周小仙，陳澤慧,2，陳安林，董澤令，楊 歡，周 婷，陳先戀，劉清亮

(1.遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗科，貴州 遵義 563099；2.遵義醫(yī)學(xué)院 檢驗醫(yī)學(xué)院臨床微生物免疫教研室，貴州 遵義 563099)

羊布魯菌是布魯菌屬中最常見、毒性最強(qiáng)、病情最嚴(yán)重的亞種，其感染人體后主要寄生在單核巨噬細(xì)胞內(nèi)，而肝臟又是人體巨噬細(xì)胞最豐富的地方，因此被羊布魯菌感染后可引起肝臟多種形式病變(血清轉(zhuǎn)氨酶的升高、肝臟慢性化膿性炎癥、肉芽腫性炎癥、肝膿腫等)，其發(fā)生率高達(dá)50%[1-2]。臨床上選擇抗菌藥物治療羊布魯菌感染患者時，應(yīng)該考慮肝毒性小且在細(xì)胞內(nèi)具有抗菌活性的藥物[3]。目前，臨床上常選用四環(huán)素、利福平及氨基糖苷類等抗菌藥物治療布魯菌感染患者，但單一抗菌藥物的使用常導(dǎo)致布魯菌感染患者出現(xiàn)服藥時間長、治療效果差、易復(fù)發(fā)的現(xiàn)象。WHO推薦聯(lián)合用藥(多西環(huán)素和利福平聯(lián)用6周、多西環(huán)素和強(qiáng)力霉素聯(lián)用45 d、多西環(huán)素和鏈霉素聯(lián)用21 d)治療布魯菌感染患者[4]。但多西環(huán)素、利福平等抗菌藥物長期服用將會增加藥物毒副作用，尤其是對肝臟的損害。近年來已出現(xiàn)利福平、復(fù)方新諾明對羊布魯菌耐藥的報道[5]，所以迫切需要尋找毒副作用小且不易產(chǎn)生耐藥性的藥物治療羊布魯菌感染患者，尤其是合并肝臟疾病的患者。中藥具有副作用小、不易產(chǎn)生耐藥的優(yōu)勢，部分中藥對肝臟、腎臟還有保護(hù)作用[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，瓜菱對肺炎鏈球菌、淫羊藿對銅綠假單胞菌及肺炎鏈球菌、白芍對鮑曼不動桿菌及肺炎鏈球菌[8]、白芨對金黃色葡萄球菌[9]均具有一定抑菌作用。但這些中藥對羊布魯菌抗菌作用的研究尚未見報道。因此，本研究從具有抗菌作用的中藥中篩選出28種中藥探討其對羊布魯菌的抗菌作用，為臨床布魯菌感染患者治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器及試劑 分析天平FA1004N(深圳市無限量衡器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀RE-2000A(上海亞榮生化儀器廠)，VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定儀(法國梅里埃公司)，DYY-6C型電泳儀(北京六一儀器廠)，98-1-B型電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司)等。

Tritonx-100細(xì)胞裂解液(北京索來寶科技有限公司)，基因組DNA提取試劑盒(美國Sigma公司)，PCR擴(kuò)增試劑盒(上海生工生物公司)，Chromas 2.6.6軟件及NCBI數(shù)據(jù)庫等。

1.2 實驗中藥 瓜蔞、木蝴蝶、木香、姜黃、杜仲、白芨、白芍、紫草、山豆根、鉤藤、黃藥子、豬牙皂、黃柏、女貞子、益母草、連翹、三七、虎杖、百部、菌味、拳參、半夏、龍膽草、玄參、黃精、苦瓜、天冬、厚樸共28種中藥均購自遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房。

1.3 實驗菌株 根據(jù)前期研究結(jié)果，選擇遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床分離的且能成功構(gòu)建布魯菌侵染巨噬細(xì)胞模型的菌株作為研究對象[10]。挑取血瓊脂平板上單個生長菌落，采用VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定儀進(jìn)行生化鑒定。用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取分離細(xì)菌基因組，16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物送北京六合華大基因科技有限公司測序，Chromas 2.6.6軟件分析測序結(jié)果，測序結(jié)果導(dǎo)入NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST同源比對分析實驗菌株的菌種。16S rDNA通用引物序列如下:

27F:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，1492R: 5'-TACGYTACCTTGTTACGACTT-3'。

1.4 制備中藥提取物

1.4.1 制備中藥水提取液 稱取瓜蔞、木蝴蝶、木香、姜黃、杜仲、白芨、白芍、紫草、山豆根、鉤藤、黃藥子、豬牙皂、黃柏、女貞子各10 g，分別放入相應(yīng)圓底燒瓶內(nèi)，用100 mL蒸餾水浸泡30 min，以電熱套加熱煮沸(約80 ℃)，常壓回流3次，每次2 h。收集常壓回流3次后的濾液后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋轉(zhuǎn)濃縮至1 g/mL，置于4 ℃冰箱備用。

1.4.2 制備中藥乙醇或乙酰乙酯提取液 稱取益母草、連翹、三七、虎杖、百部、菌味、拳參、半夏、龍膽草、玄參、黃精、苦瓜、天冬藥材各10 g，分別放入相應(yīng)圓底燒瓶內(nèi)，用100 mL 75%乙醇浸泡30 min，以電熱套加熱煮沸(約80 ℃)，常壓回流3次，每次2 h。收集常壓回流3次后的濾液后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器旋轉(zhuǎn)濃縮至1 g/mL，置于4 ℃冰箱備用。按以上步驟制備厚樸乙酰乙酯提取液，置于4 ℃冰箱備用。

1.5 抑菌試驗 參照2016年CLSI推薦的細(xì)菌藥物敏感性試驗檢測方案M100S測定28種中藥提取物對羊布魯菌的MIC，且每種藥物做3個重復(fù)[11]。細(xì)菌生長質(zhì)量控制以M-H肉湯作為陰性對照，菌液為陽性對照。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌生化與分子生物學(xué)鑒定結(jié)果 實驗菌株經(jīng)VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定儀鑒定為羊布魯菌，可信度為99.9%。該菌株的16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1 500 bp處出現(xiàn)1條特異性條帶(見圖1)。經(jīng)北京六合華大基因科技有限公司測序所得的16S rDNA序列拼接后全長為1 252 bp(見圖2)，在NCBI網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進(jìn)行BLAST比對分析顯示，其與Brucellamelitensis(羊布魯菌)相符，同源性達(dá)到了98%(見圖3)。

M：DNA Marker，A、B、C和D均為實驗菌株16S rDNA PCR產(chǎn)物。圖1 羊布魯菌16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

圖2 羊布魯菌16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果

圖3 羊布魯菌16S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物序列比對結(jié)果

2.2 抑菌試驗結(jié)果 28種中藥提取物抗菌效果最好的是紫草、虎杖、鉤藤，MIC均為15.6 mg/mL，其次是女貞子、山豆根、連翹、黃精、白芍次之，MIC均為31.25 mg/mL；黃藥子、玄參、厚樸、益母草、瓜菱的MIC均為62.5 mg/mL，半夏、黃柏?zé)o抗菌作用(見表1)。

表1 28種中藥提取物對羊布魯菌體外抗菌活性

藥物名稱各種中藥提取物不同質(zhì)量濃度下細(xì)菌生長情況(mg/mL)50025012562.5031.2515.607.80陰性對照陽性對照MIC(mg/mL)紫草Lithospermum erythrorhizon虎杖Polygonum cuspidatum鉤藤Uncaria rhynchophylla女貞子Fructus ligustri lucidi山豆根Radix sophorae tonkinensis連翹Forsythia suspensa黃精Polygonatum sibiricum白芍Cynanchum otophyllum黃藥子Dioscoreaceae玄參Radix scrophulariae厚樸Magnolia officinalis rehd益母草Leonurus artemisia瓜菱Melon rhombus龍膽草Elephantopusscaber百部Stemona japonica菌味Bacterial taste木香Common vladimiria root苦瓜Momordica charantia L.天冬Radix asparagi杜仲Eucommia ulmoides豬牙皂Fructusgleditsiae拳參Polygonum bistorta L.三七Panax notoginseng木蝴蝶Oroxylum indicum姜黃Curcuma longa L.白芨Buddleja alternifolia maxim半夏Pinellia ternata黃柏Cortex phellodendri--------------------------++--------------------++++++++-----------------+++++++++++-------------+++++++++++++++--------++++++++++++++++++++---+++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++----------------------------++++++++++++++++++++++++++++15.6015.6015.6031.2531.2531.2531.2531.2562.5062.5062.5062.5062.50125.00125.00125.00125.00250.00250.00250.00500.00500.00500.00500.00500.00500.00>1000.00 >1000.00

“-”表示無細(xì)菌生長，“+”表示細(xì)菌生長。

3 討論

布魯菌病是由布魯菌進(jìn)入人體后引起的人獸共患乙類傳染病，全球每年新發(fā)病例超過50萬，呈升高趨勢[5]。羊布魯菌屬于高致病性微生物，能在皮膚完好的情況下，通過呼吸道、皮膚黏膜、口腔等各種組織侵入機(jī)體引起致病。本次研究的實驗菌株本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，其對BALB/c小鼠具有較強(qiáng)的毒力作用，其感染后可引起小鼠體重下降，肝臟、脾臟系數(shù)增高，出現(xiàn)脂肪變性、核固縮等的病理組織改變[12]。羊布魯菌致病力強(qiáng)，一旦發(fā)生感染后病情發(fā)展難以控制，嚴(yán)重威脅人類身體健康，已成為急需解決的公共衛(wèi)生問題。臨床上常根據(jù)羊布魯菌生化反應(yīng)、基因及蛋白組成的不同進(jìn)行鑒定，但因單一鑒定方法容易出現(xiàn)錯誤的鑒定結(jié)果，最好采用兩種方法同時進(jìn)行鑒定[13]。而本次研究通過采用VITEK 2 Compact 全自動微生物鑒定儀及16S rDNA基因序列分析均鑒定為羊布魯菌，保證了試驗菌株鑒定結(jié)果的可靠性。

本次研究表明28 種中藥提取物中除半夏、黃柏外，其余對羊布魯菌均有不同程度的抗菌作用。其中紫草、虎杖、鉤藤對羊布魯菌抗菌效果最好；女貞子、山豆根、連翹、黃精、白芍次之；豬牙皂、拳參、三七、木蝴蝶、姜黃、白芨抗菌效果較差。文獻(xiàn)報道紫草主要成分紫草素對金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌菌、白色念珠菌、蠟狀芽孢桿菌、沙門氏菌均具有較好的抗菌作用[14]。此次研究也顯示紫草對羊布魯菌同樣具有較好的抗菌效果，可能與紫草素發(fā)揮抗菌作用相關(guān)。Su等[15]研究發(fā)現(xiàn)，虎杖對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌及甲型鏈球菌等病原菌均具有一定程度的抗菌作用，可能是與虎杖中主要含有蒽醌類、二苯乙烯類、黃酮類、香豆素類以及一些脂肪酸類化合物相關(guān)?；⒄戎蟹蛛x的大黃素、大黃素-8-葡萄糖苷等醌類化合物對金黃色葡萄球菌和肝炎雙球菌也具有一定的抑菌作用[16]。因此，虎杖對羊布魯菌的作用機(jī)制可能是通過上述一種或幾種化合物而發(fā)揮抗菌作用，值得進(jìn)一步研究。鉤藤的主要化學(xué)成分包括生物堿類、黃酮類及萜類等，其中鉤藤堿占了鉤藤總堿的28.9%[17]。江芳等學(xué)者在體外實驗中發(fā)現(xiàn)，鉤藤堿對甲型副傷寒桿菌，福氏痢疾桿菌，鮑式痢疾桿菌等腸道致病菌有一定的抑制作用，且高質(zhì)量濃度的絨毛鉤藤水提物對鼠傷寒沙門氏菌TA98 菌株和TA100 菌株產(chǎn)生毒性損傷[18]。本次研究顯示鉤藤水提物對羊布魯菌有較好的抑菌抗菌效果，推測可能是鉤藤堿發(fā)揮了作用，但仍需進(jìn)一步證實。根據(jù)目前的研究狀況，針對羊布魯菌感染患者，臨床可選用抗菌效果較好的中藥輔以治療，這對減少抗菌藥物長時間使用，避免抗菌藥物的耐藥性及毒副作用的產(chǎn)生具有十分重要的意義，但在最大化提高中藥的治療效果方面，還應(yīng)對其主要成分的抗菌機(jī)制進(jìn)行深入研究。