許永劼， 李程程， 朱金鳳， 朱麗英， 高 超， 代龍光， 錢 雯， 張競(jìng)之， 潘 衛(wèi)，3，李 興

糖尿病腦病(diabetic encephalopathy，DE)是糖尿病嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一，是由糖尿病代謝紊亂導(dǎo)致的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損壞，從而引起大腦神經(jīng)生理及結(jié)構(gòu)改變和認(rèn)知功能障礙的疾病[1]。目前，有關(guān)于糖尿病腦病動(dòng)物及細(xì)胞模型的報(bào)道少見(jiàn)，因此建立一種穩(wěn)定的糖尿病腦病的細(xì)胞模型具有重要意義。

現(xiàn)階段有研究認(rèn)為糖尿病腦病與海馬神經(jīng)元凋亡密切相關(guān)，高血糖能誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，從而加速細(xì)胞凋亡而導(dǎo)致血管內(nèi)皮受損[2]。細(xì)胞凋亡受到多種凋亡相關(guān)基因的調(diào)控，其中Bcl-2和Bax是細(xì)胞凋亡調(diào)控的重要因素，Bcl-2主要功能是抑制細(xì)胞凋亡作用，保護(hù)細(xì)胞；而B(niǎo)ax則起到促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，加速細(xì)胞凋亡[3]。本研究旨在建立一種高糖誘導(dǎo)的糖尿病腦病細(xì)胞模型，探討高糖對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的影響，為進(jìn)一步從細(xì)胞水平研究糖尿病腦病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料、試劑和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 取出生24 h以內(nèi)的SD新生鼠，體重約5～7 g(合格證號(hào)：SCXK(黔)2018-0001，由貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心供給) 試劑：神經(jīng)元專用Neurobasal-A培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、B-27神經(jīng)元營(yíng)養(yǎng)因子、0.25%胰蛋白酶0.25%胰蛋白酶(無(wú)EDTA)(美國(guó)Gibco公司、胎牛血清(上海臻諾生物科技有限公司)馬血清(美國(guó)Hyclone公司)、L-谷氨酰胺、CCK-8試劑盒(北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)細(xì)胞凋亡凋亡檢測(cè)試劑盒(凱基生物科技發(fā)展有限公司)、兔源β-actin單克隆抗體、兔源 Bcl-2單克隆抗體、兔源Bax單克隆抗體(購(gòu)自美國(guó)affinity公司)。

1.2 主要儀器 Thermo-3111型CO2培養(yǎng)箱、IMARK型酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-Rad公司)、倒置顯微鏡(日本Nikon公司)、Western blot垂直電泳儀、Western blot電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)、流式細(xì)胞儀(美國(guó) Beckman 公司)。

1.3 原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞 取出生24 h內(nèi)SD乳鼠的海馬組織，將海馬組織放在中低溫PBS，顯微鏡下利用眼科鑷快速分離海馬組織血管包膜，剪碎組織、移液器吹打混勻20次、離心850 r/min離心5 min、棄上清液后，加入0.125%胰蛋白酶消化，37 ℃培養(yǎng)箱消化15 min，每隔5 min輕輕搖晃，加入等體積的血清終止消化，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，制成神經(jīng)元單細(xì)胞懸液，種植于預(yù)先用L-多聚賴氨酸包被24h的6孔板和96孔板中(使用前PBS沖洗3次)，10 h后將種植培養(yǎng)基(83%DMEM培養(yǎng)基+1%L-谷氨酰胺+1%雙抗+10%馬血清+5%胎牛血清)棄去，PBS清洗3次，換成維持培養(yǎng)基(96%Neurobasal-A+2%B-27+1%L-谷氨酰胺+1%雙抗)培養(yǎng)，以后每3.5 d量換液一次。

1.4 NSE免疫組化純度鑒定 將細(xì)胞懸液以1～5×105個(gè)/ml的濃度接種到提前放置了細(xì)胞爬片(爬片經(jīng)過(guò)多聚賴氨酸處理)的6孔培養(yǎng)板中，海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至5 d，將培養(yǎng)板中細(xì)胞爬片取出，并用PBS沖洗3次，然后加入4%多聚甲醛固定30 min，再次使用PBS漂洗3次。全部操作按照NSE免疫組化染色試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行海。顯微鏡下觀察，隨機(jī)選取觀察視野，計(jì)數(shù)視野下100個(gè)細(xì)胞中海馬神經(jīng)元的數(shù)量，重復(fù)5次后，取觀察的平均值，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，為海馬神經(jīng)元細(xì)胞純度。

1.5 高糖濃度摸索 細(xì)胞培養(yǎng)至5 d，將海馬神經(jīng)元細(xì)胞隨機(jī)分為7組，分別是將細(xì)胞分為25 mmol/L組(對(duì)照組)；45 mmol/L-24 h組、45 mmol/L-48 h組、45 mmol/L-72 h組和60 mmol/L-24 h組、60 mmol/L-48 h組、60 mmol/L-72 h組。每組達(dá)到作用時(shí)間后，CCK-8法檢測(cè)各組海馬神經(jīng)元細(xì)胞活性，全部操作嚴(yán)格按照CCK-8試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。為減低試驗(yàn)誤差，每組平行做6孔，每孔加入10 μl的CCK-8溶液，37 ℃溫箱孵育1.5 h后，使用酶標(biāo)儀在規(guī)定波長(zhǎng)450 nm測(cè)定OD值。

1.6 高糖作用時(shí)間摸索 細(xì)胞培養(yǎng)5 d，將細(xì)胞分為25 mmol/L組(對(duì)照組)、45 mmol/L-24 h實(shí)驗(yàn)組、45 mmol/L-48 h實(shí)驗(yàn)組組、45 mmol/L-72 h實(shí)驗(yàn)組，達(dá)到作用時(shí)間后，提取細(xì)胞蛋白，吸取上清BCA法定量蛋白濃度。以含20 μg蛋白質(zhì)溶液為上樣量，經(jīng)12%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，通過(guò)濕轉(zhuǎn)法，將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂牛乳室溫下封閉2 h，加入兔抗β-actin(1∶5000) 、兔抗Bcl-2(1∶1000)、兔抗Bax(1∶1000)于4℃搖床孵育過(guò)夜，TBST緩沖液漂洗PVDF膜3次，每次10 min；分別加入HRP標(biāo)記的羊抗兔Ig G(1∶20000) 二抗室溫孵育2 h，TBST緩沖液漂洗PVDF膜3次，每次10 min；采用ECL法發(fā)光顯示，現(xiàn)配顯色工作液，采用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行圖像收集，使用ImageJ軟件對(duì)條帶灰度值進(jìn)行分析比較，計(jì)算先對(duì)表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)至5 d分為25 mmol/L組和最適高糖組(45 mmol/L-48h)組，達(dá)到作用時(shí)間后，棄培養(yǎng)基，PBS清洗3遍，每次1 min，加入適量0.125%胰蛋白酶(不含EDTA)后，放置在37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞20 min，每隔5 min輕輕搖晃一下，加速細(xì)胞脫落。顯微鏡下觀察消化效果，細(xì)胞脫落70%左右，加入適量胎牛血清終止消化。采用用低速離心機(jī)1000 r/min離心5 min，收集消化后脫落細(xì)胞，細(xì)胞計(jì)數(shù)后，以5×104的濃度為一個(gè)標(biāo)本上樣量，按照操作說(shuō)明書(shū)，加入500 μl結(jié)合液重懸神經(jīng)元細(xì)胞，依次加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl碘化丙啶，輕輕混勻，所有操作均避光進(jìn)行，室溫下避光孵育10 min，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)收集整理后用，采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，當(dāng)P<0.05說(shuō)明檢測(cè)結(jié)果的顯著性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng) 海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)變化：細(xì)胞種植于培養(yǎng)板1 d后，細(xì)胞呈小圓形，透亮且散在分布均勻，邊緣有光暈(見(jiàn)圖1)；種植3 d后，細(xì)胞基本貼壁成功，部分神經(jīng)元細(xì)胞長(zhǎng)出突觸(見(jiàn)圖2)；生長(zhǎng)至5 d，細(xì)胞胞體進(jìn)一步長(zhǎng)大，成圓形或者椎體形，突觸生長(zhǎng)迅速，形成稀疏的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖3)；生長(zhǎng)至7 d，細(xì)胞胞體飽滿，細(xì)胞表明光暈明顯，形成密集的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞有聚集生長(zhǎng)現(xiàn)象(見(jiàn)圖4)。

2.2 原代海馬神經(jīng)元純度鑒定 NSE免疫組織化學(xué)染色后，光學(xué)顯微鏡下觀察爬片中細(xì)胞形態(tài)完整，細(xì)胞分布均勻，可見(jiàn)清晰的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其中細(xì)胞胞體和大部分突觸為黃棕色顆粒，為陽(yáng)性細(xì)胞即海馬神經(jīng)元(見(jiàn)圖5)，經(jīng)觀察計(jì)數(shù)后計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，本實(shí)驗(yàn)神經(jīng)元純度可達(dá)85%以上，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，生長(zhǎng)密度適宜，可進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖1 神經(jīng)元生長(zhǎng)1 d后(×200)

圖2 神經(jīng)元生長(zhǎng)3 d后(×200)

圖3 神經(jīng)元生長(zhǎng)5 d后(×200)

圖4 神經(jīng)元生長(zhǎng)7 d后(×200)

圖5 NSE染色后的海馬神經(jīng)元(×200)

2.3 高糖濃度的確定 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞活性結(jié)果(見(jiàn)表1)，45 mmol/L組作用24 h、48 h、72 h后，細(xì)胞平均存活率均在80%以上，而60 mmol/L組作用24 h、48 h、72 h后，細(xì)胞活性全部低于80%。根據(jù)美國(guó)藥典細(xì)胞毒性分級(jí)[4]，細(xì)胞存活率≥80%屬于1級(jí)細(xì)胞，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，即本研究高糖濃度確定為45 mmol/L。

2.4 高糖作用時(shí)間的確定 Bcl-2和Bax是經(jīng)典凋亡相關(guān)蛋白，與細(xì)胞凋亡情況密切相關(guān)。Western blot結(jié)果顯示，隨著糖濃度的升高，與對(duì)照組相比，45 mmol/L-24組、45 mmol/L-48 h組、45 mmol/L-72 h組中海馬神經(jīng)元內(nèi)均Bcl-2表達(dá)下降、Bax表達(dá)上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)(見(jiàn)圖6)；與45 mmol/L-24 h組比較，Bcl-2在45 mmol/L-48 h組和45 mmol/L-72 h組下降明顯(P<0.05)，但45 mmol/L-48 h組和45 mmol/L-72 h組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)與45 mmol/L-24 h組比較，Bax在45 mmol/L-48 h組和45 mmol/L-72 h組升高明顯(P<0.01)，但45 mmol/L-48 h組和45 mmol/L-72 h組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果顯示，高糖作用時(shí)間為48h為最適時(shí)間，為后續(xù)試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。

與對(duì)照組比較**P<0.01；##P<0.01

2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組海馬神經(jīng)細(xì)胞的凋亡情況。Flow Cytometry結(jié)果顯示，對(duì)照組海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡率為2.1%±0.3%，高糖作用48h后細(xì)胞凋亡率為12.5%±0.5%。與對(duì)照組對(duì)比，高糖組海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.01)(見(jiàn)圖7)。

與對(duì)照組比較**P<0.01

表1 45 mmol/L和60 mmol/L組細(xì)胞平均存活率(%)及細(xì)胞毒性分級(jí)(n=5)

3 討 論

糖尿病腦病患者臨床表現(xiàn)為輕、中度的認(rèn)知功能障礙，學(xué)習(xí)和記憶能力下降，語(yǔ)言理解等能力降低，且與各種神經(jīng)退行性疾病均有密切聯(lián)系?，F(xiàn)研究認(rèn)為高血糖引起機(jī)體代謝紊亂，繼發(fā)導(dǎo)致大腦海馬區(qū)結(jié)構(gòu)功能異常，如突觸可塑性改變和神經(jīng)遞質(zhì)釋放受到影響，最終導(dǎo)致機(jī)體認(rèn)知功能障礙[5]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)糖尿病腦病模型構(gòu)建仍處在探索階段，無(wú)論是動(dòng)物水平還是細(xì)胞水平均缺少有效的途徑，而越來(lái)越多的糖尿病患者后期出現(xiàn)認(rèn)知功能障礙，最終發(fā)展為糖尿病腦病[6]。因此，建立一種穩(wěn)定的糖尿病腦病的模型具有重要意義。

海馬體(Hippocampus)，又名海馬回，是大腦學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵部位。臨床研究數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病與認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)，2型糖尿病患者海馬體積減少，而海馬區(qū)是最先受糖尿病影響的腦區(qū)[7]。因此，本研究選擇海馬神經(jīng)元為研究對(duì)象，探討高糖作用時(shí)間和濃度對(duì)海馬神經(jīng)元的影響。本研究成功培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元，經(jīng)NSE免疫組織化學(xué)染色鑒定純度達(dá)85%以上，達(dá)到后續(xù)試驗(yàn)要求。研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞具有較高代謝率，在大量體外培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)25 mmol/L基礎(chǔ)糖濃度是維持神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育及突觸生長(zhǎng)最適濃度[8]。本研究根據(jù)海馬神經(jīng)元高糖模型的研究[9，10]及張貝貝等認(rèn)為高糖環(huán)境會(huì)引發(fā)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax水平變化[11]，探討在不同糖濃度和作用時(shí)間下培養(yǎng)海馬神經(jīng)元細(xì)胞，以觀察隨著糖濃度的增加是否對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)有影響，從而獲得最適的糖作用時(shí)間。還有研究[12]發(fā)現(xiàn)，海馬神經(jīng)元在糖濃度達(dá)50 mmol/L培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞中突觸相關(guān)蛋白SNAP-25、synaptotagmin-1和VGluT-1外表達(dá)顯著降低，從而導(dǎo)致某些蛋白質(zhì)在突觸中運(yùn)輸情況受到影響，最終影響神經(jīng)元細(xì)胞活性。本研究運(yùn)用45 mmol/L糖濃度培養(yǎng)海馬神經(jīng)元，海馬神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)受到一定程度影響，細(xì)胞形態(tài)較完整，胞體較飽滿，光暈比較明顯。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示神經(jīng)元細(xì)胞存活率均在80%以上。而經(jīng)過(guò)45 mmol/L糖濃度作用48 h可引起神經(jīng)元內(nèi)Bcl-2和Bax表達(dá)水平較25 mmol/L組顯著變化，但隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，45 mmol/L-48 h組和45 mmol/L-72 h組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此最終確定45 mmol/L糖濃度培養(yǎng)48h為最適糖濃度和作用時(shí)間。

現(xiàn)階段基于神經(jīng)元細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)研究糖尿病腦病的發(fā)病機(jī)制成為當(dāng)前主流。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞的程序性死亡，受到多種因素的調(diào)控，如環(huán)境、基因、凋亡相關(guān)蛋白等。在正常大鼠海馬區(qū)內(nèi)，Bc1-2扮演著抑制細(xì)胞凋亡的角色，保護(hù)細(xì)胞存活，當(dāng)Bc1-2與Bax維持?jǐn)?shù)量上的平衡，機(jī)體的凋亡水平處于正常階段；當(dāng)機(jī)體受到某些因素的刺激后，Bax發(fā)揮作用，介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生，由此可見(jiàn)Bc1-2與Bax水平的動(dòng)態(tài)平衡是維持機(jī)體凋亡的重要因素[13]。Lei等[14]研究發(fā)現(xiàn)大黃素可減輕高糖誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞凋亡情況，通過(guò)增加Bax/Bcl-2比率，減低caspase-3和caspase-9的表達(dá)達(dá)到保護(hù)PC-12細(xì)胞的作用，降低細(xì)胞凋亡水平。閆斌等[15]發(fā)現(xiàn)槲皮素能夠減輕高糖誘導(dǎo)下海馬神經(jīng)元的凋亡情況，其作用機(jī)制是增加p-Akt蛋白的表達(dá)，進(jìn)而增加Bcl-2蛋白的表達(dá)，抑制Bax蛋白的表達(dá)。本研究與閆斌等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，隨著糖濃度的增加，海馬神經(jīng)元內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax表達(dá)水平發(fā)生變化，其中Bcl-2表達(dá)下降而B(niǎo)ax表達(dá)上升。在確定最適高糖濃度和作用時(shí)間后，我們運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)高糖組的凋亡情況，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組相比，海馬神經(jīng)元的細(xì)胞凋亡率顯著上升。結(jié)合凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的變化情況，我們推測(cè)，高糖引起海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡增加可能是通過(guò)改變凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，但具體的作用機(jī)制仍需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究成功構(gòu)建一種高糖誘導(dǎo)糖尿病腦病細(xì)胞模型，為后續(xù)的研究提供幫助；并且發(fā)現(xiàn)高糖會(huì)導(dǎo)致海馬神經(jīng)元細(xì)胞凋亡率升高，其原因可能與凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)改變有關(guān)。