趙苗妙 元沙沙 李 奇 盧 晶 黃海霞 楊金奎

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100730；2. 糖尿病防治研究北京市重點實驗室, 北京 100730；3. 北京市糖尿病研究所，北京 100730；4. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京潞河醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 101149；5. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理與病理生理學(xué)系，北京 100069；6. 首都醫(yī)科大學(xué)代謝紊亂相關(guān)心血管疾病北京市重點實驗室，北京 100069)

血糖濃度升高可以促進人和嚙齒動物胰島β-細胞分泌胰島素，傳統(tǒng)觀點認為其機制為葡萄糖進入β細胞后，經(jīng)過三羧酸循環(huán)代謝，胞內(nèi)ATP/ADP比值升高，阻斷了ATP敏感的K+通道(KATP)，這個關(guān)鍵通道的關(guān)閉導(dǎo)致膜去極化，觸發(fā)了電壓依賴性Ca2+離子通道開放[1]，Ca2+內(nèi)流進入胞內(nèi)，胞質(zhì)Ca2+的上升觸發(fā)胰島素分泌[2]。在動作電位后期，胰島β-細胞膜上的電壓門控鉀離子通道(voltage-gated potassium channel, Kv)開放，向胞外排出K+，使細胞膜復(fù)極化，致使電壓依賴性Ca2+離子通道關(guān)閉，胰島素分泌停止[3-4]。可見，胰島素分泌量與胰島β-細胞的電活動密切相關(guān)，對離子通道的調(diào)控可調(diào)節(jié)胰島素的分泌。目前已大量應(yīng)用于臨床治療糖尿病的磺脲類藥物的作用位點就是KATP通道的磺脲素類受體(sulfonylurea receptor， SUR)亞基[5-6]，但是，直接抑制KATP電流的后果是產(chǎn)生不依賴血糖濃度的胰島素釋放，而這也導(dǎo)致了磺脲類藥物在臨床應(yīng)用中的常見不良反應(yīng)：低血糖。

胰島β-細胞有眾多電壓門控鉀離子通道(Kv)，它們的激活依賴于KATP通道的關(guān)閉引起的細胞膜電位去極化，然而胰島β-細胞中的Kv的組成成分尚不清楚。本課題組的研究[7]顯示Kv家族中的ether-a-go-go相關(guān)基因(ether-a-go-gorelated gene，ERG)通道在糖尿病的發(fā)生中發(fā)揮了重要的作用。為揭示ERG對胰島素分泌的影響，本課題組在前期工作中構(gòu)建了ERG全身基因敲除小鼠，發(fā)現(xiàn)血漿胰島素濃度增加。本文通過比較相同背景下的野生型及敲除型小鼠胰島β-細胞的電生理表型，以及小鼠體內(nèi)糖耐量表型，探究ERG通道在胰島素分泌過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

RPMI-1640培養(yǎng)基(不含L-谷氨酸，不含丙酮酸鈉)、胎牛血清、青-鏈霉素均購自美國Gibco公司。記錄鉀離子電流的電極內(nèi)液成分包括：KCl 130 mmol/L、NaCl 10 mmol/L、MgCl22 mmol/L、CaCl21.3 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、MgATP 1 mmol/L (用KOH調(diào)節(jié)pH值至7.3)；電極外液成分包括:NaCl 125 mmol/L、KCl 10 mmol/L、MgCl22 mmol/L、CaCl22 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、D-glucose 5.6 mmol/L (用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4)。記錄動作電位的電極內(nèi)液成分包括：KCl 138 mmol/L、NaCl 10 mmol/L、MgCl21 mmol/L、HEPES 10 mmol/L、EGTA 10 mmol/L、MgATP 1 mmol/L (用KOH調(diào)節(jié)pH值至7.3)；電極外液成分包括:NaCl 130 mmol/L、KCl 5 mmol/L、MgCl21 mmol/L、CaCl22.5 mmol/L、HEPES 20 mmol/L、D-glucose 2.8 mmol/L (用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.4)。MgATP、EGTA、HEPES、D-glucose購自美國Sigma公司，膠原酶P購自美國羅氏公司，其余未特殊注明者為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 儀器與設(shè)備

EPC-10膜片鉗放大器購自德國HEKA公司；MP-285型三維操縱儀購自美國Sutter 公司；TE2000-U型倒置相差顯微鏡購自日本Nikon公司；Narishige Model PB-7電極拉制儀購自日本Narishige公司；BF150-110-10型玻璃微電極購自美國Sutter公司；Pulse8. 8數(shù)據(jù)采集軟件購自德國HEKA公司；Minianalysis V6.02數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換軟件，pCLAMP9.2數(shù)據(jù)分析軟件購自美國Axon公司；血糖儀及血糖試紙購自美國強生公司。

1.3 實驗方法

電生理實驗：頸脫臼法處死小鼠，經(jīng)胰管注入500 U/mL膠原酶P溶液，37 ℃水浴消化25 min，在體視鏡下用口吸管分離胰島至完全培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。第二天用胰蛋白酶溶液消化胰島至單個細胞，用培養(yǎng)基重懸后接種于多聚賴氨酸處理的35 mm培養(yǎng)皿中。鏡下通過細胞大小選取β-細胞，通過細胞電容值進行驗證[8]。膜片鉗實驗采用全細胞記錄模式。玻璃微電極在充灌電極內(nèi)液后測得電極電阻2.5～5.0 MΩ，符合全細胞記錄使用條件。高阻封接成功后電阻1～2 GΩ。采用負壓吸引方式破膜，破膜后電阻500～600 MΩ。實驗均在室溫25～28℃條件下完成。

動物實驗：選擇5周齡，性別匹配的野生型(wild type, WT)與ERG基因敲除型(knockout, KO)小鼠，實驗前空腹8 h以上，經(jīng)腹腔注射2 g/kg葡萄糖溶液，分別在空腹、注射后15、30、60、120 min經(jīng)尾靜脈取血測量血糖值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ERG基因敲除鼠胰島β-細胞鉀離子電流減低

將胰島β-細胞膜電位鉗制在-70 mV、時長0.5 s，后予-70～+70 mV、時長0.5 s的系列去極化刺激，階躍為10 mV，最后恢復(fù)至靜息電位-70 mV，時長0.5 s，詳見圖1A?？捎^察到隨電壓升高呈現(xiàn)先迅速升高后上升延緩的電壓依賴性鉀離子電流(Kv)的總和。各電壓下鉀離子電流的穩(wěn)態(tài)值大小反映了該電壓下鉀離子通道開放的程度，結(jié)果顯示所記錄到的Kv電流具有弱的內(nèi)向整流性特性。在該刺激條件下，KO組胰島β-細胞Kv電流較WT組Kv降低，詳見圖1B、C。為排除細胞大小對實驗的影響，分別以各電壓下Kv電流的密度pA/pF對測試電壓做I-V曲線，詳見圖2A。發(fā)現(xiàn)當測試電壓高于0 mV后，KO組電流較WT組有下降趨勢，0 mV: WT組為(34.88±5.263)pA/pF, KO組為(22.1±2.828)pA/pF(P=0.091 7)；測試電壓達40 mV后，兩組電流幅度差異有統(tǒng)計學(xué)意義， WT組為(103.4±11.95)pA/pF, KO組為(65.94±9.04)pA/pF(P<0.05);70 mV: WT組為(138.1±17.68)pA/pF, KO組為(86.24±13.54)pA/pF(P<0.05)，詳見圖2B、C、D。計算各測試電壓下KO組和WT組Kv電流幅度比值可知，ERG鉀通道電流約占全部Kv的37.8%。

圖1 WT和KO兩組小鼠原代培養(yǎng)胰島β-細胞鉀離子電流的比較Fig.1 Comparison of potassium currents in primary cultured pancreatic β-cells between WT and KO

A: voltage clamp protocol;B: representative voltage-dependent K+(Kv) currents of WT;C: representative Kv currents of KO;WT: wild type;KO: knockout.

圖2 兩組小鼠胰島β-細胞鉀電流的I-V曲線及相關(guān)標化數(shù)據(jù)比較Fig.2 I-V curve and the normalized data of potassium currents in pancreatic β-cells in the two groups of mice

A: I-V curve of Kv currents of the two groups of mice (8 cells from 3 WT mice; 5 cells from 3 KO mice);B: summary of the mean current density of Kv channels at 0 mV;C: summary of the mean current density of Kv channels at +40 mV;D: summary of the mean current density of Kv channels at +70 mV;*P<0.05vsWT group;WT: wild type;KO: knockout.

2.2 ERG基因敲除鼠胰島β-細胞動作電位時程延長

記錄一過性動作電位，發(fā)現(xiàn)KO組動作電位時程較WT組延長，詳見圖3A。計算從電流刺激開始時間點到復(fù)極化至90%的時間點距離，作為動作電位時程90(action potential duration 90%，APD90)。KO組(13.96±0.31)ms APD90較WT組(9.50±0.61)ms明顯延長，但兩組靜息電位[(-60.50±2.47)mVvs(-61.00±2.27)mV]及動作電位幅度[(97.00±6.14)mVvs(91.74±6.20)mV]比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.848，0.610)，詳見圖3B、C、D。

2.3 ERG基因敲除鼠腹腔注射葡萄糖耐量實驗血糖值更低

高糖刺激后，誘發(fā)胰島β-細胞產(chǎn)生動作電位，促使胰島素囊泡分泌。動作電位時程長短與胰島素分泌多少密切相關(guān)。筆者在小鼠體內(nèi)進行腹腔注射葡萄糖耐量實驗，注射葡萄糖后60 min，KO組小鼠血糖較WT組小鼠血糖值降低，至注射后120 min時差異有統(tǒng)計學(xué)意義，WT組為(24.00±3.19)mmol/L, KO組為(13.26±4.04)mmol/L(P<0.05),詳見圖4。本結(jié)果證實了KO組小鼠擁有更好的糖耐量功能低。

圖3 兩組小鼠胰島β-細胞動作電位及相關(guān)標化數(shù)據(jù)的比較Fig.3 Action potential curve and the normalized data of potassium currents in pancreatic β-cells in the two groups of mice

A: action potential of mouse pancreatic β-cells;B: 90% of action potential duration of WT and KO (6 cells from 3 WT mice; 4 cells from 3 KO mice);C: action potentials magnitude of WT and KO;D: resting membrane potential of WT and KO；* *P<0.01vsWT group;WT: wild type;KO: knockout.

圖4 兩組小鼠胰島腹腔注射葡萄糖耐量實驗Fig.4 Intra-peritoneal glucose tolerant test in the two groups of mice.

*P<0.05vsWT group;WT: wild type;KO: knockout.

3 討論

本研究通過比較KO鼠與WT型小鼠胰島β-細胞電生理特性，證實了ERG敲除鼠電壓門控鉀離子電流顯著減低，說明ERG通道是組成Kv的重要離子通道成分，約占全部Kv的37.8%。電壓門控鉀離子電流在胰島β-細胞復(fù)極化過程中發(fā)揮主要作用，在電流鉗模式下，給予細胞500 pA，50 ms電流刺激[9]，記錄一過性動作電位，發(fā)現(xiàn)KO鼠胰島β-細胞動作電位時程明顯延長，但靜息電位及動作電位幅度較WT組無明顯變化，說明ERG通道在調(diào)節(jié)動作電位時程中發(fā)揮重要作用，這同其在其他組織，如心肌細胞中，幫助細胞復(fù)極化的作用相一致[10-11]。最后，在腹腔注射葡萄糖耐量實驗中，KO鼠的血糖較WT組血糖降低，間接說明了KO組小鼠胰島素分泌水平更高，因而高糖刺激后，KO組血糖濃度較，電壓門控鉀離子電流在胰島β-細胞復(fù)極化過程中發(fā)揮主要作用，在電流鉗模式下，給予細胞500 pA，50 ms電流刺激[9]，記錄一過性動作電位，發(fā)現(xiàn)這說明ERG通道通過影響胰島素分泌，而在調(diào)節(jié)血糖濃度中發(fā)揮了重要的作用。

ERG通道是可興奮細胞膜上內(nèi)向整流鉀離子通道的重要組成部分，存在于心肌、胰腺、腸道等多種細胞當中，近期的研究[12]表明，ERG通道對于血糖的調(diào)節(jié)發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，但是其確切的分子機制尚不得而知。本課題組的研究結(jié)果表明，β-細胞膜上的ERG通道可引起β-細胞動作電位時程的延長，進而增加胰島素的分泌量[13]，這也同本研究中動物體內(nèi)KO鼠的血糖濃度更低的結(jié)果相一致。

值得一提的是，ERG通道的開放發(fā)生于KATP通道關(guān)閉之后，而KATP的關(guān)閉依賴于體外血糖濃度的上升，由此可知，ERG通道的作用間接依賴于體外血糖濃度的上升。

迅速增多的糖尿病患者正在成為一個重要的健康問題，在中國影響了1.144億人，居全球第一[14]。伴隨著肥胖的發(fā)病率增加，2型糖尿病在未來很可能變得更加普遍。它嚴重影響生命質(zhì)量并造成大量患者死亡，同時消耗了過多的公共衛(wèi)生保健系統(tǒng)資源。經(jīng)典磺脲類降糖藥的致低血糖不良反應(yīng)使得臨床醫(yī)生在用藥時需要嚴格掌控劑量，而這也有賴于長年的臨床經(jīng)驗積累。研發(fā)新型不產(chǎn)生低血糖風(fēng)險的口服降糖藥的任務(wù)至關(guān)重要。而本研究的結(jié)果表明，ERG通道可作為一種新型的糖尿病治療靶點，抑制ERG通道鉀離子電流可產(chǎn)生依賴于血糖的降糖作用，不增加低血糖的風(fēng)險。這為今后研發(fā)新型降糖藥物提供了分子機制基礎(chǔ)，也為將電壓門控鉀離子通道(Kv)作為降糖藥物靶點提供了依據(jù)，為新藥研發(fā)打開了新思路。

感謝首都醫(yī)科大學(xué)中心實驗室機能學(xué)研究平臺在膜片鉗實驗中給予的支持。