潘英文，張 凌，王安石，李佳潼，謝添偉，陳施明，劉福秀，林明光

(?？诤ｊP 熱帶植物隔離檢疫中心，?？?570311)

由于處于非生育期的許多蘭科植物種類間形態(tài)差別很小，僅憑形態(tài)特征較難分類。近年來，遺傳標記技術作為一種物種形態(tài)學分類鑒定手段被廣泛應用于屬間、種間、品種間的分類鑒定和親緣關系的研究中。分子標記RAPD和AFLP技術等主要針對蘭屬原生種、變種、品種間進行有關親緣關系、遺傳多樣性的判斷和分析，除蘭屬外，還涉及了兜蘭屬、萬代蘭屬等。國外學者利用核糖體ITS序列分析蘭花野生種的起源和進化趨勢，國內學者也利用RAPD技術對春蘭等我國傳統(tǒng)蘭花品種進行遺傳變異和親緣關系的研究[1-2]。楊光穗等[3]利用SRAP分子標記技術對8種海南野生蘭屬植物的遺傳多樣性和親緣關系進行分析。ISSR體系也初步用于研究蝴蝶蘭的親緣關系，在石斛屬植物品種鑒定研究中也應用了分子標記技術，但僅僅用于親緣關系的分析，還達不到物種檢測鑒定的技術要求。目前，蘭科植物大多采用DNA條形碼方法如atpF-atpH，rbcL，rpoB，rpoC1，psbA-trnH，matK和核糖體ITS等序列來加以鑒定[4-11]，但缺乏系統(tǒng)性的研究。越來越多的研究結果表明，靠1個片段很難對所有的植物物種進行準確鑒定，針對特定品種采用多個不同的基因片段進行綜合分析鑒定將是今后的主要研究方向。因此，筆者通過對現有序列和數據的比對分析，從前人研究系統(tǒng)發(fā)育的序列中選擇適當片段，并加以組合，同時開發(fā)新的基因片段，旨在建立瀕危蘭科植物DNA條形碼的鑒定體系，為鑒定瀕危蘭科植物提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 材料供試材料來自海口海關熱帶植物隔離檢疫中心種質資源圃保存的瀕危蘭科植物，分別是金釵石斛Dendrobiumnobile，卷萼兜蘭Paphiopedilumappletonianum，春蘭Cymbidiumgoeringiivar.goeringii，矮萬代Vandapumila，云南火焰蘭Renantheraimschootiana，小蘭嶼蝴蝶蘭Phalaenopsisequestris，短序脆蘭Acampepapillosa，香花指甲蘭Aeridesodorata，金線蘭Anoectochilusroxburghii，廣東石豆蘭Bulbophyllumkwangtungense，三褶蝦脊蘭Calanthetriplicata，牛角蘭Ceratostylishainanensis，短序隔距蘭Cleisostomastriatum，流蘇貝母蘭Coelogynefimbriata，扇脈杓蘭Cypripediumjaponicum和節(jié)莖石仙桃Pholidotaarticulata。選取植株葉片為材料，每植株采集2～3片葉，放入已編號的封口袋中并立即拿回實驗室放入-70 ℃冰箱內貯存。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.2 DNA提取方法采用改良CTAB法[12]提取DNA。使用Thermo Nanodrop 2000核酸分析儀測定提取的DNA樣品230，260，280 nm處的光吸收值，根據OD260/OD280和OD260/OD230的比值確定DNA純度。取5 μL樣品DNA加上Loading buffer后，使用w=1%瓊脂糖凝膠，在0.5×TBE緩沖液中，3 V·cm-1恒壓電泳1～2 h(Power PAC3000電泳儀，BIO-RAD)。根據電泳結果檢測DNA質量。

1.3 引物設計根據已知蘭科植物的ITS，matK和psbA-trnH序列，利用其保守位點和變異位點，用 Primer Premier 5軟件，設計蘭科植物的通用引物序列，引物序列見表1。

表1 PCR反應引物序列

1.4 PCR反應體系優(yōu)化PCR反應體系：10 μL 2×PrimeStar Max premix( TaKaRa), 0.4 μmol·L-1引物, 6～10 mg·L-1模板DNA, 用ddH2O補充至20 μL。反應程序：94 ℃預變性8 min; 94 ℃變性45 s，48～58 ℃(溫度變化梯度2 ℃)退火45 s，72 ℃延伸1 min，35個循環(huán); 72 ℃延伸6 min，4 ℃保存。擴增產物用w=1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以DL2000 marker ( TaKaRa) 為參照，凝膠成像系統(tǒng)下觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 PCR反應體系優(yōu)化從圖1可知，ITS序列PCR擴增退火溫度為54 ℃時，擴增條帶清晰，亮度較高，穩(wěn)定性好。從圖2～3可知，matK和psbA-trnH序列PCR擴增退火溫度為50 ℃時，擴增條帶清晰，亮度較高，穩(wěn)定性好。退火溫度過低時，非特異結合增加，容易產生彌散狀背景，降低測序效率。但過高時，引物與模板又不易結合，PCR 反應效率降低，目標條帶亮度降低。

2.2 PCR擴增和檢測從圖4～6可知，使用優(yōu)化后的PCR反應體系對蘭科16個代表屬的ITS，matK和psbA-trnH序列進行擴增，擴增條帶清晰，亮度較高，穩(wěn)定性好，均獲得理想帶型。PCR 擴增效率和測序效率均較高，除ITS 的測序效率為98.7%，其他片段的擴增和測序效率均為100%。片段長度方面，psbA-trnH的長度最短，為624～641bp，其次是ITS，為716～735 bp，matK 最長，為1 195～1 220 bp。該反應體系穩(wěn)定可靠，能滿足DNA條形碼檢測鑒定的實驗要求。

圖4 ITS引物的PCR擴增結果

1.金釵石斛；2卷萼兜蘭；3.春蘭；4.矮萬代；5.云南火焰蘭；6.小蘭嶼蝴蝶蘭；7.短序脆蘭；8.香花指甲蘭；9. 金線蘭；10. 廣東石豆蘭；11. 三褶蝦脊蘭；12. 牛角蘭；13. 短序隔距蘭；14. 流蘇貝母蘭；15. 扇脈杓蘭；16. 節(jié)莖石仙桃

Fig.4 Results of PCR amplification by primer ITS

1.Dendrobiumnobile; 2.Paphiopedilumappletonianum; 3.Cymbidiumgoeringiivar.goeringii;4.Vandapumila; 5.Renantheraimschootiana; 6.Phalaenopsisequestris; 7.Acampepapillosa; 8.Aeridesodorata; 9.Anoectochilusroxburghii; 10.Bulbophyllumkwangtungense; 11.Calanthetriplicata; 12.Ceratostylishainanensis; 13.Cleisostomastriatum; 14.Coelogynefimbriata; 15.Cypripediumjaponicum; 16.Pholidotaarticulata

圖5 matK引物的PCR擴增結果

1.金釵石斛；2卷萼兜蘭；3.春蘭；4.矮萬代；5.云南火焰蘭；6.小蘭嶼蝴蝶蘭；7.短序脆蘭；8.香花指甲蘭；9. 金線蘭；10. 廣東石豆蘭；11. 三褶蝦脊蘭；12. 牛角蘭；13. 短序隔距蘭；14. 流蘇貝母蘭；15. 扇脈杓蘭；16. 節(jié)莖石仙桃

Fig.5 Results of PCR amplification by primer matK

1.Dendrobiumnobile; 2.Paphiopedilumappletonianum; 3.Cymbidiumgoeringiivar.goeringii;4.Vandapumila; 5.Renantheraimschootiana; 6.Phalaenopsisequestris; 7.Acampepapillosa; 8.Aeridesodorata; 9.Anoectochilusroxburghii;10.Bulbophyllumkwangtungense;11.Calanthetriplicata; 12.Ceratostylishainanensis; 13.Cleisostomastriatum; 14.Coelogynefimbriata; 15.Cypripediumjaponicum; 16.Pholidotaarticulata

圖6 psbA-trnH引物的PCR擴增結果

1.金釵石斛；2卷萼兜蘭；3.春蘭；4.矮萬代；5.云南火焰蘭；6.小蘭嶼蝴蝶蘭；7.短序脆蘭；8.香花指甲蘭；9. 金線蘭；10. 廣東石豆蘭；11. 三褶蝦脊蘭；12. 牛角蘭；13. 短序隔距蘭；14. 流蘇貝母蘭；15. 扇脈杓蘭；16. 節(jié)莖石仙桃

Fig.6 Results of PCR amplification by primer psbA-trnH

1.Dendrobiumnobile; 2.Paphiopedilumappletonianum; 3.Cymbidiumgoeringiivar.goeringii;4.Vandapumila; 5.Renantheraimschootiana; 6.Phalaenopsisequestris; 7.Acampepapillosa; 8.Aeridesodorata; 9.Anoectochilusroxburghii; 10.Bulbophyllumkwangtungense; 11.Calanthetriplicata; 12.Ceratostylishainanensis; 13.Cleisostomastriatum; 14.Coelogynefimbriata; 15.Cypripediumjaponicum; 16.Pholidotaarticulata

3 討 論

擴增成功率是DNA條形碼應用的主要限制因素，蘭科植物中間變異類型極其豐富，容易受到反應條件變化的影響，增加了蘭科植物種內和種間遺傳距離的重疊程度，導致其識別效率和擴增成功率下降，因此，對其PCR反應條件進行摸索和優(yōu)化十分必要。引物的優(yōu)劣直接關系到 PCR擴增的特異性及成功與否，退火溫度是影響PCR 反應的關鍵因素，退火溫度的高低對DNA條形碼鑒定基因序列擴增的帶型和背景深淺有明顯的影響。本實驗采用國際上通用的蘭科植物DNA條形碼基因ITS，matK和psbA-trnH序列的變異位點和保守位點設計引物，并利用它對蘭科16個代表屬的DNA條形碼鑒定體系進行優(yōu)化，取得了較好的效果。DNA 條形碼技術在實際應用中尚存在許多問題需要解決，包括DNA條形碼基因的選擇以及種內和種間變異范圍界定。目前，還未見任何一個單一序列能完全鑒別出不同類型的蘭科植物。在本實驗的反應體系和條件下獲得的目的條帶清晰、明亮，可作為鑒別瀕危蘭科植物物種的DNA 條形碼組合。