向紅英，蘭小松，呂延成

(遵義醫(yī)學(xué)院珠海校區(qū) 生物化學(xué)教研室，廣東 珠海 519040)

Ⅱ型單純皰疹病毒(herpes simplex virus 2，HSV-2)是一種具有包膜的DNA病毒，是造成皮膚、黏膜和神經(jīng)等外胚層慢性感染和經(jīng)常性生殖器潰瘍的主要病毒之一[1]，利用短發(fā)卡RNA(small hairpin RNA,shRNA)表達(dá)載體轉(zhuǎn)入哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生小干擾RNA(small interference RNA,siRNA)可以干擾HSV-2基因的表達(dá)[2-5]。本研究利用帶有多個(gè)啟動子的表達(dá)質(zhì)粒，針對HSV-2的UL27和UL54構(gòu)建了一種可同時(shí)表達(dá)雙短發(fā)卡RNA(Duo-shRNA)的重組載體，通過與單-shRNA重組表達(dá)載體進(jìn)行比較，探討其對HSV-2病毒復(fù)制的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 HSV-2333病毒株標(biāo)準(zhǔn)品購于廣州博特生物技術(shù)公司，人胚腎293細(xì)胞株(HEK293)和E.coliDH5α由本校區(qū)生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供，帶有多個(gè)啟動子的pGenesil10-3p質(zhì)粒(見圖1)及用于表達(dá)shRNA的寡核苷酸鏈由武漢市淅瑪生物技術(shù)有限公司提供并進(jìn)行連接構(gòu)建。 限制性內(nèi)切酶BbsI、BamH I和PstI、TRIzol試劑購自日本Takara公司，SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購自日本Toyobo公司，新生牛血清購自中國杭州四季青公司，質(zhì)粒小量提取試劑盒購自中國杭州愛思進(jìn)生物技術(shù)有限公司，HSV-2 gB和ICP27抗體分別購于美國Santa Cruz Biotechnology公司和Abcam公司，Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒和DMEM分別購自美國Invitrogen公司和Gibco公司。

主要儀器有產(chǎn)自中國蘇州凈化設(shè)備廠的YJ-1450型醫(yī)用凈化工作臺，德國徠卡公司的Elx-800型全自動酶標(biāo)儀，德國eppendorf公司的5810R臺式冷凍離心機(jī)及美國SHEL公司的CO2培養(yǎng)箱等。

圖1 pGenesil10-3p質(zhì)粒結(jié)構(gòu)

1.2 方法

1.2.1 HSV-2UL27、UL54干擾靶位點(diǎn)的選擇和shRNA表達(dá)載體的構(gòu)建 從GenBank上檢索HSV-2(NC_001798)UL27和UL54編碼序列，參照shRNA設(shè)計(jì)原則，對其保守區(qū)域序列進(jìn)行篩選，合成干擾靶序列，采用pGenesil10-3p質(zhì)粒分別構(gòu)建表達(dá)單、雙shRNA的表達(dá)載體。另構(gòu)建兩條不干擾任何基因的隨機(jī)序列作為陰性對照組(Negative control,NC)。選擇的干擾基因靶序列及構(gòu)建的質(zhì)粒表達(dá)載體(見表1)。

表1反義靶點(diǎn)的DNA模板序列

序列名稱序列 靶點(diǎn)UL27-shRNAGAACCATGTTGGTGACCTTGG75-95UL54-shRNAGCGTGGTGCAAGATGTGCATT1081-1101Duo-shRNAGAACCATGTTGGTGACCTTGGGCGTGGTGCAAGATGTGCATTNC-shRNAGTATGACAACAGCCTCAAGTGTATGACAACAGCCTCAAGGRandom sequence

1.2.2 HEK293細(xì)胞的轉(zhuǎn)染 HEK293在37 ℃，5% CO2條件下，在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM完全培養(yǎng)液中按常規(guī)方法進(jìn)行培養(yǎng)(下同)。取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于24孔培養(yǎng)板中(每孔約4×104～5×104個(gè)細(xì)胞)。實(shí)驗(yàn)分為NC-shRNA(陰性對照組)、空載體(空白對照組)和干擾組；干擾組包括：單干擾組(UL27-shRNA和UL54-shRNA組)、單干擾聯(lián)合組(UL27-shRNA+UL54-shRNA)和Duo-shRNA組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24 h至細(xì)胞生長至一定豐度后，分別取上述構(gòu)建的單、雙shRNA表達(dá)質(zhì)粒配制質(zhì)粒轉(zhuǎn)染混合物(質(zhì)粒與Lipofectamin2000比為0.8 μg：2 μL)，每孔細(xì)胞中加入100 μL質(zhì)粒轉(zhuǎn)染混合物后再培養(yǎng)48 h，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況。

1.2.3 HEK293細(xì)胞接種病毒 HSV-2在HEK293中進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，收集病毒并用終點(diǎn)滴定法檢測病毒滴度，HSV-2的滴度用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(TCID50)表示。1.2.2中的轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，去掉細(xì)胞上清后加入TCID50為10-5.25/0.1 mL的病毒懸液100 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h后去掉病毒液，后加入2% DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，48 h后收集細(xì)胞上清液進(jìn)行病毒滴度檢測，收集細(xì)胞提取總RNA和總蛋白進(jìn)行mRNA和靶蛋白分析。

1.2.4 子代病毒滴度的測定和細(xì)胞存活率檢測 收集各孔細(xì)胞培養(yǎng)上清液，同上用終點(diǎn)滴定法測定上清病毒滴度并計(jì)算各組TCID50，剩余的細(xì)胞用MTT法測定細(xì)胞存活率，以檢驗(yàn)表達(dá)的siRNA對HSV-2復(fù)制的抑制效果。

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測靶基因mRNA的表達(dá)水平 抽提細(xì)胞總RNA，用DNase Ⅰ去除非特異性DNA片段并檢測RNA純度和完整性，采用隨機(jī)引物法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。UL27上游引物：5'-CAAAGACGTGACCGTGTCGCAG-3'，下游引物：5'-GCGGTGGTCTCCATGTTGTTCC-3'；UL54上游引物：5'-CCAGGACCCTATCATCGGAACG-3'，下游引物：5'-AGTATTTCAATGAGACCCGCCAT-3'；內(nèi)參GAPDH上游引物：5'- AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3'，下游引物：5'-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3'。引物由上海生物工程公司合成，PCR參數(shù)為：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 15 s；72 ℃ 32 s，共42個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參標(biāo)準(zhǔn)，△△比較法計(jì)算各組UL27和UL54 mRNA的相對表達(dá)量并計(jì)算對靶基因表達(dá)的抑制率。

相對mRNA表達(dá)量 =(Ct靶基因- Ct內(nèi)參)干擾組-(Ct靶基因- Ct內(nèi)參)對照組。

mRNA抑制率(%)=(1-干擾組相對mRNA表達(dá)量/對照組相對mRNA表達(dá)量)×100%。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測gB和ICP27蛋白表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量分析。12% 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，電轉(zhuǎn)移法將電泳蛋白條轉(zhuǎn)至PVDF 膜，加入一抗4 ℃孵育12 h，漂洗后加入二抗，37 ℃作用40 min。用ECL試劑盒對WB條帶進(jìn)行化學(xué)熒光顯色，X線膠片經(jīng)ImageJ圖像分析軟件對蛋白條帶進(jìn)行定量分析。gB和ICP27蛋白表達(dá)量以管家基因表達(dá)的蛋白(GAPDH)為參照計(jì)算。并按如下公式計(jì)算：相對表達(dá)量(%)= 目的條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值×100%。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞上清液中病毒滴度 接種病毒48 h后檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清病毒滴度(見表2)。其中NC-shRNA與空白對照組無差異(P>0.05)，單、雙-shRNA表達(dá)載體與空白對照相比均能使細(xì)胞上清液中的病毒滴度降低(P<0.05)，且單干擾聯(lián)合組(UL27-shRNA +UL54-shRNA)和Duo-shRNA組比單干擾組降低病毒滴度的效果更好(P<0.05)，表明對于雙基因的干擾能夠更有效的抑制HSV-2的復(fù)制，但單干擾聯(lián)合組與雙干擾組之間對于病毒滴度的影響無顯著性差異(P>0.05)。

表2接種48 h后各試驗(yàn)組HSV-2病毒滴度

組別HSV-2 病毒滴度/100 μL空白對照10-6.2±0.3NC-shRNA10-6.3±0.3UL27-shRNA10-3.2±0.3 ?UL54-shRNA10-3.4±0.1 ?UL27-shRNA +UL54-shRNA10-2.0±0.2 ?△#Duo-shRNA10-2.2±0.3 ?△#※

*:P<0.05,與空白對照組相比; △：P<0.05,與UL27-shRNA相比; #：P<0.05,與UL54-shRNA相比; ※：P>0.05,與UL27-shRNA+UL54-shRNA相比。

2.2 細(xì)胞存活率 通過MTT法檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞存活率(見圖2)。NC-shRNA組與空白對照相比無顯著差異(P>0.05)，單、雙-shRNA干擾組與NC-shRNA組相比均有顯著差異(P<0.05)，且干擾聯(lián)合組和Duo-shRNA組的細(xì)胞存活率明顯高于單干擾組(P<0.05)，但干擾聯(lián)合組與Duo-shRNA組比較無顯著差異(P>0.05)。表明采用shRNA干擾技術(shù)能夠提高細(xì)胞的存活率，而且對于雙基因的同時(shí)干擾會更有效。

*：P<0.05,與陰性對照組相比; #：P<0.05,與Duo-shRNA相比; △：P<0.05,與UL27-shRNA,UL54-shRNA相比; ※：P>0.05,與UL27-shRNA+UL54-shRNA。圖2 MTT法測定HEK293細(xì)胞存活率

2.3 靶基因 mRNA的抑制效率 從接種HSV-2病毒48 h后計(jì)算得出各實(shí)驗(yàn)組靶基因mRNA表達(dá)抑制率(見表3)。單、雙-shRNA干擾組與空白對照相比均具有顯著性差異(P<0.05)，表明單、雙-shRNA表達(dá)載體均能在一定程度上干擾其靶mRNA的表達(dá)；且單干擾組對UL27mRNA和UL54 mRNA抑制率明顯低于干擾聯(lián)合組和Duo-shRNA組(P<0.05)，表明對多個(gè)靶基因的干擾能夠在mRNA水平上降低每一個(gè)基因的表達(dá)量；而干擾聯(lián)合組與Duo-shRNA組之間對UL27、UL54 mRNA抑制率無顯著差異(P>0.05)。

表3各試驗(yàn)組UL27、UL54 mRNA抑制率

組別UL27mRNA抑制率(%)UL54mRNA抑制率(%)Blank control——NC-shRNA33UL27-shRNA65?—UL54-shRNA—72?UL27-shRNA+UL54-shRNA85?△81?#Duo-shRNA84?△※88?#※

*：P<0.05,與空白對照組相比；△：P<0.05,與UL27-shRNA相比; #：P<0.05,與UL54-shRNA相比; ※：P>0.05,與UL27-shRNA+UL54-shRNA相比。

2.4 靶基因蛋白表達(dá)水平 采用Western blot檢測UL27編碼的gB蛋白和UL54編碼的ICP27蛋白表達(dá)水平(見圖3～4)。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，

*：P<0.05,與陰性對照組相比；△：P<0.05,與UL27-shRNA相比; #：P<0.05,與UL54-shRNA相比。圖3 Western-blot檢測gB蛋白表達(dá)水平

*：P<0.05,與陰性對照組相比；△：P<0.05,與UL27-shRNA相比; #：P<0.05,與UL54-shRNA相比。圖4 Western-blot檢測 ICP27蛋白表達(dá)水平

各shRNA干擾組與NC-shRNA組相比gB和ICP27蛋白的表達(dá)都明顯降低(P<0.05)，表明無論是對兩個(gè)靶基因還是對其中的任何靶一個(gè)基因干擾，都會影響到靶蛋白的表達(dá)；干擾聯(lián)合組和Duo-shRNA組與單基因干擾組相比，降低靶蛋白的效果更為明顯(P<0.05)，表明雙基因的干擾優(yōu)于單基因的干擾，但干擾聯(lián)合組和Duo-shRNA組之間無顯著差異(P>0.05)。數(shù)值用靶蛋白GAPDH條帶的灰度值表示。

3 討論

實(shí)驗(yàn)利用帶有多個(gè)不同啟動子的框架，在hU6啟動子后連接針對UL27的shRNA表達(dá)序列，同時(shí)在hH1啟動子后連接針對UL54的shRNA表達(dá)序列，構(gòu)成反式表達(dá)雙shRNA的表達(dá)載體質(zhì)粒，構(gòu)建經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞后再感染病毒，通過對細(xì)胞存活率、子代病毒滴度、靶基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達(dá)水平檢測結(jié)果表明，這種串聯(lián)反式雙shRNA的表達(dá)載體，在抑制HSV-2復(fù)制、干擾靶基因的表達(dá)，提高對宿主HEK293細(xì)胞保護(hù)作用方面都明顯優(yōu)于單-shRNA表達(dá)載體，并可以達(dá)到利用兩個(gè)單-shRNA表達(dá)載體相同的干擾效果。雖然利用化學(xué)合成的siRNA導(dǎo)入細(xì)胞或載體介導(dǎo)shRNA的方式產(chǎn)生RNAi[6-7]取得不錯(cuò)的效果，但對病毒成功實(shí)施RNAi的關(guān)鍵是如何使細(xì)胞內(nèi)的siRNA具有長期持久的作用以及對病毒基因發(fā)揮有效的干擾作用，然而化學(xué)合成的siRNA 所致的基因沉默具有暫時(shí)性的特點(diǎn)，使其在抑制病毒復(fù)制應(yīng)用上受到一定限制。而使用shRNA序列的表達(dá)載體就能克服這一缺點(diǎn)，shRNA轉(zhuǎn)人細(xì)胞后在Dicer酶作用下轉(zhuǎn)化成siRNA，此方法持續(xù)時(shí)間長，但通過產(chǎn)生單個(gè)shRNA的方式對病毒的單個(gè)基因?qū)嵤└蓴_，很難完全抑制病毒的復(fù)制[3]。因此提高siRNA對病毒基因的干擾效率，可能的途徑之一是對病毒多個(gè)靶基因同時(shí)實(shí)施干擾，針對病毒不同的靶基因構(gòu)建多個(gè)shRNA表達(dá)載體，然后同時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞，表達(dá)產(chǎn)生不同的siRNA。這種由多個(gè)shRNA表達(dá)載體實(shí)施的聯(lián)合干擾作用可以有效抑制病毒的增值[8]，但該過程需要構(gòu)建不同的shRNA重組表達(dá)載體，并經(jīng)過多步轉(zhuǎn)染，操作繁瑣，而且質(zhì)粒上攜帶的綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)具有的“毒性效應(yīng)”可導(dǎo)致細(xì)胞死亡率增加[9-10]。

因此實(shí)施多靶位點(diǎn)RNAi具有一定的優(yōu)勢[11]，利用多啟動子的表達(dá)載體對病毒進(jìn)行多靶點(diǎn)的基因干擾能夠達(dá)到多基因干擾的目的，不僅能夠提高干擾效率，有效抑制病毒復(fù)制，保護(hù)宿主細(xì)胞，同時(shí)具有操作簡便易行的特點(diǎn)。雖然現(xiàn)在對這種多基因干擾中病毒基因之間的相互作用和影響的機(jī)制還不完全清楚，但它可能成為抑制病毒復(fù)制的一種有效方法。

綜上所述，本文利用雙啟動子的方法構(gòu)建了針對HSV-2的UL27和UL54的shRNA質(zhì)粒表達(dá)載體。并比較了雙shRNA表達(dá)載體和UL27-shRNA+UL54-shRNA聯(lián)合介導(dǎo)的雙基因干擾、UL27-shRNA和UL54-shRNA介導(dǎo)的單基因干擾對抑制HSV-2病毒靶基因mRNA表達(dá)水平以及病毒在HEK293細(xì)胞中增殖。結(jié)果表明雙shRNA對HSV-2病毒的抑制效率較單基因干擾好，同時(shí)解決了雙載體雙基因介導(dǎo)基因沉默在轉(zhuǎn)染細(xì)胞后可能出現(xiàn)的載體數(shù)量上的差異和均一性問題。