郝彥明 王洪震 何大偉 方玲娜 張盼盼 陸榮柱 徐又佳 李翀*

1.昆山市第一人民醫(yī)院骨科，江蘇 昆山 2153002.昆山市第一人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)中心，江蘇 昆山 2153003.昆山市第一人民醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇 昆山 2153004.蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科，江蘇 蘇州 215004

骨質(zhì)疏松作為一種患病率、致殘率和致死率均非常高的慢性疾病，以骨量減少、骨脆性增加、骨折風(fēng)險(xiǎn)增高為特征，是中老年骨痛和骨折的主要原因。但目前治療骨量丟失的常見藥物有鈣劑、維生素D、降鈣素、雌激素、二膦酸鹽、選擇性的雌激素受體激動劑等，并且最新的Meta分析提示服用鈣劑和維生素D不能降低骨質(zhì)疏松患者骨折風(fēng)險(xiǎn)[1]；長期使用二膦酸鹽可導(dǎo)致一些副作用，如：食管炎、特殊骨折、下頜壞死、房顫等，所以需要進(jìn)一步研究安全有效的預(yù)防骨量減少和治療骨質(zhì)疏松癥的新策略、新靶點(diǎn)。

硫化氫(H2S)被證實(shí)是繼CO、NO后存在于體內(nèi)的第3種內(nèi)源性氣體分子，有著廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、肌肉等組織系統(tǒng)中均有廣泛的分布，參與許多生理和疾病的病理生理過程。近年來，不斷有研究發(fā)現(xiàn)H2S在骨代謝以及骨質(zhì)疏松、骨關(guān)節(jié)炎等疾病中也有著重要的調(diào)控作用，可能成為治療骨質(zhì)疏松癥的新靶點(diǎn)。本研究團(tuán)隊(duì)針對血清H2S水平與骨質(zhì)疏松的相關(guān)性做了初步研究，目的是研究體內(nèi)血清H2S水平含量與骨質(zhì)疏松指標(biāo)的相關(guān)意義，探尋抗骨質(zhì)疏松新的靶點(diǎn)和治療措施。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2015年10月至2017年10月，112例江蘇昆山地區(qū)體檢和門診就診人員資料，受檢骨密度和血常規(guī)(血清H2S檢測使用血常規(guī)檢查后血樣)的患者，其中男82例，女30例，年齡25～86歲，平均(51.40±10.60)歲。排除標(biāo)準(zhǔn)[2]：(1)多發(fā)骨折、開放性骨折、暴力性骨折(交通傷、墜落傷等)；(2)合并慢性肝腎疾病、代謝性疾病、腫瘤、血液系統(tǒng)疾病；(3)行卵巢切除術(shù)；(4)長期接受糖皮質(zhì)激素、雌激素、降鈣素以及雙膦酸鹽等治療，患者均知情同意，且本研究獲得昆山市第一人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 檢測指標(biāo)

1.2.1骨密度檢測。對昆山地區(qū)體檢和門診就診人員采用美國Lunar公司DPX-NP雙能X線骨密度儀檢測髖部和腰椎(L1～4)骨密度，自動生成T值；其中T≥-1.0為正常，T值位于-1.0～-2.5為骨量減低，T≤-2.5為骨質(zhì)疏松癥[3]。

1.2.2血清相關(guān)指標(biāo)測定。選取檢查骨密度患者的血常規(guī)血樣，血常規(guī)行急查后立即離心血清，保存于-80 ℃冰箱，以待統(tǒng)一檢測血清硫化氫濃度，采用德國TSZ人硫化氫ELISA試劑盒，目錄號：hg14903，試劑存儲在2 ℃～8 ℃，使用試劑盒檢測H2S水平，使用純化的抗體涂層微孔平板，制作固相抗體，樣品包括標(biāo)準(zhǔn)已知濃度和未知被移進(jìn)包被微孔，孵育后加入生物素化抗IgG，結(jié)合鏈霉親和素洗后成為抗體-抗原-酶-抗體復(fù)合物完全，加入TMB底物TMB顯色溶液，溶液變成藍(lán)色，在HRP酶催化下，在酸的作用下最終變成黃色，這種有色產(chǎn)品的強(qiáng)度與樣品中H2S的濃度相關(guān)，測定光密度(OD)在450 nm的微孔板的讀數(shù)，通過標(biāo)準(zhǔn)計(jì)算H2S濃度曲線。計(jì)算結(jié)果平均定量，重復(fù)讀數(shù)控制，并減去平均零標(biāo)準(zhǔn)樣品的光密度。繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過繪制每個標(biāo)準(zhǔn)軸上的平均吸光度與濃度的曲線。X軸通過圖1上的點(diǎn)繪制最佳擬合曲線。

圖1 血清H2S濃度與股骨骨密度行Pearson相關(guān)性分析Fig.1 Pearson correlation analysis between serum H2S concentration and femoral bone mineral density

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件(IBM公司，美國)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以血清H2S濃度為自變量，髖部和腰椎骨密度分別作為因變量，行Pearson相關(guān)性分析；行多元回歸分析以及偏相關(guān)分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)儀值取雙側(cè)0.05。

2 結(jié)果

昆山地區(qū)受檢人員測定的骨密度和血清H2S相關(guān)性分析，以血清H2S濃度為變量的自變量，髖部和腰椎骨密度分別作為因變量，行Pearson相關(guān)性分析，其中血清H2S濃度與腰椎骨密度相關(guān)分析得出相關(guān)系數(shù)r=-0.161，P>0.05，血清H2S濃度與腰椎骨密度無顯著相關(guān)性；但是血清H2S濃度與髖部股骨骨密度相關(guān)分析得出r=-0.376，P<0.05，血清H2S濃度與髖部股骨骨密度有顯著相關(guān)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

本研究團(tuán)隊(duì)是首次報(bào)道通過人體臨床研究血清H2S與骨密度的相關(guān)性。本研究團(tuán)隊(duì)在該臨床研究中建立了血清H2S檢測方法，收集了江蘇昆山地區(qū)112例體檢人員，通過DPX-NP雙能X線測定骨密度，亞甲基藍(lán)法檢測血清H2S。通過分析發(fā)現(xiàn)血清H2S水平與髖部骨密度呈負(fù)相關(guān)(r=-0.376，P=0.001)，提示內(nèi)源性H2S可能為骨密度的保護(hù)因素。

Vacek 等[4]通過切除大鼠的卵巢制作絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松模型，檢測大鼠體內(nèi)內(nèi)源性H2S水平，觀察外源性H2S供體硫氫化鈉對PMOP的影響。并從細(xì)胞自噬的角度探討H2S抗骨質(zhì)疏松的可能機(jī)制，研究證明H2S參與了動物體內(nèi)骨的代謝，H2S通過抑制氧化應(yīng)激保護(hù)成骨細(xì)胞的功能。H2S還參與了其他多種生理與病理生理過程，具有廣泛的生物學(xué)效應(yīng)，逐漸顯示出極大的治療性應(yīng)用前景。如果進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)外源性H2S能夠抑制OP的發(fā)生，本研究將為骨質(zhì)疏松的防治提供新的線索和策略。

H2S對非骨骼系統(tǒng)不同程度保護(hù)的作用已經(jīng)有大量研究證實(shí)，如保護(hù)心肌；保護(hù)并預(yù)防缺血再灌注引起的損傷[5]。保護(hù)氧化應(yīng)激引起的神經(jīng)元的損傷[6]，同樣，Xu等[7]通過細(xì)胞層面研究證明合適濃度H2S對骨系統(tǒng)也發(fā)揮正面效果，H2S可以通過抑制離體成骨細(xì)胞的氧化應(yīng)激對骨質(zhì)疏松起到保護(hù)作用，H2S能保護(hù)氧化應(yīng)，應(yīng)激誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的損傷，保護(hù)成骨細(xì)胞的功能。

Dhonukshe-Rutten等[8]通過對破骨細(xì)胞研究認(rèn)為，H2S可以通過H2S供體GYY4137促使破骨細(xì)胞分化的加速度，并且增加破骨細(xì)胞內(nèi)水平的抗氧化劑谷胱甘肽，抑制破骨細(xì)胞生成RANKL刺激巨噬細(xì)胞，但該結(jié)論和機(jī)理還存在一定爭論，需要進(jìn)一步研究。而本研究通過閱讀相關(guān)文獻(xiàn)給予簡單總結(jié)：引起的氧化應(yīng)激還是抗氧化防御，取決于細(xì)胞的氧化還原狀態(tài)的細(xì)胞功能雙面效果，筆者推測[9]RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞向哪方面分化是取決于前體細(xì)胞是受由產(chǎn)生H2S的CSE調(diào)節(jié)氧化還原狀態(tài)。

在動物模型方面，研究發(fā)現(xiàn)H2S可以治療雌激素缺乏引起的骨量丟失，調(diào)節(jié)H2S水平可以調(diào)控雌激素刺激的成骨細(xì)胞和骨形成一種新的機(jī)制，并且調(diào)控H2S水平是治療絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的一種方法[10]。

對于H2S如何參與骨代謝，筆者總結(jié)認(rèn)為，H2S通過OPG/RANKL通路而影響成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的代謝。在成骨細(xì)胞方面，通過刺激破骨細(xì)胞成熟的過程中OPG/RANKL而發(fā)揮作用，RANKL與破骨細(xì)胞表面的RANK結(jié)合后激活NF-κB 和c-Fos、鈣調(diào)磷蛋白磷酸酶等促使破骨細(xì)胞成熟而促進(jìn)骨吸收，但OPG競爭性抑制RANKL與破骨細(xì)胞膜上的RANK 結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞前體的分化，誘導(dǎo)破骨細(xì)胞凋亡而抑制骨的吸收[11]。并且通過動物模型研究[12]證實(shí)，去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠股骨組織中OPG的表達(dá)明顯降低，相反，RANKL表達(dá)增加；外源性H2S供體NaHS(50、100 μmol/kg)上調(diào)大鼠股骨組織中OPG的表達(dá)，降低了RANKL的表達(dá)。

本研究團(tuán)隊(duì)持續(xù)在進(jìn)行H2S與骨代謝的進(jìn)一步研究。血清H2S濃度與腰椎高密度相關(guān)分析有顯著相關(guān)性，但與腰椎骨密度相關(guān)分析無顯著相關(guān)性。筆者將進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行相關(guān)研究，并且調(diào)查分析其他種族人群如我國新疆維吾爾族地區(qū)喜歡飲食含硫食物，能夠?yàn)槿梭w提供H2S，可能有緩解骨量減少的作用。通過觀察維吾爾族居民膳食有機(jī)硫攝入量對骨量的影響，明確H2S是否對人體骨量有保護(hù)作用。此外，CBS、CSE和MPST是人體內(nèi)H2S代謝的關(guān)鍵酶，可調(diào)節(jié)內(nèi)源性H2S水平，探討該3種酶的基因多態(tài)性與骨量的關(guān)系，可為骨質(zhì)疏松癥的易感性的生物學(xué)標(biāo)志物提供重要參考，同時為預(yù)防骨丟失提供新策略。