可能依賴于細胞生存環(huán)境的穩(wěn)定。相關研究表明[4]，通過培養(yǎng)使得MSCs形成異位骨組織，可以成功將其植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)。然而僅僅在2周內(nèi)就基本被機體清除，無法得到長期的保留與發(fā)育?？蓳?jù)此推測，成骨細胞移植到免疫缺陷小鼠體內(nèi)后無法維持發(fā)育的原因是小鼠體內(nèi)環(huán)境不適宜該細胞生長發(fā)育，因為人類成骨細胞的發(fā)育需要特定生長因子，而小鼠缺乏，因而導致宿主巨噬細胞和其他免疫細胞增生為特征的炎癥反應，引起廣泛的異位骨吸收。本研究旨在通過CHA負載含BMP-2納米緩釋微球體系促進MSCs分化成骨。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究使用的CHA的孔徑和表面結構參考以往同類研究[5-6]，購自北京創(chuàng)意生物工程新材料有限公司。BMP-2購自上海嶸崴達實業(yè)有限公司。聚乳酸-羥基乙酸共聚物[poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA](50:50)購自北京沃海環(huán)球科技有限公司(阿波羅試劑)。甲醛、Triton X100、丙酮、甲醇、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer solution, PBS)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、甲苯胺藍染色均購自上海生工公司。從自脊柱融合的髂骨移植術后患者抽取10 mL骨髓，采用無菌肝素抗凝的注射器盛裝，用以制備MSCs?；颊邔Ρ狙芯烤橥?，并簽署骨髓捐贈知情同意書，本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1MSCs分離與培養(yǎng)：每個骨髓樣品用PBS洗滌3次，保留沉淀與上清液5 mL，采用密度梯度離心，從1.073 g/mL的密度界面分離出目的細胞，將細胞重懸并接種于T-75燒瓶中，每瓶2×105個。培養(yǎng)液中含有20%胎牛血清(FBS)和抗生素的達爾伯克改良伊格爾的中低葡萄糖(DMEM-LG；Gibco，Grand Island，NY)，培養(yǎng)箱環(huán)境為37 ℃，5%CO2。連續(xù)培養(yǎng)7 d后更換培養(yǎng)基，加入青霉素(100 mL)和鏈霉素(100 mg/mL)。同時除去未貼壁細胞。MSCs作為對稱集落生長，用0.05%胰蛋白酶(鄭州奇雅化工產(chǎn)品有限公司)處理10～14 d后傳代并接種到新瓶內(nèi)。

1.2.2制備BMP-2并載到CHA上的過程：采用水-油-水方式制備BMP-2緩釋微球的PLGA。將200 mg PLGA溶解在1 mL二氯甲烷中，混勻后加入1 mg BSA作為BMP-2的載體。配比為BSA1mg+rhBMP-2 20 g，去離子水200 μL。將整個混合物用超聲波發(fā)生器(Microson TM Ultrasonic Cell Disruptor，NY)在2 W的冰水浴中超聲處理1 min(靜止10 s，靜止10 s)以形成初級水油乳液，室溫下用1%聚乙烯醇(Polyvinyl alcohol PVA)10 mL溶液以6 500 r/min的轉(zhuǎn)速均質(zhì)化30 s。將所得的乳液在攪拌下倒入1%PVA 90 mL溶液中3 h以蒸發(fā)有機溶劑。所得的PLGA微球體用蒸餾去離子水洗滌3次，并通過以2 000 r/min離心(Beckman Coulter，Allegrax12R，USA)進行收集。將微球體凍干(Edwards Modulyo，Crawley，England)過夜，即為CHA-BMP-2-hMSCs成品冷凍保存待用。

將BMP-2包封的微球體懸浮在具有CHA的溶液中，渦旋混勻確保微球體能夠滲入CHA中的200 μm多孔通道。通過超聲處理將微球懸浮于0.02%吐溫80 ℃的水溶液中10 min。通過溶劑萃取法測定BMP-2在PLGA微球中的包封率，將rhBMP-2包封的微球體溶解在2 mL二氯甲烷中，后加入0.1 mol/L PBS 5 mL。使用IKA微型反應器(MS2，IKA works Inc.，USA)以2 500 r/min轉(zhuǎn)速將混合物渦旋1 min，37 ℃溫育將BMP-2從有機相中萃取至水相，1 000 r/min振蕩2 h。低溫離心機以10 000 r/min離心之后測定上清液中的蛋白質(zhì)，平行測定3次。

1.2.3分組進行皮下植入：在體外培養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)2周，將CHA-BMP-2-hMSCs與CHA -hMSCs移植物分別植入兩組小鼠的L4和L5橫向軟組織中。10周后處死小鼠，進行骨礦物質(zhì)含量(bone mineral content，BMC)檢查。

1.2.4指標檢測：(1)檢測堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)活性。10 d后，取小鼠血樣采用全自動生化分析儀進行ALP活性測定。(2)免疫組織化學。將植入物取出后進行切片晾干并固定在10%福爾馬林緩沖液、0.5%苯胺、pH 4.5醋酸緩沖液中染色，顯微鏡下觀察骨樣組織形成的面積。(3)Western bloting檢測。采用Western blot方式檢測小鼠血中Runx2蛋白與骨橋蛋白表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 檢測ALP活性

10 d后，取小鼠血樣采用全自動生化分析儀進行ALP活性測定。非緩釋組小鼠的ALP活性為(1.67±0.42)nmol/min，顯著低于CHA-BMP-2-hMSCs 的(2.55±0.53)nmol/min(t=8.254，P<0.01)。

2.2 免疫組織化學

將植入物取出后進行切片晾干并固定在10%福爾馬林緩沖液、0.5%苯胺、pH 4.5醋酸緩沖液中染色，顯微鏡下觀察骨樣組織形成的面積。結果可見非緩釋組小鼠的CHA支架表面未見骨樣組織形成。而在緩釋組小鼠的CHA支架上可見約20%的面積已被骨狀組織覆蓋。非緩釋組小鼠骨樣組織形成面積顯著低于緩釋組小鼠(P<0.05)。見圖1。

圖1 兩組免疫組織化學染色(顯微鏡下觀察骨樣組織形成的面積)Fig.1 Immunohistochemical staining (microscopic observation of the area of bone-like tissue formation)注：NB：新骨；OS：類骨質(zhì)；S：復合物

2.3 Western blot檢測

采用Western blot方式檢測小鼠血中Runx2蛋白與骨橋蛋白表達水平。結果可見非緩釋組小鼠的Runx2蛋白表達水平為(1.42±0.18)fold，顯著低于緩釋組的(2.36±0.21) fold(t=6.758，P<0.01)；骨橋蛋白表達水平為(1.78±0.26) fold，顯著低于緩釋組的(3.17±0.27)fold(t=9.724，P<0.01)；骨鈣素表達水平為(1.24±0.08)fold，顯著低于緩釋組的(1.75±0.12)fold(t=4.336，P<0.01)。

3 討論

骨骼形成后需要成骨細胞與破骨細胞的平衡來維持。成骨細胞的形成和破骨細胞引導的生理過程受多種生物學與力學因素的調(diào)節(jié)，由成骨細胞形成新骨，由破骨細胞破壞吸收舊骨并引導成骨細胞成骨。有研究顯示，自年輕患者與老年患者體內(nèi)分離的hMSCs克隆形成率無顯著差異[7]，年輕患者與老年患者的區(qū)別在于骨增殖能力和骨再生能力的不同。老年人骨形成和骨吸收不平衡，有利于骨吸收，導致骨丟失和骨質(zhì)疏松[8]。可能的原因為老年人激素水平已經(jīng)發(fā)生改變，或局部產(chǎn)生了細胞因子[9-10]。CHA已被證明能夠支持MSCs在體外的增殖和分化，因此可被用作骨替代材料[11]，CHA結合BMP或膠原蛋白也成功地在體外實驗中實現(xiàn)了骨再生。然而在早期研究顯示，將CHA 結合hMSCs后植入免疫缺陷小鼠，5周后沒有生長出任何骨組織[12]。這意味著成骨細胞在成骨誘導過程中可能在某種程度上依賴于由支架化學成分與宿主組織之間相互作用建立的局部微環(huán)境。為了能夠長時間維持骨形成過程，可能需要骨形成信號的長時間作用。然而，這種骨是來源于供體細胞還是通過宿主細胞的骨誘導，尚未得到確定。

為了促進以骨吸收為主的環(huán)境中的骨形成，可能需要持續(xù)供應刺激合成代謝的生長因子以延長期望的骨形成過程。BMP-2已被廣泛用作體內(nèi)和體外骨形成的誘導劑和增強劑[13]，并已廣泛應用于臨床[14-15]。且目前BMP的應用劑量相對較高，如BMP7為3.5 mg單劑量，rhBMP-2單劑量為12 mg[16]。但無論劑量如何，應用的哪種BMP，若要在長時間內(nèi)維持穩(wěn)定劑量都需要一個適宜的遞送系統(tǒng)，以便優(yōu)化骨愈合的長期過程[17]。這種系統(tǒng)不僅能夠提供適當?shù)尼尫艜r間，還能提供釋放的載體，以保持與周圍組織之間的完整性。優(yōu)化的輸送系統(tǒng)能夠提高成骨潛能而盡可能減少BMP的總體用量，更為安全而經(jīng)濟[17-18]。

由于上述原因，本研究將hBMP-2包裹在用于控制釋放hBMP-2的微球中。將復合物植入免疫缺陷小鼠皮下，通過hBMP-2的緩釋作用，在植入10周后處死小鼠，可見在植入CHA-hBMP-2-hMSC后的小鼠CHA支架上觀察到骨組織的形成。血清學與Western blot也顯示植入CHA-hBMP-2-hMSC后的小鼠骨生成較植入CHA-hMSC后的小鼠更為活躍。

由此可見，通過優(yōu)化CHA-hBMP-2-hMSC組合，可以將CHA作為功能性生物材料進行激活，有效彌補較大的骨缺損、老齡以及炎癥等之前被認為缺乏適合長期骨組織形成環(huán)境的劣勢，通過CHA-hBMP-2-hMSC系統(tǒng)的緩釋作用解決問題。

綜上所述，將CHA作為支架結合MSCs，并配合BMP-2緩釋微球形成復合物進行植入，通過上調(diào)骨鈣素、Runx2蛋白與骨橋蛋白表達水平，支持免疫缺陷小鼠骨形成的時間能夠長達10周。