何榮榮，譚運(yùn)壽，張美虹，李正香，鐘秋平

(1海南大學(xué) 食品學(xué)院，?？?570228；2海南侯臣生物科技有限公司，海南 澄邁 571921)

茶皂素(Tea Saponin)是油茶籽榨油后的副產(chǎn)物茶枯餅中提取出來的一類糖苷化合物，它是茶枯餅中主要活性成分之一，具有良好的抗氧化和抑菌活性[1-3]。近年來，由食源性致病菌引起的疾病威脅著整個公共安全[4]，沙門氏菌是一類重要的食源性致病菌， 能夠?qū)е禄颊叱霈F(xiàn)敗血癥、腸胃炎和傷寒等疾病， 嚴(yán)重時甚至可導(dǎo)致患者死亡[5]。畜禽產(chǎn)品是沙門氏菌的主要載體，如肉雞，給消費(fèi)者健康帶來巨大的威脅[6]。天然防腐劑憑借其安全性高、抗菌作用強(qiáng)、抑菌譜廣、水溶性好等優(yōu)點(diǎn)成為人們研究的焦點(diǎn)[7-8]。目前，關(guān)于茶皂素抑菌研究主要集中在抑菌效果上[9]，對其抑菌機(jī)理及其在畜禽肉中的保鮮應(yīng)用的報道較少，因此，筆者以本實(shí)驗(yàn)室提取的茶皂素為實(shí)驗(yàn)原料，通過對沙門氏菌生長、形態(tài)、胞外蛋白、堿性磷酸酶及K+泄漏等指標(biāo)研究茶皂素的抑菌機(jī)理，并將其應(yīng)用于雞胸肉保鮮，旨在為開發(fā)天然抗菌劑提供理論指導(dǎo)，也為茶皂素高值化利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑茶皂素(純度85.4%)從海南油茶的茶枯餅中提取；新鮮雞胸肉購自海口某農(nóng)貿(mào)市場。供試菌：枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilissp.)、沙門氏菌(Salmonellasp.)、單核細(xì)胞性李斯特菌(Listeriamonocytogenessp.)、大腸桿菌(Escherichiacolisp.)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureussp.)、銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosasp.)和熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescenssp.)由海南大學(xué)食品學(xué)院提供。營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司；木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂培養(yǎng)基購自北京陸橋公司。無水乙醇、氯化鈉和磷酸(分析純)購自廣州化學(xué)試劑廠；考馬斯亮藍(lán)G-250購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；堿性磷酸酶試劑盒購自南京建成生物工程研究所；牛血清蛋白和無菌磷酸鹽緩沖液(PBS) 購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器設(shè)備無菌超凈工作臺購自蘇州佳寶凈化工程設(shè)備有限公司；高壓滅菌鍋購自致微(廈門)儀器有限公司；SPX生化培養(yǎng)箱購自寧波江南儀器廠；高速冷凍離心機(jī)購自上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；TAS-990 Super AFG原子吸收光譜儀和T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；電子分析天平購自上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；S-3000掃描式電子顯微鏡購自日本日立公司。

1.3 茶皂素最小抑菌濃度測定

1.3.1 菌種的活化將供試菌在營養(yǎng)肉汁瓊脂培養(yǎng)基中傳代活化后4 ℃保存?zhèn)溆?，采用麥?zhǔn)媳葷岱╗10]，將各種供試菌置于適宜溫度(沙門氏菌、金黃色葡萄球菌、李斯特菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌為37 ℃，熒光假單胞菌為30 ℃，下同)培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h，用接種環(huán)挑取供試菌置于無菌生理鹽水(0.9% NaCl)中制成含菌量約為(106～107) cfu·mL-1的菌懸液備用。

1.3.2 茶皂素對菌株的最小抑菌濃度的測定采用肉湯稀釋法[11]，用無菌水溶解純化后的茶皂素，采用二倍梯度法將其稀釋成12.5，25.0，50.0，100.0和200.0 g·L-1的抑制液，向滅菌后的平板中加入配制好的上述抑制液2 mL，再加入18 mL冷卻至50 ℃左右的營養(yǎng)肉汁培養(yǎng)基，將二者混合，使其終濃度分別為1.25，2.50，5.00，10.00，20.00 g·L-1。待培養(yǎng)基凝固后取100 μL的供試菌懸液于平板上均勻涂布。以無菌水作為空白對照，每個濃度做3個平行，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察，以肉眼看不見細(xì)菌生長的最小稀釋濃度作為茶皂素對供試菌作用的最小抑菌濃度(MIC)。

1.4 細(xì)菌生長曲線的測定參考文獻(xiàn)[12]的方法，用無菌生理鹽水稀釋供試菌 (106～107) cfu·mL-1，將稀釋后的菌懸液以1%(v/v)的比例接種于液體培養(yǎng)基中，置于37 ℃，150 r·min-1的搖床中培養(yǎng)24 h，加入茶皂素溶液使其最終濃度為MIC，以無菌水作空白，每隔2 h取樣5 mL，分光光度計測定600 nm波長下吸光值，繪制茶皂素對供試菌抑制作用的生長曲線。

1.5 細(xì)菌蛋白泄漏曲線的測定參考LV F等[13]的方法，將活化后的供試菌接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，加入MIC濃度的茶皂素溶液，以無菌水作空白對照，加入抑菌物質(zhì)后置于37 ℃，150 r·min-1搖床中培養(yǎng)，分別在0，2，4，6，8，10，12 h取樣，每次取樣5 mL，每個時間點(diǎn)取3個平行。將菌懸液在4 000 r·min-1離心10 min。離心后取上清液，加入配置好的考馬斯亮藍(lán)溶液，混勻靜置5 min在595 nm下測量其吸光度。以時間為橫坐標(biāo)，蛋白質(zhì)質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，繪制茶皂素對供試菌蛋白泄漏曲線。

1.6 堿性磷酸酶含量的測定將活化后的供試菌接種于營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，加入茶皂素溶液使其最終濃度為MIC，以無菌水代替茶皂素溶液作空白對照，加入抑菌物質(zhì)后置于37 ℃，150 r·min-1搖床中培養(yǎng)，分別在0，4，8，12 h取樣，6 500 r·min-1離心 10 min，取上清液作為樣液，操作按照試劑盒步驟進(jìn)行，于 520 nm 波長下測定實(shí)驗(yàn)組和對照組吸光度值，定義每克組織蛋白在37 ℃與基質(zhì)作用15 min產(chǎn)生1 mg酚為1個金氏單位。

1.7 細(xì)胞形態(tài)觀察參考DIAO W R等人[14]的方法，將活化后的供試菌在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)至對數(shù)期，加入茶皂素溶液至最終濃度為MIC，并以無菌水作為對照，加入抑菌物質(zhì)后置于37 ℃,150 r·min-1搖床中培養(yǎng)，分別在4,12 h時取樣，8 000 r·min-1離心10 min后棄去上清液，收集菌體。0.1 mol·L-1PBS洗滌3次后，再依次用20 %，40 %，60 %，80 %乙醇溶液進(jìn)行梯度洗脫，每個濃度重復(fù)2次，最后用無水乙醇洗脫3次。棄去上清液后將樣品在-20 ℃條件下預(yù)凍1夜，再置于真空冷凍干燥機(jī)內(nèi)冷凍干燥12 h。取出凍干的樣品，密封防止吸潮，上樣，通過陰極噴涂將樣品金覆蓋，在掃描電子顯微鏡上觀察供試菌的細(xì)胞形態(tài)。

1.8 K+濃度測定參考MIAO等[15]的方法，將活化后的供試菌在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)期，離心收集菌體，離心參數(shù)為4 000 r·min-1，15min。菌體經(jīng)無菌生理鹽水(0.9% NaCl，用超純水配置)洗滌3次后，重懸于等量生理鹽水中，加入茶皂素溶液，使其最終濃度為MIC，同時以無菌水+菌、茶皂素水溶液分別作為對照，置于37 ℃，150 r·min-1搖床中培養(yǎng)，分別在0，2 h后取樣離心，離心參數(shù)為4 000 r·min-1，15 min，收集上清液，過0.22 μm濾膜，用原子吸收光譜法測定液體中K+濃度。

1.9 茶皂素在雞胸肉保鮮中的應(yīng)用

1.9.1 雞胸肉的前處理菌種活化：將冷藏的供試菌(沙門氏菌)取出平板劃線法活化后，使用無菌生理鹽水將供試菌稀釋成 (106～107) mL-1后制成菌懸液，備用。樣品前處理及接種：將宰殺后的肉雞立刻低溫運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，無菌條件下剝離出雞胸肉，表面棄去，保留無菌的內(nèi)部樣品，分割成小塊，每塊10 g備用。根據(jù)國標(biāo)(GB/T4789.4-2008及GB/T 4789.30-2008)對沙門氏菌的原始污染情況進(jìn)行檢測，余下的試驗(yàn)樣品進(jìn)行接種，參考Elenadel R等[16]的方法：取40 μL上述新鮮菌液，使用點(diǎn)接種法將菌懸液接種于樣品中，放置1 h，確保菌懸液充分粘附于雞肉樣品中。將樣品置于配置的茶皂素水溶液中浸泡10 min，以無菌水作空白對照，取出瀝干30 min，保存于無菌密封袋中，置于4 ℃冰箱中保存，分別在0，2，4，6，8，10 d取樣測各種指標(biāo)。

1.9.2 沙門氏菌菌落數(shù)測定參考國標(biāo)GB4789.2-2016，將分割好的小塊雞胸肉(每小塊10 g)從冰箱中取出，粉碎，加入20 mL無菌生理鹽水浸泡30 min后，過濾，取100 μL涂布，將平板倒置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。觀察，計數(shù)。

1.9.3 pH值測定參考國標(biāo)GB 5009.237-2016，取分割好的雞胸肉(每塊10 g)粉碎，加入50 mL無菌水，靜置 30 min，過濾取上清液，用 pH 計測定樣品的 pH 值，每組重復(fù)3次。

1.9.4 持水率測定參考Sánchez-González I等[17]的方法，將雞胸肉切成5 mm左右的薄片，準(zhǔn)確稱量其質(zhì)量，記為G1，然后裝入3層濾紙中，包好密封于50 mL離心管中，4 ℃,6 500 r·min-1離心15 min，取出后立即稱質(zhì)量，記質(zhì)量為G2。持水率=G2/G1×100%。

1.10 數(shù)據(jù)處理采用DPS的單因素方差分析進(jìn)行差異性分析(P<0.05)，使用Origin2017進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶皂素對菌體的最小抑菌(MIC)由表1可以看出，當(dāng)茶皂素達(dá)到一定濃度時，對1.1所述幾種供試菌，包括革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有一定程度的抑制作用，說明茶皂素具有廣譜抑菌效果。同一濃度茶皂素對不同供試菌的抑菌效果有所差異，其中對熒光假單胞菌的抑制效果不明顯，濃度達(dá)到20 g·L-1時，仍有少量菌落形成。對枯草芽孢桿菌和沙門氏菌的抑制效果最好，MIC均為10 g·L-1。茶皂素對上述供試菌的抑菌作用從強(qiáng)到弱依次為：沙門氏菌、枯草芽孢桿菌>李斯特菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、大腸桿菌>熒光假單胞菌。

表1 不同濃度茶皂素對7種致病菌的抑制效果比較

注：- 無菌落；+ 少量菌落；++ 較多菌落；+++ 大量菌落

Note: - no colony; + few colonies; ++ a few colonies; +++ numerous colonies

2.2 茶皂素對沙門氏菌生長的影響當(dāng)微生物的數(shù)量和培養(yǎng)環(huán)境改變時，菌液濃度與其吸光值成正比，由吸光值與時間的變化圖，可得出該微生物的生長狀況[18]，由圖1可知，對照組的沙門氏菌符合典型的“S”型生長曲線，延滯期為4 h，之后快速生長達(dá)到對數(shù)期，12 h進(jìn)入穩(wěn)定期，即未處理組供試菌能正常生長。但對于實(shí)驗(yàn)組，加入MIC濃度的茶皂素后，沙門氏菌的生長曲線發(fā)生了明顯的變化，24 h內(nèi)吸光值均為0，沒有進(jìn)行正常的生長繁殖，說明茶皂素的加入干擾了供試菌的增殖，導(dǎo)致其生長異常，從而發(fā)揮抑菌作用。

2.3 茶皂素對沙門氏菌蛋白質(zhì)泄漏的影響蛋白質(zhì)是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，作為生命活動的主要承擔(dān)者，在微生物的代謝活動中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。由圖2可知，與對照組相比，茶皂素處理后，培養(yǎng)液中蛋白濃度在2 h之內(nèi)快速上升，之后上升速度較緩慢，10 h之后有所下降。蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量較大，只有當(dāng)細(xì)胞膜完整性遭到破壞時，蛋白質(zhì)才會大量泄漏至胞外導(dǎo)致胞外蛋白含量上升[19]，此結(jié)果表明茶皂素能夠破壞菌體細(xì)胞膜的完整性，從而發(fā)揮其抑菌功能。

2.4 茶皂素對沙門氏菌細(xì)胞形態(tài)的影響由圖3可知，對照組C1，D1組菌體細(xì)胞外觀光滑，呈桿狀，菌體結(jié)構(gòu)飽滿，完整，沒有出現(xiàn)褶皺、凹陷、變形的現(xiàn)象。由C2可知，經(jīng)茶皂素處理4 h后，供試菌部分細(xì)胞都出現(xiàn)聚集、粘連成團(tuán)的現(xiàn)象。由D2可知，作用12 h后，供試菌菌體外觀發(fā)生明顯的變化，幾乎所有細(xì)胞都出現(xiàn)塌陷、溶洞、表面輪廓不完整的現(xiàn)象，部分細(xì)胞出現(xiàn)折斷現(xiàn)象，細(xì)胞聚集、粘附成團(tuán)，幾乎辨認(rèn)不出正常細(xì)胞形態(tài)。說明茶皂素可以對沙門氏菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜造成破壞和損傷，改變菌體正常的形態(tài)，從而導(dǎo)致菌體死亡。

圖3 茶皂素對沙門氏菌細(xì)胞形態(tài)的影響C1，C2，D1，D2分別為4 h對照、4 h MIC、12 h對照和12 h MICFig.3 Cell morphology of Salmonella sp.C1, C2, D1 and D2 are 4 h control, 4 h MIC, 12 h control and 12 h MIC, respectively

2.5 茶皂素對沙門氏菌堿性磷酸酶的影響堿性磷酸酶位于細(xì)胞膜和細(xì)胞壁之間，正常情況下，在胞外是不能檢測到其活性的，只有在細(xì)胞壁或者細(xì)胞膜遭到破壞的情況下，才會泄漏到胞外[20]，由圖4可知，與對照組相比，供試菌經(jīng)茶皂素作用后，胞外堿性磷酸酶的含量均明顯上升，表明茶皂素可以通過損傷供試菌的細(xì)胞壁、改變細(xì)胞壁的透性、破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性來實(shí)現(xiàn)其抑菌作用。

2.6 茶皂素對沙門氏菌K+釋放的影響當(dāng)微生物曝露于抗生素或者其他不適宜的生長環(huán)境時，細(xì)胞膜通透性改變，可能會造成細(xì)胞內(nèi)電解質(zhì)如K+泄漏，因此可以通過測定K+釋放來研究微生物細(xì)胞的活性[21]。從圖5可以看出，經(jīng)茶皂素處理2 h后供試菌胞外K+濃度均顯著高于對照組，進(jìn)一步說明茶皂素可以損壞供試菌細(xì)胞膜的完整性，破壞菌體細(xì)胞膜的阻隔性，從而發(fā)揮抑菌作用。

2.7 茶皂素對雞胸肉沙門氏菌菌落總數(shù)的影響菌落總數(shù)的多少可以反映食品被污染的程度，可以用來觀測食品中細(xì)菌的繁殖動態(tài)，可以作為預(yù)測貨架期的依據(jù)。由圖6可知，隨著儲藏時間的延長，處理組和對照組的沙門氏菌菌落均呈現(xiàn)上升的趨勢，初始的菌落總數(shù)分別為1.4 log(cfu·g-1)和1.3 log(cfu·g-1)，對照組在(0～6 )d內(nèi)，菌落總數(shù)增長快速，之后緩慢增長，與對照組相比，經(jīng)茶皂素處理之后的雞胸肉在前4 d，菌落總數(shù)上升緩慢，之后上升速度加快，說明茶皂素可以在短時間內(nèi)較好的抑制雞胸肉中沙門氏菌的生長繁殖，隨著儲藏時間的延長，茶皂素的抑菌效果逐漸減弱。

2.8 茶皂素對雞胸肉pH的影響pH值可以用來衡量食品的新鮮程度，如果食品腐敗變質(zhì)加劇，pH就會有升高的趨勢[22]。由圖7可知，對照組和處理組的pH值均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢，起始pH分別為5.95和6.07，儲藏第2天的pH明顯下降，下降的原因可能是與體內(nèi)代謝活動有關(guān)，比如糖酵解途徑產(chǎn)生的乳酸，磷酸肌酸和ATP分解產(chǎn)生的磷酸，蛋白質(zhì)分解產(chǎn)生的小分子氨基酸等都會導(dǎo)致pH下降。2 d后pH呈現(xiàn)上升的趨勢，可能的原因是微生物的存在會分解蛋白質(zhì)產(chǎn)生堿性物質(zhì)如TVB-N和TMA等引起pH值上升。與對照組相比，經(jīng)茶皂素處理后雞胸肉的pH變化緩慢，間接說明茶皂素可以抑制微生物的生長繁殖從而達(dá)到保鮮的效果。

2.9 茶皂素對雞胸肉持水率的影響持水性作為可以反映食品凝膠結(jié)構(gòu)的指標(biāo)，持水性越高說明食品中凝膠三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)越緊密，保持水分的能力越強(qiáng)[23-24]，由圖8可知，隨著儲藏時間的延長，處理組和對照組持水率均呈現(xiàn)下降的趨勢。這是由于微生物的存在導(dǎo)致了雞胸肉中蛋白質(zhì)的分解，破壞了肉制品內(nèi)部的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，從而引起持水率下降。MIC組持水率較對照組而言，下降緩慢，儲藏期結(jié)束仍高于對照組，說明茶皂素的存在抑制了微生物的生長，延緩了蛋白組被分解的速率，減緩了持水率下降的速度，對雞胸肉的保鮮產(chǎn)生了積極的作用。

3 討 論

本研究利用最小抑菌濃度對比了茶皂素對幾種常見致病菌的抑菌效果，并且根據(jù)細(xì)胞生長、蛋白泄漏濃度、細(xì)胞形態(tài)、堿性磷酸酶及K+濃度等指標(biāo)，從細(xì)胞水平上研究了茶皂素的抑菌機(jī)理。結(jié)果表明，茶皂素能夠阻止菌體細(xì)胞正常的生長，其對沙門氏菌和枯草芽孢桿菌有較好的抑菌作用，最小抑菌質(zhì)量濃度均為10 g·L-1，經(jīng)過茶皂素處理后，沙門氏菌菌體外觀輪廓遭到破壞，粘連成團(tuán)，并且出現(xiàn)塌陷、溶洞等現(xiàn)象，失去原有形狀。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其對細(xì)胞膜和細(xì)胞壁均有破壞作用，損壞了細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的完整性，改變了細(xì)胞膜和細(xì)胞壁的透性，導(dǎo)致其阻隔性下降，胞內(nèi)蛋白質(zhì)大分子、維持電解質(zhì)平衡的K+、間隙酶堿性磷酸酶等泄漏到細(xì)胞外，干擾了菌體細(xì)胞的正常生長繁殖，導(dǎo)致了代謝活動的異常，從而引起了細(xì)胞的死亡。本研究結(jié)果與張赟彬等[25]研究荷葉精油對肉類食品中常見致病菌的抑菌機(jī)理結(jié)果相似，將其應(yīng)用于雞胸肉保鮮中發(fā)現(xiàn)，茶皂素可以較好地抑菌沙門氏菌的生長繁殖，減緩pH值上升的速度，有效改善肉制品的持水性，從而達(dá)到改善肉制品品質(zhì)，延長貨架期的目的?？赡艿脑蚴遣柙硭匾种屏穗u胸肉中微生物的生長繁殖。

茶皂素作為一種天然的活性物質(zhì)，其在天然防腐劑的開發(fā)等方面具有較好的價值，但本研究對茶皂素的抑菌機(jī)理還不夠深入，今后有待從代謝組學(xué)、基因組學(xué)等方面更加深入研究茶皂素的抑菌機(jī)理，以期為天然抑菌劑的開發(fā)提供更準(zhǔn)確的理論依據(jù)。