梁曉婷， 張丹丹， 梁文昭， 邵延坤， 閆亞韻

阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種慢性進(jìn)展性中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病。隨著人口老齡化的日益嚴(yán)重，患病率也隨之增加，成為威脅人類健康的重大殺手，是嚴(yán)重的社會和醫(yī)療問題[1，2]。目前認(rèn)為β淀粉樣蛋白(β-Amyloid，Aβ)異常沉積可能是誘發(fā)AD形成的關(guān)鍵因素。其中，Aβ42較Aβ40疏水性強(qiáng)，有更強(qiáng)的毒性及自我聚集活性，易形成不可溶的Aβ纖維體導(dǎo)致老年斑形成。早老素1(Presenilin1，PS1)為淀粉樣前體蛋白APP分解為Aβ的關(guān)鍵酶γ分泌酶的主要成分。自噬在AD等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、進(jìn)展過程中起著核心作用。目前認(rèn)為纖維狀A(yù)β毒性不如可溶性Aβ寡聚體，可溶性Aβ寡聚體是產(chǎn)生神經(jīng)毒性作用的重要來源。但體內(nèi)獲得可溶性Aβ很難，使其在體內(nèi)聚集環(huán)境很難實(shí)現(xiàn)。所以，本研究通過Aβ寡聚體構(gòu)建體外AD模型，探討Aβ寡聚體對于細(xì)胞活力、凋亡、Aβ42及PS1表達(dá)、自噬等方面的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑及儀器 未分化的半懸浮PC12細(xì)胞購自北京中國科學(xué)院細(xì)胞庫；Aβ42單體、Aβ40單體購自Anaspec；CCK-8試劑盒購自東仁化學(xué)科技有限公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒購自Bioteke；caspase-3、Beclin 1、PS1 antibody購自Anaspec；羊抗鼠IgG-HRP購自MILLIPORE。電泳儀、轉(zhuǎn)移槽為BIORAD；酶標(biāo)儀(BIOTEK)。

1.2 方 法

1.2.1 Aβ寡聚體的制備及CD譜分析 將Aβ40及Aβ42單體各取5 mg分別放入EP管中，各加入1.1 ml HFIP，該步在冰上進(jìn)行，蓋上離心管蓋60 min使Aβ40和Aβ42充分溶解。分裝每管100 μl，室溫使在冰上預(yù)冷的HFIP揮發(fā)，將干燥的肽膜存于-80 ℃冰箱。使用時(shí)肽膜放在冰上，每管在超凈臺中加DMSO充分溶解，使終濃度為5 mmol/L，吹打混勻，加無酚紅的DMEM培養(yǎng)基，盡量不要超過100 μmol/L。4 ℃孵育24 h，離心取上清液，放入-80 ℃冰箱。取制備的Aβ寡聚體，委托中科院大分子國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行CD譜分析。

1.2.2 Aβ42與Aβ40混合物寡聚體的制備 將Aβ40及Aβ42單體各取5 mg分別放入EP管中，各加入1.1 ml HFIP，該步在冰上進(jìn)行，蓋上離心管蓋60 min使Aβ40和Aβ42充分溶解。分裝每管100 μl，按摩爾量比例為1∶9，3∶7，4∶6，1∶0，4∶0，10∶0將Aβ42與Aβ40混合到新的EP管中，保證終濃度為1 mmol/L。室溫使在冰上預(yù)冷的HFIP揮發(fā)，將干燥的肽膜存于-80 ℃冰箱。使用時(shí)肽膜放在冰上，每管在超凈臺中加DMSO充分溶解，使終濃度為5 mmol/L，吹打混勻，加無酚紅的DMEM培養(yǎng)基，盡量不要超過100 μmol/L。4 ℃孵育24 h，離心取上清液，放入-80 ℃冰箱。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及Aβ?lián)p傷PC12細(xì)胞AD模型制備 將未分化的半懸浮PC12細(xì)胞加入含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育，按1∶4～1∶3進(jìn)行細(xì)胞傳代，第10～30代的分化細(xì)胞，以2×104密度接種到6孔板中，用于AD模型的制備，將1.2.2中制備的濃度為100 μmol/LAβ混合物寡聚體加到培養(yǎng)基中，37 ℃孵育24 h后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 CCK-8檢測 生長良好的PC12細(xì)胞每孔8000～10000個(gè)接種于96孔板上，長滿后加不含血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，24 h后加入10 μmol/L 的Aβ混合物寡聚體，作用24 h后棄上清液，每孔加入200 μl培養(yǎng)基及20 μl CCK-8試劑避光孵育，酶標(biāo)儀測定1 h后450 nm處OD值，重復(fù)3次。

1.2.5 ELISA法檢測Aβ?lián)p傷PC12細(xì)胞Aβ42的表達(dá) Aβ寡聚體損傷后的PC12細(xì)胞經(jīng)細(xì)胞裂解液RIPA裂解、離心后取上清移入新的EP管，制備總蛋白。用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)雙抗夾心法檢測Aβ42的表達(dá)，具體方法按說明書。

1.2.6 Western blot 檢測Aβ?lián)p傷PC12細(xì)胞caspase-3、PS1、Beclin 1的表達(dá) 同1.2.5制備總蛋白，BCA法測蛋白濃度、 SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂奶粉封閉，一抗稀釋比例1∶1000，孵育 4 ℃ 過夜，二抗(羊抗小鼠IgG-HRP)稀釋比例1∶2000，37 ℃孵育1 h。在暗室曝光顯影。用Image J 圖像處理軟件分析目標(biāo)條帶的光密度，求目的蛋白與內(nèi)參蛋白灰度值的比值。

1.2.7 免疫組化檢測Aβ?lián)p傷PC12細(xì)胞PS1表達(dá) 血清封閉，一抗(PS1 antibody)稀釋比例1∶200，4 ℃過夜孵育，二抗(羊抗小鼠IgG-HRP)孵育，37 ℃，DAB染色，封片劑封片，顯微鏡下觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 SPSS17.0統(tǒng)計(jì)，各組數(shù)據(jù)間進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，當(dāng)P<0.05時(shí)，認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Aβ42 CD譜分析 用圓二色譜儀對各點(diǎn)聚合的Aβ42分析，用在線軟件計(jì)算α-螺旋、β折疊、無規(guī)卷曲的含量，發(fā)現(xiàn)3 h和12 h二級結(jié)構(gòu)幾乎無改變，24 h二級結(jié)構(gòu)β折疊升高，48h其β折疊降低。提示Aβ42寡聚體聚合24h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的意義較大。

2.2 CCK-8檢測Aβ?lián)p傷PC12細(xì)胞活力 Aβ寡聚體混合物總量相同時(shí)，Aβ42/Aβ40不同比例損傷PC12細(xì)胞時(shí)，比值微小變化(3 μmol/L∶7 μmol/L到4 μmol/L∶6 μmol/L)時(shí)，PC12細(xì)胞活力增加(a：P<0.05)，但Aβ42的含量為10 μmol/L，PC12細(xì)胞的活力表現(xiàn)為下降(b：P<0.05)，說明在一定濃度范圍內(nèi)Aβ寡聚體可以使PC12細(xì)胞活力增強(qiáng)，并且與Aβ42的含量相關(guān)，超過一定范圍后活力下降。Aβ42蛋白的含量相同時(shí)，Aβ42蛋白的濃度增加(1 μmol/L～4 μmol/L)時(shí)，PC12細(xì)胞的活力增加(c：P<0.05)，且具有劑量依賴性(見圖1)。

2.3 Aβ?lián)p傷PC12細(xì)胞Caspase 3表達(dá) Aβ寡聚體總量相同時(shí)，4∶6組，與1∶9組、3∶7組相比，caspase-3的表達(dá)增多，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(a：P<0.05)，Aβ寡聚體中Aβ42含量相同時(shí)，Caspase 3表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(b：P<0.05，c：P<0.05)，Aβ42/Aβ40比值為4∶0(4 μmol/L∶0 μmol/L)組比1∶0(1 μmol/L∶0 μmol/L)組caspase-3表達(dá)增加，有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(d：P<0.05)。說明Aβ寡聚體損傷PC12細(xì)胞引起細(xì)胞凋亡，Aβ42比例越大，凋亡越明顯，且具有劑量依賴性，Aβ40可以減輕Aβ42引起的細(xì)胞凋亡，對細(xì)胞起保護(hù)作用。綜上，通過不同比例Aβ42/Aβ40混合物寡聚體損傷PC12細(xì)胞，能夠在體外模擬AD的病理過程，成功建立了PC12細(xì)胞AD模型(見圖2)。

(A)a示與1∶0組相比，P<0.05，b示與4∶0組相比，P<0.05。(B)Pure示只有Aβ42，Mix示Aβ42與Aβ40混合物，a示與Mix組相比，P<0.05，b示與Mix組相比，P<0.05，c示與1∶0組相比，P<0.05。(C)a示與1∶0組相比，P<0.05，b示與4∶0組相比，P<0.01

(A)β-actin為內(nèi)參；(B)a示與1∶9組相比，P<0.05，b示與1∶9組相比，P<0.05，c示與4∶6組相比，P<0.05，d示與1∶0組相比，P<0.05

2.4 Aβ?lián)p傷PC12細(xì)胞Aβ42的表達(dá) ELISA法檢測示在一定濃度范圍內(nèi)，Aβ寡聚體混合物總量相同時(shí)，Aβ42/Aβ40不同比例損傷PC12細(xì)胞時(shí)，當(dāng)比值微小變化時(shí)，Aβ42的表達(dá)量顯著且比值越大，Aβ42表達(dá)量越高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(b：P<0.05)。說明Aβ寡聚體混合物損傷PC12細(xì)胞Aβ42的聚集與Aβ寡聚體混合物中Aβ42的比例顯著相關(guān)。單純的Aβ42寡聚體與Aβ42與Aβ40混合物對比，當(dāng)兩者Aβ42含量相同，單純的Aβ42寡聚體引起Aβ42表達(dá)增加，且具有劑量依賴性(c：P<0.01)，說明Aβ40可以減少Aβ42的表達(dá)，對細(xì)胞有保護(hù)作用(見圖3)。

(A)a示與1∶9組相比P<0.05，b示與3∶7組相比P<0.05，c示與4∶6組相比P<0.01。(B)a示與1∶9組相比P<0.05，b示與4∶6組相比P<0.05，c示與1∶0組相比，P<0.01

2.5 Aβ?lián)p傷PC12細(xì)胞PS1的表達(dá) Western blot檢測結(jié)果示：Aβ寡聚體總量相同時(shí)，PS1的表達(dá)差異不明顯，Aβ42/Aβ40比例為10∶0時(shí)與4∶6(4 μmol/L：6 μmol/L)組，PS1的表達(dá)并不增加，但4∶6組與1∶9組、3∶7組相比，PS1的表達(dá)增多，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(a：P<0.05，b：P<0.05)，表明AD的發(fā)病過中，Aβ40含量在一定程度的減少可激活PS1的表達(dá)。單純的Aβ42寡聚體與Aβ42與Aβ40混合物對比，當(dāng)兩者Aβ42含量相同，PS1的表達(dá)差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(b：P>0.05)(見圖4)。

2.6 Aβ?lián)p傷PC12細(xì)胞Beclin 1的表達(dá) Aβ混合物寡聚體中Aβ42/Aβ40比例變化時(shí)，Aβ42/Aβ40值4∶6(4 μmol/L∶6 μmol/L)組、4：0組比1∶9組Beclin 1的表達(dá)增加；Aβ42含量相同時(shí)，Aβ42/Aβ40從1∶9(1 μmol/L∶9 μmol/L)到1∶0、從4∶6到4∶0，Beclin 1的表達(dá)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(a：P<0.05，b：P<0.01)，說明Aβ42可以激活自噬，且自噬的強(qiáng)弱與Aβ42在寡聚體中的含量相關(guān)，具有劑量依賴性(e：P<0.05)。當(dāng)Aβ42/Aβ40的比值為10∶0(10 μmol/L∶0 μmol/L)，Beclin 1的表達(dá)明顯降低，自噬受到抑制，說明Aβ42對細(xì)胞自噬的激活在一定的濃度范圍內(nèi)有效，當(dāng)濃度過大時(shí)，細(xì)胞自噬減弱，引起細(xì)胞損傷(見圖5)。

(B)a示與1∶9組相比，P<0.05，b示與3∶7組相比，P<0.05。(C)a示與1∶9組相比，P<0.05，b示與1∶0組相比，P>0.05，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

(A)β-actin為內(nèi)參；(B)a示與1∶9組相比，P<0.05，b示與4∶6組相比，P<0.01，c示與1∶0組相比，P<0.05，d示4∶0組相比，P<0.01，e示于1∶0組相比，P<0.05

3 討 論

Aβ蛋白是由淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)裂解產(chǎn)生的，不同個(gè)體內(nèi)有不同的Aβ蛋白的譜系，表現(xiàn)為Aβ1～43、Aβ1～42和Aβ1-40不同比例的混合。正常人體內(nèi)大約90%為Aβ40，只有少數(shù)為Aβ1～43、Aβ1～42。盡管這些β淀粉樣蛋白只有幾個(gè)氨基酸的差異，但功能卻相差很遠(yuǎn)。Schellenberg等[3]于1992 年首次發(fā)現(xiàn)PS-1 基因與家族性AD發(fā)病有關(guān)，PS1屬于進(jìn)化過程中非常保守的蛋白質(zhì)，主要表達(dá)于大腦新皮質(zhì)、海馬。PS1在生物體中有重要作用，在APP及Notch1蛋白的水解過程中扮演著重要角色。目前認(rèn)為，PS1參與形成γ分泌酶復(fù)合物來調(diào)節(jié)Aβ的生成。γ分泌酶復(fù)合物由PS、Nicastrin、APH1和PEN2構(gòu)成，PS1是γ分泌酶復(fù)合物的活性中心。自噬能清除受損細(xì)胞器及異常折疊的蛋白質(zhì)，目前研究認(rèn)為自噬是可以減輕神經(jīng)毒性及清除神經(jīng)元內(nèi)異常沉積的Aβ的潛在治療靶點(diǎn)。自噬囊泡在AD小鼠腦中大量積聚可使軸突受損[4]。Beclin 1是細(xì)胞自噬的關(guān)鍵調(diào)控因子，與配體結(jié)合，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)自噬的活性[5]。

為成功建立Aβ?lián)p傷的PC12細(xì)胞AD細(xì)胞模型，Aβ標(biāo)本中β片層結(jié)構(gòu)的含量為制備的關(guān)鍵因素。因?yàn)樯頎顟B(tài)下Aβ是可溶性的α螺旋結(jié)構(gòu)，病理狀態(tài)下Aβ為容易形成纖維狀或沉積的β片層結(jié)構(gòu)。在病理狀態(tài)下Aβ自發(fā)快速形成β片層結(jié)構(gòu)，進(jìn)而形成纖維、沉積發(fā)揮毒性。Aβ寡聚體比纖維狀的Aβ毒性更強(qiáng)，且其毒性依賴于形成β片層結(jié)構(gòu)的能力[6，7]。本研究應(yīng)用體外制備的Aβ寡聚體損傷PC12細(xì)胞，同時(shí)檢測Aβ寡聚體聚合不同時(shí)間點(diǎn)β片層結(jié)構(gòu)的含量，研究結(jié)果顯示Aβ寡聚體聚合24 h含量最高，故選用聚合24 h的Aβ寡聚體制備AD模型。用CCK-8檢測細(xì)胞活力、Western blot測凋亡相關(guān)蛋白caspase-3表達(dá)鑒定PC12細(xì)胞AD模型，通過不同Aβ42寡聚體與Aβ40寡聚體的混合物比例損傷PC12細(xì)胞，說明在一定的濃度范圍內(nèi)(本研究為10 μmol/L)，細(xì)胞凋亡率小，細(xì)胞的活力增加，研究此階段的病理及機(jī)制可為AD的治療及預(yù)防提供新的靶點(diǎn)。

目前的研究[8，9]結(jié)果顯示，PS1基因突變可因?yàn)楦淖兞甩?分泌酶對APP的剪切位點(diǎn)，使纖維原性較強(qiáng)、易聚集、神經(jīng)毒性大的Aβ42生成增多從而引發(fā)AD。但Aβ?lián)p傷細(xì)胞后是否影響PS1功能目前少有研究。本研究通過Aβ寡聚體的混合物損傷PC12細(xì)胞，觀察Aβ對PS1產(chǎn)生的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：Aβ42/Aβ40比例為4∶6(4 μmol/L∶6 μmol/L)時(shí)與1∶9、3∶7比，Aβ42的表達(dá)增加，PS1表達(dá)的增加遠(yuǎn)小于Aβ42的增加，當(dāng)Aβ42/Aβ40比值由4∶0(4 μmol/L∶0 μmol/L)到10∶0(10 μmol/L∶0 μmol/L)時(shí)，Aβ42表達(dá)顯著增加，而PS1的表達(dá)基本無變化。說明在AD的發(fā)病中，Aβ40含量在一定程度的減少可激活PS1的表達(dá)，Aβ42含量的增加可明顯增加Aβ42的表達(dá)，并且具有劑量依賴性，但Aβ42含量增加時(shí)PS1表達(dá)沒有顯著變化。研究結(jié)果提示，Aβ42/Aβ40比值增加時(shí)，可能會引起PS1結(jié)構(gòu)與功能的改變。單粒子電子顯微鏡及FLIM證實(shí)γ分泌酶的成熟體有不同的構(gòu)象位點(diǎn)[10～12]，在PS1突變的轉(zhuǎn)基因小鼠中發(fā)現(xiàn)，PS1與γ分泌酶上緊密結(jié)合的區(qū)域，可協(xié)助長鏈的Aβ肽段的產(chǎn)生[13]，因此把這個(gè)位點(diǎn)稱為“closed”，化合物可通過調(diào)節(jié)PS1向“open”位點(diǎn)發(fā)生構(gòu)象變化就能產(chǎn)生低分子量的Aβ肽段[11，14]。Aβ42含量的增高能夠激發(fā)PS1向病理位點(diǎn)的構(gòu)象變化，這一過程通過細(xì)胞內(nèi)的鈣超載實(shí)現(xiàn)[15]，Aβ42含量的增高引起PS1的改變機(jī)制可能與細(xì)胞內(nèi)Aβ42引起的鈣超載導(dǎo)致細(xì)胞損傷相關(guān)[16]。氧化應(yīng)激及胞內(nèi)Ca2+的增加可使PC12細(xì)胞功能異常的PS1表達(dá)增加[17]。另有證據(jù)證明：PS可調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的穩(wěn)態(tài)，且不依賴γ-分泌酶的活性[18]。最近的研究做出推斷鈣超載可能為AD病理生理過程惡化的罪魁禍?zhǔn)譡19～21]。

綜上，本研究成功模擬了體外AD的病理過程，構(gòu)建AD早期的細(xì)胞模型。并檢測了Aβ?lián)p傷PC12細(xì)胞Beclin 1的表達(dá)，結(jié)果說明AD的早期階段一定的濃度范圍內(nèi)Aβ42激活細(xì)胞自噬，當(dāng)濃度過大時(shí)，細(xì)胞自噬減弱，引起細(xì)胞損傷，因此可將此階段的病理過程作為治療及預(yù)防的靶點(diǎn)。Aβ寡聚體不改變細(xì)胞內(nèi)PS1的含量，可能是通過改變PS1的結(jié)構(gòu)和功能引起Aβ沉積，但Aβ的毒性及機(jī)制仍不十分清楚，有待進(jìn)一步探討。