孫林琳， 楊松林， 王 曄， 段淑榮

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種與年齡相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病[1]。典型的AD臨床表現(xiàn)包括記憶障礙、失語、失用、失認(rèn)、視空間能力損害、抽象思維和計(jì)算力損害、人格和行為改變等[2]。流行病學(xué)調(diào)查顯示，65歲以上老年人AD患病率在我國約為3%～7%，女性高于男性[3]。隨著年齡的增長，AD患病率逐漸上升，目前我國人口平均預(yù)期壽命逐漸增加，AD已經(jīng)成為重要的健康問題及社會(huì)問題。

β-淀粉樣蛋白(β-amyloid，Aβ)的生成與清除失衡是導(dǎo)致AD發(fā)生的起始事件[4]。microRNAs(miRNAs)是一類內(nèi)源性非編碼的RNA分子，通過與靶基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3’BUTR)結(jié)合而導(dǎo)致翻譯抑制或mRNA降解進(jìn)而調(diào)節(jié)疾病的發(fā)生、發(fā)展[5，6]。以往的研究中觀察到AD患者和動(dòng)物模型中存在多種miRNAs異常表達(dá)[7，8]。同時(shí)，越來越多的證據(jù)表明，miRNAs通過調(diào)節(jié)抗體的產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)參與AD的發(fā)生及發(fā)展[9]。miR139是一種腦功能調(diào)節(jié)的重要因子，參與多種神經(jīng)、精神疾病的病理過程[10，11]，Noh等報(bào)道m(xù)iR-139在AD小鼠大腦組織中表達(dá)上調(diào)[12]。然而，miR139在AD發(fā)病機(jī)制中的具體作用和潛在分子機(jī)制還不十分清楚。

1 材料和方法

1.1 主要材料 小鼠來源神經(jīng)瘤母細(xì)胞系Neuro-2a購自于美國American type culture collection公司。Aβ25-35購自于美國Sigma公司。miR-139-mimics(No. miR20004552-1-5)，miR-NC-mimics，miR-139 inhibitor(No. miR10000250-1-5)以及miR-NC-inhibitor試劑盒均購自于廣州Ribobio公司。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連寶生物工程有限公司。FOXO1和β-actin抗體購自美國Cell Signaling Technology。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 小鼠來源神經(jīng)瘤母細(xì)胞系Neuro-2a在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中于37 ℃，5%二氧化碳濃度條件下培養(yǎng)。Aβ25-35溶于DMSO，保持在37℃ 備用[13]。利用不同培養(yǎng)濃度(0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L以及20 μmol/L)Aβ25-35 誘導(dǎo)Neuro-2a細(xì)胞24 h，隨后留取細(xì)胞進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 通過Lipofectaminetm 2000(Invitrogen公司，卡爾斯巴德，CA，美國)分別將50 nM miR-139-mimics，miR-NC-mimics，miR-139 inhibitor以及miR-NC-inhibitor轉(zhuǎn)染到Neuro-2a細(xì)胞中，48h后提取RNA。

1.2.3 RNA提取與實(shí)時(shí)PCR 從Neuro-2a細(xì)胞中提取總RNA。通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)錄。通過ABI7900實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(應(yīng)用生物系統(tǒng)公司，福斯特城，CA，美國)進(jìn)行檢測。比較2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量，引物序列如下：FOXO1-F：5’-GCTTAGAGCAGAGATGTTCTCACATT-3’；FOXO1-R：5’-CCAGAGTCTTTGTATCAG GCAAATAA-3-3’；GAPDH-F：5’-AGCCTCCCGCTTCGCTCTCT-3’；GAPDH-R：5’-GCGCCCAATACGACCAAATCCGT-3’；miR-139-F：5’-UGGAGACGCGGCCCUGUUGGAG-3’；miR-139-R：5’-CAAACCAAAGATAAACGTGGATT-3’；U6-F：5’-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3’；U6-R：5’-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3’；GAPDH為檢測FOXO1表達(dá)的內(nèi)參，U6為檢測miR-139表達(dá)的內(nèi)參。

1.2.4 Western blot分析 所有的蛋白來自Neuro-2a細(xì)胞，采用RIPA和PI(蛋白抑制劑，1∶100)提取蛋白。由10%的SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)移到醋酸纖維素膜上。膜用5%脫脂牛奶封閉2 h后，孵育其特異性抗體FOXO1抗體和β-actin抗體。拍照并用圖像分析軟件(Odyssey)進(jìn)行光密度積分值分析。

1.2.5 熒光素酶報(bào)告基因分析 miRNA靶標(biāo)預(yù)測軟件(www. TargetScan. org)分析結(jié)果顯示，F(xiàn)OXO1與miR139有潛在的結(jié)合位點(diǎn)(見圖2A)。因此，我們用熒光素酶報(bào)告法檢測miR-139是否能直接與FOXO1的3’BUTR區(qū)結(jié)合。利用PCR將預(yù)期作用位點(diǎn)及其附近序列重組入pmirglo載體，命名為pmirglo-FOXO1-wt。同時(shí)，我們構(gòu)建了刪除作用位點(diǎn)的FOXO1 3’-UTR序列，并重組入pmirglo載體，命名為pmirglo-FOXO1-mut。

為了分析miR-139與FOXO1的3’-UTR預(yù)測作用位點(diǎn)的直接作用，我們將5×103個(gè)Neuro-2a細(xì)胞接種于96孔板，24 h后，通過Lipofectamine 2000共轉(zhuǎn)染pmirglo-FOXO1-wt或pmirglo-FOXO1-mut。48 h后收集細(xì)胞，按照實(shí)驗(yàn)流程，通過Luciferase報(bào)告檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性(Promega，USA)。

1.2.6 caspase-3活性測定 利用不同培養(yǎng)濃度(0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L以及20μmol/L)Aβ25-35處理24 h后，收集Neuro-2a細(xì)胞。按照說明書中操作流程通過caspase-3比色分析儀(KeyGEN，南京)在405 nm的吸光度下檢測caspase-3活性。

1.2.7 NF-κB活性測定 利用不同培養(yǎng)濃度(0 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L以及20μmol/L)Aβ25-35處理24 h后，收集Neuro-2a細(xì)胞。按照說明書中操作流程通過NF-κB比色分析儀(碧云天，北京)在570 nm的吸光度下檢測NF-κB活性。

2 結(jié) 果

2.1 Aβ25-35對(duì)Neuro-2a細(xì)胞miR-139和FOXO1表達(dá)的影響 應(yīng)用不同濃度Aβ25-35(0 mmol/L、5 mmol/L、10和20 mmol/L)培養(yǎng)Neuro-2a細(xì)胞24 h，通過qRT-PCR以及Western blot方法檢測Aβ25-35對(duì)Neuro-2a細(xì)胞中miR-139和FOXO1的表達(dá)。結(jié)果顯示，Neuro-2a中miR-139的表達(dá)呈Aβ25-35劑量依賴性顯著上升(P<0.05，見圖1A)，F(xiàn)OXO1的mRNA及蛋白表達(dá)呈Aβ25-35劑量依賴性顯著降低(P<0.05，見圖1B、圖1C)，表明miR-139和FOXO1參與Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，兩者表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

2.2 miR-139對(duì)Neuro-2a細(xì)胞FOXO1的調(diào)控作用 熒光素酶報(bào)告試驗(yàn)結(jié)果表明(見圖2B)，相對(duì)于陰性對(duì)照組，過表達(dá)miR-139能夠顯著抑制FOXO1熒光素酶的活性；刪除預(yù)測的miR-139作用位點(diǎn)后，F(xiàn)OXO1的熒光素酶活性不能被抑制，印證之前預(yù)測的miR-139可直接作用于FOXO1的3’BUTR區(qū)。

進(jìn)一步，通過qRT-PCR以及Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染miR-139 mimic、miR-139 inhibitor以及其陰性對(duì)照物到Neuro-2a細(xì)胞后FOXO1的表達(dá)。結(jié)果顯示，過表達(dá)miR-139能夠明顯降低Neuro-2a細(xì)胞中FOXO1的mRNA及蛋白表達(dá)水平(P<0.05，見圖2C、圖2D)，而低表達(dá)miR-139的作用與其相反。以上結(jié)果從多水平證明FOXO1是miR-139在Neuro-2a細(xì)胞中的直接作用靶點(diǎn)。

2.3 miR-139對(duì)Aβ25-35介導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞增殖及凋亡的影響 分別將miR-139抑制物及陰性對(duì)照物轉(zhuǎn)染到Neuro-2a細(xì)胞，各稱為靜默組及對(duì)照組。隨后將轉(zhuǎn)染的Neuro-2a細(xì)胞暴露于不同濃度Aβ25-35下24h，應(yīng)用CCK-8法檢測細(xì)胞活力、caspase-3活性檢測細(xì)胞凋亡、ELISA方法檢測NF-κB濃度。

qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，與對(duì)照組相比，靜默組Neuro-2a細(xì)胞miR-139的表達(dá)顯著降低(P<0.05，見圖3A)，miR-139抑制物在Neuro-2a細(xì)胞中可發(fā)揮作用。接下來CCK-8法顯示，與對(duì)照組相比，靜默組Neuro-2a細(xì)胞存活率高，在Aβ25-35較高濃度(10 mmol/L和20 mmol/L)時(shí)差異顯著(P<0.05，見圖3B、圖3C)。caspase-3活性檢測證實(shí)，與對(duì)照組相比，靜默組Neuro-2a細(xì)胞caspase-3活性降低，在Aβ25-35較高濃度(10和20 mmol/L)時(shí)差異顯著(P<0.05，見圖3D)。

NF-κB介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡作用在AD發(fā)病機(jī)制中起重要作用[14]。我們通過觀察NF-κB的活性來研究miR-139對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)的Neuro-2a細(xì)胞凋亡的影響。ELISA檢測顯示，Aβ25-35處理Neuro-2a細(xì)胞后，與對(duì)照組相比，靜默組NF-κB濃度降低，在Aβ25-35較高濃度(10 mmol/L和20 mmol/L)時(shí)差異顯著(p<0.05，見圖3E)。

以上結(jié)果表明，抑制miR-139表達(dá)減弱了Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和NF-κB途徑的細(xì)胞凋亡，且具有Aβ25-35劑量依賴性。

A：應(yīng)用不同濃度Aβ25-35(0 mmol/L，5 mmol/L，10 and 20 mmol/L) 孵育 Neuro-2a細(xì)胞，qRT-PCR檢測miR-139表達(dá)情況；B：應(yīng)用不同濃度Aβ25-35(0 mmol/L，5 mmol/L，10 mmol/L and 20 mmol/L) 孵育 Neuro-2a細(xì)胞，qRT-PCR檢測FOXO1 mRNA表達(dá)情況；C：應(yīng)用不同濃度Aβ25-35(0 mmol/L，5 mmol/L，10 and 20 mmol/L) 孵育 Neuro-2a細(xì)胞，Western blot檢測FOXO1蛋白表達(dá)情況*P<0.05

A：預(yù)測的 miR-139與FOXO1 3’UTR區(qū)結(jié)合位點(diǎn)；B：Luciferase分析報(bào)告；C：qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染miR-139 mimic、miR-139 inhibitor以及其陰性對(duì)照到Neuro-2a細(xì)胞后FOXO1 mRNA的表達(dá)；D：Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染miR-139 mimic、miR-139 inhibitor以及其陰性對(duì)照到Neuro-2a細(xì)胞后FOXO1蛋白的表達(dá)*P<0.05

A：qRT-PCR方法檢測轉(zhuǎn)染miR-139 inhibitor及陰性對(duì)照物后Neuro-2a細(xì)胞中miR-139的表達(dá)；B-C：應(yīng)用不同濃度Aβ25-35(0 mmol/L，5 mmol/L，10 mmol/L and 20 mmol/L) 孵育轉(zhuǎn)染 miR-139 inhibitor及陰性對(duì)照物的Neuro-2a細(xì)胞24 h，CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力；D：應(yīng)用不同濃度Aβ25-35(0 mmol/L，5 mmol/L，10 mmol/L and 20 mmol/L) 孵育轉(zhuǎn)染 miR-139 inhibitor及陰性對(duì)照物的Neuro-2a細(xì)胞24 h，caspase-3 法檢測細(xì)胞凋亡；E：應(yīng)用不同濃度Aβ25-35(0 mmol/L，5 mmol/L，10 mmol/Land 20 mmol/L) 孵育轉(zhuǎn)染 miR-139 inhibitor及陰性對(duì)照物的Neuro-2a細(xì)胞24 h，ELISA法檢測NF-κB水平*P<0.05

3 討 論

Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性包括炎癥和神經(jīng)元凋亡，在AD的發(fā)病過程中起重要作用[13]。Aβ25-35被廣泛用于體外和體內(nèi)AD模型的誘導(dǎo)[15]。本研究中，我們證明Aβ25-35可引起小鼠Neuro-2a細(xì)胞中miR-139表達(dá)升高、FOXO1表達(dá)降低。并證實(shí)FOXO1是miR-139的直接作用靶點(diǎn)。此外，我們發(fā)現(xiàn)miR-139通過激活NF-κB通路，參與Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞毒性及凋亡作用。

miR-139是一種廣泛存在于人體并發(fā)揮重要作用的一種miRNA[16]。以往對(duì)miR-139的研究多集中于腫瘤領(lǐng)域[17]。近年來發(fā)現(xiàn)其在多種神經(jīng)、精神系統(tǒng)疾病中發(fā)揮作用。Tang等研究發(fā)現(xiàn)，在快速老化癡呆模型小鼠SAMP8海馬中，mir-139的表達(dá)明顯高于對(duì)照組，海馬內(nèi)注射miR-139也可損害海馬依賴性學(xué)習(xí)和記憶的形成。相反，在小鼠海馬中下調(diào)miR-139可改善小鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能[18]。在本研究中，我們證明Aβ25-35以劑量依賴的方式升高了Neuro-2a細(xì)胞中miR-139的表達(dá)。抑制miR-139功能減弱了Aβ25-35誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡。與Tang等觀察到的miR-139促進(jìn)AD發(fā)生結(jié)果相一致。

在腦腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)，miR-139可直接作用于胰島素樣生長因子、過氧化物酶體增殖物激活受體γ等多個(gè)靶點(diǎn)參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，并影響腦功能網(wǎng)絡(luò)[19]。FOXO1基因敲除小鼠隨著年齡的增長，神經(jīng)元分化、增殖、存活、自我更新受損[20]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在Neuro-2a細(xì)胞中，miR-139可直接靶向作用于FOXO1，調(diào)節(jié)后者的mRNA及蛋白表達(dá)。提示FOXO1可能是miR-139參與Aβ25-35細(xì)胞毒性作用的重要通路，miR-139通過抑制FOXO1進(jìn)而影響神經(jīng)元內(nèi)相關(guān)基因的表達(dá)，參與AD的發(fā)生發(fā)展。接下來的功能增益實(shí)驗(yàn)表明，miR-139過表達(dá)還可引起Aβ25-35誘導(dǎo)Neuro-2a細(xì)胞NF-κB表達(dá)上調(diào)，發(fā)揮Aβ25-35介導(dǎo)的胞毒性和凋亡作用，說明miR-139可通過多種途徑參與AD的發(fā)生及發(fā)展。

總之，我們證明Aβ25-35顯著上調(diào)小鼠Neuro-2a細(xì)胞中的miR-139表達(dá)、下調(diào)FOXO1表達(dá)。此外，miR-139可分別通過直接抑制FOXO1、間接激活NF-κB發(fā)揮Aβ25-35誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性，從而闡明了miR-139神經(jīng)毒性的分子機(jī)制。探討miR-139作為治療AD的潛在治療靶點(diǎn)的可能性，為預(yù)防、診斷以及治療AD提供了新的思路。