齊 釗，張曼麗，閆 臻，徐 敏，李相煌，馬 葉，熊 睿，柳曉磊，湯 華

(1.海南大學(xué) 熱帶生物資源可持續(xù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/熱帶作物學(xué)院, ?？?570228；2.海南省植物保護(hù)總站，海口 571100 )

在我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中，化肥在提高作物產(chǎn)量方面作出了巨大貢獻(xiàn)。然而，過量施肥不僅導(dǎo)致生產(chǎn)成本上升、農(nóng)作物品質(zhì)下降、產(chǎn)量遞減，而且還引發(fā)了嚴(yán)重的農(nóng)業(yè)面源污染，造成水體富營(yíng)養(yǎng)化、耕地質(zhì)量退化[1-3]等環(huán)境問題。微生物菌劑和氨基酸水溶肥具有經(jīng)濟(jì)、高效、無污染等特點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。研究表明，微生物菌劑對(duì)菠菜、黃瓜等有促生及壯苗的功能[4-5]，對(duì)小麥紋枯病及根腐病有很好的防治效果[6]。氨基酸水溶肥富含活性肽、氨基酸、鈣元素和天然生長(zhǎng)活性物質(zhì)等，能夠提高辣椒、小白菜、小麥等蔬菜和作物的產(chǎn)量和品質(zhì)[7-9]。復(fù)合微生物菌劑含有枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等大量的有益活菌物質(zhì)及多種天然發(fā)酵活性物質(zhì)，能在根部土壤繁殖，形成有利于作物生長(zhǎng)的微生物優(yōu)勢(shì)菌群，恢復(fù)土壤微生態(tài)平衡，而且還能產(chǎn)生各類植物生長(zhǎng)激素，刺激植物生長(zhǎng)。氨基酸水溶肥易于被作物吸收，也能為枯草芽孢桿菌提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有利于微生物菌擴(kuò)繁[10]。聯(lián)合施用微生物菌肥和氨基酸水溶肥可能是解決農(nóng)作物高產(chǎn)與病害防治等問題的有效措施，但目前相關(guān)研究相對(duì)較少。因此，筆者通過聯(lián)合施用復(fù)合微生物菌劑和氨基酸水溶肥于哈密瓜，研究施用土壤的細(xì)菌群結(jié)構(gòu)變化及土壤理化性質(zhì)的變化趨勢(shì)，旨在為兩者聯(lián)合施用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及樣品采集氨基酸水溶肥，商標(biāo)名為“霖田”，登記證號(hào)為農(nóng)肥(2015)臨字8794號(hào)，有效成分：氨基酸=100 g·L-1，Mn+Zn+P+Fe=30 g·L-1；復(fù)合微生物菌劑，商標(biāo)名為“霖田甘露”， 登記證號(hào)為微生物肥(2014)臨字(2378)號(hào)，有效成分：枯草芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌+解淀粉芽孢桿菌=2億個(gè)·mL-1，兩者均由海南霖田農(nóng)業(yè)生物技術(shù)有限公司研制生產(chǎn)。

試驗(yàn)時(shí)間：2016年10—12月。試驗(yàn)選擇在海南省樂東縣的哈密瓜種植基地進(jìn)行，哈密瓜品種為‘西州蜜’。灌溉設(shè)施為滴灌。試驗(yàn)共設(shè)置2個(gè)處理:不施肥料，只用清水滴灌為對(duì)照組(HC)；復(fù)合微生物菌劑與氨基酸水溶肥聯(lián)合施用為處理組(HE)，每個(gè)處理4次重復(fù)，共8個(gè)小區(qū)，每個(gè)小區(qū)面積0.33 hm2，其他的田間管理正常進(jìn)行。取樣分3個(gè)時(shí)期，分別是施肥前期(哈密瓜苗移栽恢復(fù)后第5天，CK)、定植期(施肥后約1個(gè)月)、結(jié)果期(施肥后約2個(gè)月)。取樣時(shí)間點(diǎn)分別是10-21，11-16，12-21。對(duì)土壤進(jìn)行棋盤式取樣，每小區(qū)4個(gè)點(diǎn)，選取深度5～15 cm的土樣，將所取土樣混合均勻后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2 土壤理化性質(zhì)的檢測(cè)土壤堿解氮的測(cè)定采用堿解蒸餾法，有效磷的測(cè)定參照NY/T1121.7—2014，速效鉀的測(cè)定參照NY/T889—2004,有機(jī)質(zhì)的測(cè)定參照NY/T1121.6—2006，pH值的測(cè)定參照NY/T1121.6—2016，線蟲檢測(cè)參照改良后貝曼漏斗法。

1.3 高通量測(cè)序土壤微生物DNA提取用Genebank土壤微生物DNA提取試劑盒進(jìn)行提取，取質(zhì)量合格的DNA樣品送北京百邁客生物科技有限公司，由該公司采用Illumina Miseq 測(cè)序平臺(tái)對(duì)樣品進(jìn)行高通量測(cè)序及基礎(chǔ)分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理采用Excel 2016和SPSS21鄧肯(Duncan)新復(fù)極差(P<0.05)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同時(shí)期不同處理哈密瓜土壤氮磷鉀含量的變化從表1可知，與施肥前(CK)相比，清水處理(HC)和施肥處理(HE)條件下的堿解氮、有效鉀含量都有不同程度的下降。這是由于哈密瓜在不同的生長(zhǎng)發(fā)育期，需要的營(yíng)養(yǎng)不同所致(前期需要大量的氮肥，等果實(shí)長(zhǎng)大，果皮開始拉出網(wǎng)紋時(shí)，對(duì)鉀肥的需求較高)。所以，隨著時(shí)間的推移，土壤的堿解氮、有效鉀含量都會(huì)有不同程度的下降，但與清水組相比，施肥組的堿解氮、有效鉀含量下降得比較少，這可能與施肥補(bǔ)充了一些營(yíng)養(yǎng)元素有關(guān)。定植期哈密瓜對(duì)營(yíng)養(yǎng)的需求量提高，由于菌肥聯(lián)用補(bǔ)充了相關(guān)營(yíng)養(yǎng)，因此，除堿解氮外，定植期施肥組有效磷和速效鉀含量變化不明顯。結(jié)果期兩組處理的土壤理化性質(zhì)差異不顯著，表明菌肥聯(lián)用對(duì)哈密瓜提供了更多營(yíng)養(yǎng)。不同處理的氮磷鉀的含量隨時(shí)間的變化而變化的趨勢(shì)大致相同。綜上所述，復(fù)合微生物菌劑和氨基酸水溶肥的聯(lián)合施用對(duì)改善土壤性質(zhì)具有一定的作用。

表1 不同時(shí)期不同處理下土壤氮磷鉀含量的變化

注：同一行數(shù)據(jù)后的字母代表不同時(shí)期不同處理間的差異顯著性(P<0.05),下同

Note: The lowercase letters in the same line mean significant difference at 0.05 level, similarly hereinafter

2.2 不同時(shí)期不同處理的土壤pH、有機(jī)質(zhì)和線蟲含量變化土壤有機(jī)質(zhì)是土壤固相部分的重要組成成分,能改善土壤的物理性質(zhì), 是土壤肥力的基礎(chǔ)，是衡量土壤肥力的重要指標(biāo)。如表2所示，清水組和處理組與施肥前相比，其pH并沒有顯著變化。在清水組和處理組中，有機(jī)質(zhì)都是下降的，但是處理組的下降幅度小，說明處理組有利于保持土壤有機(jī)質(zhì)。根結(jié)線蟲寄生于作物和蔬菜中，嚴(yán)重影響產(chǎn)量，本研究中，HE組的根結(jié)線蟲和腐生線蟲的數(shù)量都有明顯的下降。對(duì)于清水組HC，在定植期時(shí)腐生線蟲大面積爆發(fā)，數(shù)量較CK組增長(zhǎng)了10倍之多，值得注意的是，同一時(shí)期其有機(jī)質(zhì)含量明顯升高，說明兩者可能具有一定的相關(guān)性；對(duì)于處理組HE，腐生線蟲數(shù)量較CK組只增長(zhǎng)了2倍，有效抑制了腐生線蟲的繁殖，在結(jié)果期，根結(jié)線蟲基本消失?？梢?，復(fù)合微生物菌劑和氨基酸水溶肥聯(lián)合施用后，能有效抑制土壤中線蟲的數(shù)量。

表2 不同時(shí)期不同處理下土壤pH、有機(jī)質(zhì)和線蟲含量的變化

2.3 哈密瓜土壤細(xì)菌群落的測(cè)序序列統(tǒng)計(jì)通過對(duì)土壤樣品進(jìn)行基于16SrRNA的高通量測(cè)序，所有樣品共獲得354 713個(gè)有效序列，基于相似度97%進(jìn)行聚類分析，得到OTUs數(shù)為6 968(表3)。本研究中的6組處理覆蓋度均高于99.7%(表3)，稀疏曲線和香農(nóng)曲線(圖1)趨于平緩，表明不同處理土壤細(xì)菌所測(cè)序列庫(kù)容都可以較好地反映細(xì)菌群落的種類與數(shù)量，基本涵蓋了設(shè)施土壤中所有細(xì)菌種群，說明測(cè)序數(shù)據(jù)充分可靠。

圖1 土壤細(xì)菌的香農(nóng)曲線和稀疏曲線

2.4 不同處理下哈密瓜土壤細(xì)菌的α-多樣性分析表3為依據(jù)細(xì)菌OTUs數(shù)量計(jì)算的各處理土壤細(xì)菌α-多樣性指數(shù)(相似度為97%)。從表3可以看出， HE組土壤細(xì)菌Chao I指數(shù)和Shannon指數(shù)均高于HC組。施肥1個(gè)月后，HE1組Chao I指數(shù)和Shannon指數(shù)均高于HC1處理的；施肥2個(gè)月后， HE2組Chao I指數(shù)和Shannon指數(shù)均高于HC2組，說明施肥處理明顯增加了哈密瓜土壤細(xì)菌多樣性，并且隨著施肥時(shí)間的延長(zhǎng)，這種效果更顯著。

2.5 不同處理下哈密瓜土壤細(xì)菌群落的主成分分析為了比較不同處理下土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異，對(duì)其進(jìn)行主成分分析(PCA)，結(jié)果共提取了2個(gè)主成分，貢獻(xiàn)率分別為58.06%和36.89%(圖2)，施肥處理(HE1和HE2)組與清水處理(HC1和HC2)組圍繞PC1軸完全分開，施肥處理(HE1和HE2)組在PC1軸的負(fù)軸，清水處理(HC1和HC2)組在PC1軸的正軸。說明施肥與清水處理組土壤的細(xì)菌群落數(shù)量差異明顯。此外，在哈密瓜不同的發(fā)育時(shí)期，施肥和清水處理的土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也不一樣，HE1和HE2繞PC2軸完全分開，HC1和HC2也繞PC2軸完全分開，說明哈密瓜在不同的生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期，其土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)也不同，施肥處理增加了土壤細(xì)菌的多樣性。

表3 不同處理下哈密瓜土壤微生物細(xì)菌群落的多樣性分析

2.6 不同處理下哈密瓜土壤細(xì)菌群落組成及相對(duì)豐度分析根據(jù)測(cè)序結(jié)果，樣品土壤細(xì)菌一共來自30門，根據(jù)相對(duì)豐度由高到低，排前十的分別是：Proteobacteria(變形菌門)、Acidobacteria(酸桿菌門)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌門)、Actinobacteria(放線菌門)、Chloroflexi(綠彎菌門)、Nitrospirae(硝化螺旋菌門)、Bacteroidetes(擬桿菌門)、Verrucomicrobia(疣微菌門)、Firmicutes(厚壁菌門)、和Parcubacteria(浮霉菌門)。如圖3所示，變形菌門是第1大門，物種相對(duì)豐度40%以上。其次是酸桿菌門，物種相對(duì)豐度20%左右，與前人研究結(jié)果一致[11-12]。樣品間在門水平上的排列順序沒有差別，但是相對(duì)豐度存在差別，這說明土壤微環(huán)境相對(duì)穩(wěn)定，沒有發(fā)生顛覆性變化。

2.7 綱和目水平上細(xì)菌的相對(duì)豐度分析在綱水平上，細(xì)菌豐度由高到低排前10的分別為Alphaproteobacteria(α-變形菌綱)、Betaproteobacteria(β-變形菌綱)、Gemmatimonadetes(芽單胞菌綱)、Subgroup_6、Blastocatellia、Deltaproteobacteria(δ變形菌綱)、Gammaproteobacteria(丙型變形菌綱)、Thermoleophilia(嗜熱油菌綱)、Acidobacteria(酸桿菌綱)、Solibacteres(擬桿菌綱)(表4)，其中變形菌綱占多數(shù)。與定植期相比，HE2組中α-變形菌綱的相對(duì)豐度降低，HC2組則有所升高；又如芽單胞菌綱，HE組間的相對(duì)豐度下降，而HC組間的相對(duì)豐度上升。變形菌門中包括多種致病菌，如α-變形菌綱中的立克次體目；芽單胞菌綱中包含如腸桿菌科(Enterobacteraceae)、弧菌科(Vibrionaceae)和假單胞菌科(Pseudomonadaceae)等重要的病原菌。因此，變形菌門中這些綱的相對(duì)豐度降低，可能是降低哈密瓜病害的原因之一。

表4 綱水平細(xì)菌菌群組成及其相對(duì)豐度

在目水平上，細(xì)菌相對(duì)豐度排前十的分別為Bacterium(桿菌目)、Sphingomonadales(鞘脂單胞菌目)、Gemmatimonadales(芽單胞菌目)、Nitrosomonadales(亞硝化單胞菌目)、Blastocatellales、Rhizobiales(根瘤菌目)、Myxococcales(黏球菌目)、Rhodospirillales(紅螺菌目)、Xanthomonadales(黃單胞菌目)、Burkholderiales(伯克霍爾德氏菌目)(表5)。亞硝化單胞菌目在硝化作用中起到主要作用，直接影響氮素的利用效率[13]，在HE組中亞硝化單胞菌目相對(duì)豐度升高，在HC組中則下降。黏球菌目產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物化學(xué)結(jié)構(gòu)新穎、具有抗真菌、抗病毒等生物活性[14]。HE組間黏球菌目相對(duì)豐度增長(zhǎng)了22.48%，HC組間則下降了13.02%?？梢?，施用復(fù)合微生物菌劑和氨基酸水溶肥使某些有益菌目的相對(duì)豐度升高，使微生物菌群更有益于哈密瓜的生長(zhǎng)。

表5 目水平細(xì)菌菌群組成及其相對(duì)豐度

2.8 屬水平上細(xì)菌的相對(duì)豐度分析提取相似度97%以上的OTUs 代表序列，應(yīng)用RDP classifier貝葉斯算法進(jìn)行分類學(xué)分析，得出各處理屬水平的細(xì)菌群落組成。從表6可知，相同時(shí)期的不同處理中，HE組中的Pseudomonas(假單胞菌)和Tumebacillus(多粘性芽孢桿菌)相對(duì)豐度均高于HC組；隨著時(shí)間的推移，Paenibacillus(類芽孢桿菌)的相對(duì)豐度在HC組中呈下降趨勢(shì)，在HE組中呈升高趨勢(shì)；HE1組的Bacillus (芽孢桿菌)相對(duì)豐度高于HC1組，HE2組的Bacillus相對(duì)豐度則比HC2組低。Paenibacillus和Tumebacillus的相對(duì)豐度升高，而 Bacillus的相對(duì)豐度減少，可能是由于復(fù)合微生物菌劑和氨基酸水溶肥的施用下，增加了芽孢桿菌中有益菌屬的相對(duì)豐度，減少了有害菌屬的相對(duì)豐度。

表6 屬水平細(xì)菌菌群組成及其相對(duì)豐度

2.9 物種豐度聚類分析圖6為土壤細(xì)菌種上水平上的相對(duì)豐度聚類圖，圖中顏色梯度由藍(lán)色到紅色表示相對(duì)豐度由低到高。主要展現(xiàn)的是優(yōu)勢(shì)物種相對(duì)豐度在各個(gè)樣本之間的差別。由圖6可看出，4個(gè)樣品組中在種的分布上差別明顯。

圖6 細(xì)菌樣品UPGMA聚類樹

3 討 論

分析測(cè)序結(jié)果表明，HE組和HC組間土壤細(xì)菌微生物存在明顯差異，微生物的菌群結(jié)構(gòu)并沒有發(fā)生顛覆性變化，菌群的主要組成是Proteobacteria(變形菌門)和Acidobacteria(酸桿菌門)，在某些菌群相對(duì)豐度上則有所改變。含有致病菌種的變形菌綱相對(duì)豐度降低；某些致病菌目如Burkholderiales的相對(duì)豐度降低；可以與植物共生促進(jìn)植物吸收營(yíng)養(yǎng)的Rhizobiales相對(duì)豐度升高；能夠促進(jìn)消化作用幫助植物吸收氮素的Nitrosomonadales相對(duì)豐度升高；能夠產(chǎn)生有益次生代謝產(chǎn)物的Myxococcales相對(duì)豐度升高等。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，HE組HC組間土壤的理化性質(zhì)發(fā)生了改變。其中，堿解氮含量在HC組定植期明顯下降，而HE組定植期堿解氮含量高于HC組，且在定植期HE組有效磷和速效鉀含量變化并不顯著，但在結(jié)果期HE組和HC組并沒有明顯差別，由此可見，微生物菌劑和氨基酸水溶肥聯(lián)合使用模式可以為哈密瓜提供更多營(yíng)養(yǎng)。值得關(guān)注的是，HE組土壤中線蟲含量無論是在定植期還是結(jié)果期都低于HC組線蟲含量，且在HC組定植期腐生線蟲爆發(fā)時(shí)，HE組仍保持穩(wěn)定狀態(tài)，這對(duì)于減少植物病害具有積極的意義。

綜上所述，復(fù)合微生物菌劑和氨基酸水溶肥的聯(lián)合應(yīng)用，可以改變土壤的理化性質(zhì)[15-16]，提高土壤堿解氮和速效鉀的含量，增加土壤有機(jī)質(zhì)，降低線蟲和數(shù)量，從而改變善土壤營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)；在土壤微生物菌落穩(wěn)定的前提下，增加有益菌的相對(duì)豐度，降低有害菌的相對(duì)豐度，改善土壤微環(huán)境，為防治線蟲病害提供了理論依據(jù)。