周才芳 曾秀琴 曾慶義

糖尿病腎病是常見的糖尿病微血管并發(fā)癥，其是誘導終末期腎病發(fā)生的主要原因之一，腎小管上皮細胞具有調(diào)節(jié)水電解質(zhì)平衡、分泌等作用，腎小管上皮細胞損傷是終末期腎病發(fā)生的重要病理變化[1-2]。研究顯示，高糖可以誘導腎小管上皮細胞凋亡和氧化損傷，這可能是糖尿病腎病腎組織損傷發(fā)生的機制之一[3]。血小板反應蛋白1（thrombospondin1，TSP1）是一種與細胞凋亡、血管生成和細胞黏附等有關的多功能蛋白質(zhì)，其在人體的腦組織、血管、肺臟和心臟等組織中廣泛表達，在機體受到氧化應激以后，其在成纖維細胞、巨噬細胞和血管平滑肌細胞等多種細胞中高表達，TSP1參與腫瘤、衰老和免疫等相關疾病的發(fā)生[4-5]。目前的研究已經(jīng)顯示，TSP1在糖尿病腎病組織中高表達，TSP1表達水平與腎組織腎小管上皮細胞凋亡呈正相關[6-7]。本研究以腎小管上皮細胞為研究對象，通過慢病毒轉(zhuǎn)染TSP-1 shRNA（shTSP-1），沉默TSP-1基因；以轉(zhuǎn)染慢病毒為對照，探討下調(diào)TSP1對高糖條件下腎小管上皮細胞損傷的影響，為研究糖尿病腎病腎小管組織損傷提供參考。

材料與方法

一、材料

腎小管上皮細胞HK-2購自中國科學院上海細胞資源中心；SYBR Premix Ex Taq Realtime PCR試劑盒、PrimeScript RT reagent Kit購自大連Takara公司；TSP1抗體購自美國BioVision公司；TSP1 shRNA慢病毒和對照慢病毒購自上海吉凱基因化學技術有限公司；引物由金斯瑞生物科技有限公司構(gòu)建；腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細胞介素 -8（interleukin-8，IL-8）含量檢測試劑盒購自南京建成生物研究所；丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；活性氧（reactive oxygen species，ROS）含量檢測試劑盒購自美國Abnova公司；活化的Caspase-3（c-caspase-3）抗體購自美國Santa Cruz Biotech公司；Polybrene購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

二、方法

1.細胞轉(zhuǎn)染和分組：（1）對照組：腎小管上皮細胞，以5.6 mmol/L的葡萄糖細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)。（2）高糖組：腎小管上皮細胞，以含有30 mmol/L的葡萄糖細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)；（3）NC＋高糖組：轉(zhuǎn)染方法同干擾＋高糖組，只是將轉(zhuǎn)染的TSP1 shRNA慢病毒換成對照慢病毒。（4）干擾＋高糖組：腎小管上皮細胞接種到24孔板內(nèi)，放在37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，在倒置顯微鏡下觀察細胞密度為50%時，把TSP1 shRNA慢病毒用含有10%胎牛血清的DMEM稀釋，分別添加至24孔板內(nèi)，感染復數(shù)調(diào)整為10，同時在孔內(nèi)添加 5 μg/ml的 Polybrene，繼續(xù)培養(yǎng)12 h，將原培養(yǎng)液吸棄后，添加新鮮的細胞培養(yǎng)液（含有10%胎牛血清的DMEM），繼續(xù)培養(yǎng)3 d。用嘌呤霉素篩選10 d，取穩(wěn)定感染TSP1 shRNA慢病毒的腎小管上皮細胞，用30 mmol/L的葡萄糖細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)，用于后續(xù)實驗。

2.高糖處理后腎小管上皮細胞中TSP1表達檢測：細胞培養(yǎng)48 h以后，用Realtime PCR和Western Blot檢測細胞中 TSP1表達水平。（1）Realtime PCR：高糖組和對照組細胞分別用PBS洗滌細胞，按每 10 cm2細胞加 1 ml的 TRIZOL，用 200 μl氯仿將RNA抽提以后，分別添加500 μl的異丙醇溶液沉淀RNA，75%乙醇溶液洗滌，紫外分光光度計檢測OD 260 nm/OD 280 nm的比值（介于1.8 ～ 2.0之間）。取適量的RNA，按照PrimeScript RT reagent Kit進行反轉(zhuǎn)錄，合成的cDNA保存在-80℃。用SYBR Premix Ex Taq進行Realtime，PCR程序為：90℃，30 s；（95℃，5 s；60℃，30 s）×40個循環(huán)。按照2-△△CT方法計算分析TSP1的表達。GAPDH引物 Sense：5，-TGGGTGTGAACCACGAGAA-3'，Antisense：5，-GGCATGGACTGTGGTCATGA-3'。TSP1 引物 Sense：5，-GGCCACTGCAGCTGATGCGATGC GTAA-3'，Antisense：5，-GGACACAACGACTGGC TTCTGGAC-3'。（2）Western Blot：高糖組和對照組細胞分別用PBS洗滌2次，加入蛋白裂解液，于冰上裂解 30 min以后，4 ℃高速，12 000×g離心10 min，各組蛋白存在于上清液中。按照BCA法分別對蛋白定量檢測以后，于-80℃保存。把蛋白樣品與等體積的上樣緩沖液混合，100 ℃煮沸反應5 min。依照每孔中的上樣量為30 μg進行電泳，設置濃縮膠中電壓為80 V，設置分離膠中電壓為120 V，電泳總時長為2.5 h。在4 ℃條件下，以100 V電泳進行轉(zhuǎn)膜，把存在于凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜在5 %牛血清白蛋白中37 ℃孵育結(jié)合2 h。PVDF膜置1 : 800稀釋的TSP1抗體反應液中，于4 ℃過夜，再放置于1 : 3 000稀釋的二抗中，37 ℃反應1.5 h。按照ECL發(fā)光試劑盒發(fā)光以后，GAPDH作為內(nèi)參，對TSP1蛋白進行定量分析。

3.細胞中ROS水平檢測：對照組、高糖組、NC＋高糖組、干擾＋高糖組細胞培養(yǎng)48 h以后，收集細胞，用DCFH-DA法檢測細胞中ROS水平，步驟同試劑盒說明書，以激發(fā)波長為488 nm和發(fā)射波長為525 nm的熒光分光光度計檢測熒光強度，用熒光強度表示ROS表達水平。

4.細胞培養(yǎng)液中MDA含量檢測：對照組、高糖組、NC＋高糖組、干擾＋高糖組細胞培養(yǎng)48 h以后，收集細胞培養(yǎng)液上清，用硫代巴比妥酸法檢測培養(yǎng)液中MDA含量，步驟同試劑盒說明書。

5.細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-8含量檢測：對照組、高糖組、NC＋高糖組、干擾＋高糖組細胞培養(yǎng)48 h以后，收集細胞培養(yǎng)液上清，用ELISA法檢測培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-8含量，步驟同試劑盒說明書。

6.細胞凋亡檢測：對照組、高糖組、NC＋高糖組、干擾＋高糖組細胞培養(yǎng)48 h以后，收集細胞，分別用300 μl的緩沖液將各組細胞懸浮以后，依次添加 Annexin V-FITC和PI工作液各 5 μl，置于流式細胞儀上檢測凋亡情況，在檢測前每組再添加200 μl的結(jié)合緩沖液。

7.細胞中c-caspase-3蛋白表達水平檢測：對照組、高糖組、NC＋高糖組、干擾＋高糖組細胞培養(yǎng)48 h以后，收集細胞，用Western Blot方法檢測細胞中c-caspase-3蛋白表達水平，步驟同上。

三、統(tǒng)計學分析方法

采用SPSS 21.0軟件進行分析，細胞中TSP1 mRNA和蛋白表達量、細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-8、MDA含量等用表示，兩組均數(shù)差異比較采用獨立樣本t檢驗，多組均數(shù)間差異比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.高糖誘導腎小管上皮細胞中TSP1表達：結(jié)果見圖1和表1中所示，高糖處理可以誘導腎小管上皮細胞中TSP1轉(zhuǎn)錄和表達。

2.TSP1 siRNA下調(diào)高糖條件下腎小管上皮細胞中TSP1表達：結(jié)果見圖2和表2中所示，在腎小管上皮細胞中轉(zhuǎn)染TSP1 shRNA后，可以明顯下調(diào)高糖條件下腎小管上皮細胞中TSP1轉(zhuǎn)錄和表達。

圖1 Western Blot測定高糖對腎小管上皮細胞中TSP1表達影響

表1 高糖誘導腎小管上皮細胞中TSP1表達（±s）

表1 高糖誘導腎小管上皮細胞中TSP1表達（±s）

分組 重復次數(shù) TSP1 mRNA TSP1蛋白對照組 3 1.00 0.36±0.05高糖組 3 2.65±0.14 0.75±0.09 t 值 20.414 6.561 P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01

圖2 Western Blot檢測TSP1 shRNA對高糖條件下腎小管上皮細胞中TSP1表影響

表2 TSP1 shRNA下調(diào)高糖條件下腎小管上皮細胞中TSP1表達水平（±s）

表2 TSP1 shRNA下調(diào)高糖條件下腎小管上皮細胞中TSP1表達水平（±s）

注：與高糖組比較，aP ＜ 0.05；與 NC ＋高糖組比較，bP ＜ 0.05

分組 重復次數(shù) TSP1 mRNA TSP1蛋白高糖組 3 1.00 0.73±0.09 NC＋高糖組 3 1.01±0.12 0.71±0.06干擾＋高糖組 3 0.38±0.06ab 0.25±0.06ab F值 65.117 43.373 P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01

3.下調(diào)TSP1減少高糖條件下腎小管上皮細胞炎癥因子分泌：結(jié)果見表3中所示，高糖處理后的腎小管上皮細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-8含量升高；下調(diào)TSP1可以下調(diào)高糖條件下腎小管上皮細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-8含量。

4.下調(diào)TSP1減輕高糖誘導的腎小管上皮細胞氧化損傷：結(jié)果見表4，圖3中所示，高糖處理后的腎小管上皮細胞中ROS水平升高，同時細胞培養(yǎng)液中MDA含量也升高；下調(diào)TSP1可以明顯抑制高糖條件下腎小管上皮細胞中ROS表達，減少細胞培養(yǎng)液中MDA含量。

5.下調(diào)TSP1減少高糖條件下腎小管上皮細胞凋亡：結(jié)果見圖4和表5中所示，高糖處理后的腎小管上皮細胞凋亡率升高，細胞中c-caspase-3蛋白水平升高；下調(diào)TSP1可以下調(diào)高糖條件下腎小管上皮細胞凋亡率和c-caspase-3蛋白水平（圖5）。

表3 下調(diào)TSP1對高糖條件下腎小管上皮細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-8 含量影響（±s）

表3 下調(diào)TSP1對高糖條件下腎小管上皮細胞培養(yǎng)液中TNF-α、IL-8 含量影響（±s）

注：與對照組比，aP ＜ 0.05；與高糖組比較，bP ＜ 0.05；與 NC＋高糖組比較，cP ＜ 0.05

分組 重復次數(shù) TNF-α（ng/ml）IL-8（ng/ml）對照組 3 20.14±1.36 12.98±1.63高糖組 3 45.91±2.87a 25.42±3.26a NC＋高糖組 3 46.32±5.24 26.91±2.74干擾＋高糖組 3 34.20±2.06bc 18.75±1.62bc F值 43.825 21.155 P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01

表4 下調(diào)TSP1對高糖條件下腎小管上皮細胞中ROS和培養(yǎng)液中MDA含量影響（±s）

表4 下調(diào)TSP1對高糖條件下腎小管上皮細胞中ROS和培養(yǎng)液中MDA含量影響（±s）

注：與對照組比，aP ＜ 0.05；與高糖組比較，bP ＜ 0.05；與 NC＋高糖組比較，cP ＜ 0.05

分組 重復次數(shù) ROS MDA含量（nmol/ml）對照組 3 5.20±0.63 1.05±0.13高糖組 3 9.65±0.49a 2.36±0.21a NC＋高糖組 3 9.71±0.62 2.30±0.42干擾＋高糖組 3 6.96±0.50bc 1.63±0.10bc F值 45.652 18.595 P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01

表5 下調(diào)TSP1對高糖條件下腎小管上皮細胞凋亡和c-caspase-3蛋白水平影響（±s）

表5 下調(diào)TSP1對高糖條件下腎小管上皮細胞凋亡和c-caspase-3蛋白水平影響（±s）

注：與對照組比，aP ＜ 0.05；與高糖組比較，bP ＜ 0.05；與 NC＋高糖組比較，cP ＜ 0.05

分組 重復次數(shù) 凋亡率（%）c-caspase-3對照組 3 4.69±0.51 0.26±0.03高糖組 3 24.56±2.38a 0.85±0.09a NC＋高糖組 3 23.92±2.69 0.86±0.07干擾＋高糖組 3 18.48±1.23bc 0.45±0.04bc F值 69.632 69.187 P值 ＜ 0.01 ＜ 0.01

圖3 熒光顯微鏡下觀察下調(diào)TSP1對高糖條件下腎小管上皮細胞中ROS含量影響（×200）

圖4 流式細胞術測定細胞凋亡變化

圖5 Western Blot檢測細胞中c-caspase-3蛋白水平

討 論

糖尿病腎病是一種常見的引起終末腎疾病的原因之一，高糖環(huán)境下的腎小管上皮細胞功能損傷是糖尿病腎病發(fā)生的關鍵[8]。高血糖可以誘導腎組織中氧化應激和炎癥損傷，誘導細胞凋亡[9-11]。本實驗結(jié)果表明，高糖處理后的腎小管上皮細胞凋亡率升高，說明成功構(gòu)建了糖尿病腎病腎小管上皮細胞損傷模型。

TSP1是一種糖蛋白，由3個相同的肽鏈構(gòu)成的外基質(zhì)糖蛋白，其分子量約為145 kDa，因最初是在血小板純化中發(fā)現(xiàn)而得名[12]。TSP1蛋白含有6個功能結(jié)構(gòu)域，分別發(fā)揮血小板調(diào)控、血管生成、誘導凋亡、鈣離子結(jié)合和細胞黏附等作用[13]。正常情況下，TSP1在腦組織、肺臟等多種組織中表達，內(nèi)皮細胞、巨噬細胞和血管內(nèi)皮細胞等在受到炎癥、氧化應激等刺激后能夠高表達TSP1。TSP1可促進氧化損傷，誘導細胞凋亡發(fā)生[14]。很多研究顯示，TSP1是一種與纖維化疾病發(fā)生有關的調(diào)控因子，在糖尿病腎病、糖尿病心肌病等組織中高表達。TSP1還能夠誘導腎小管上皮細胞凋亡[15]。本實驗結(jié)果顯示，高糖處理后的腎小管上皮細胞中TSP1表達上調(diào)，與文獻報道一致，均提示，TSP1在糖尿病腎病腎小管上皮細胞中表達上調(diào)。

腎小管上皮細胞是腎臟組織的重要組成部分，在受到外界因素刺激后，能夠分泌大量的炎癥因子，促進組織炎癥反應[16]。TNF-α在糖尿病腎病腎組織中表達上調(diào)，其可以由腎小管上皮細胞分泌，是腎組織炎癥反應的促進因子[17]。IL-8也是一種促炎因子，高血糖刺激腎臟后可以誘導IL-8的分泌和表達[18]。TSP1是一種炎癥誘導因子，其表達缺失可以減輕組織和細胞炎癥[19]。本組資料干擾＋高糖組細胞培養(yǎng)液中的TNF-α和IL-8明顯低于NC＋高糖組，提示下調(diào)TSP1具有抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞分泌TNF-α和IL-8、減輕炎癥反應的作用。

研究表明，炎癥與氧化應激反應密切相關，炎癥因子可以刺激細胞中ROS產(chǎn)生，同時細胞中ROS過度積累可以誘導炎癥因子分泌。細胞中過量的ROS能夠誘導細胞中脂質(zhì)發(fā)生過氧化，產(chǎn)生大量的MDA[20]。另外，ROS還可以激活細胞中Caspase凋亡蛋白的激活，誘導細胞凋亡發(fā)生，Caspase-3活化是細胞凋亡進入不可逆反應的標志[21]。本組資料干擾＋高糖組的細胞中ROS水平明顯低于NC＋高糖組；培養(yǎng)液中MDA含量亦明顯降低，提示下調(diào)TSP1的表達可以下調(diào)高糖條件下腎小管上皮細胞中ROS水平，減少細胞中MDA合成，同時下調(diào)TSP1還可以抑制高糖條件下腎小管上皮細胞中Caspase-3活化，減少細胞凋亡，其機制可能通過抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞氧化應激而減少細胞凋亡。

本組資料表明，下調(diào)TSP1可能通過抑制高糖誘導的腎小管上皮細胞分泌炎癥因子、減輕炎癥損傷并減少細胞凋亡，TSP1可能是治療糖尿病腎病的潛在靶點，為以后研究TSP1在糖尿病腎病中的作用機制奠定基礎。