雷迪 鄭楠薪 隋明星

實驗證據(jù)表明，在可能導致細胞死亡的環(huán)境中，自噬在細胞適應環(huán)境的過程中起主要作用[1-2]。由于經(jīng)過了缺血-再灌注、小動脈血管收縮、毛細血管破壞以及間質(zhì)纖維化等過程，移植腎初期通常處于缺氧狀態(tài)[3]。此外，移植腎臟的炎癥環(huán)境促進釋放危害分子，進而激活體液免疫和細胞免疫。由于自噬主要的激活因素是缺氧和炎癥介質(zhì)，而這二者是腎移植最主要的應激因素[4]，所以自噬一定參與調(diào)節(jié)移植腎的穩(wěn)態(tài)平衡，且自噬的參與程度遠遠高于人類認知，目前并沒有大量的實驗室或臨床證據(jù)[5]。

一、自噬生物學

細胞自噬開始于隔離膜的形成和擴張，然后通過一系列的步驟，包括隔離膜閉合形成自噬體，與溶酶體接觸、融合形成自噬溶酶體，通過溶酶體的酸性水解酶分解、降解包裹的物質(zhì)及其內(nèi)膜，回收形成的產(chǎn)物。自噬可以識別和降解特定的底物，如P62 （sequestosome 1，一種泛素樣結(jié)合蛋白），多泛素化蛋白聚合物，細胞器，代謝產(chǎn)物或外界侵襲的微生物[6]。

自噬體的形成是自噬過程中具有標志性的關(guān)鍵步驟。自噬體膜起源于何處仍然存在爭議，可能的來源包括高爾基復合體、內(nèi)涵體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體和質(zhì)膜。在哺乳動物中，細胞自噬的核心機制至少涉及五組蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)復合物：（1）UNC-51-樣激酶（ULK）1/2復合物是必不可少的誘導蛋白；（2）磷脂酰肌醇3激酶（PtdIns3K）復合物參與囊泡成核；（3）自噬相關(guān)基因跨膜蛋白（ATG9L1）可能促進其他來源的膜形成自噬體；（4）微管相關(guān)蛋白輕鏈3-磷酰胺乙醇胺（LC3-PE）和ATG12-ATG5-ATG16L復合物，這2個共軛系統(tǒng)參與了囊泡的伸長和形成；（5）可能參與介導自噬后期步驟（囊泡融合和內(nèi)容物降解）的蛋白質(zhì)[7-8]。在自噬調(diào)節(jié)機制的上游，有一個復雜的信號網(wǎng)絡(luò)調(diào)控。mTOR信號通路，特別是雷帕霉素靶蛋白復合物1（mTORC1），是自噬的主要調(diào)節(jié)途徑。許多可以通過營養(yǎng)、生長因子和能量等信號激活的信號轉(zhuǎn)導通路，都可以整合并入mTORC1通路參與調(diào)節(jié)細胞自噬[8]。同時一些不依賴mTOR通路的機制也被提出過。需注意自噬通常由多種細胞應激所誘發(fā)，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、缺氧應激、氧化應激、DNA損傷和病原體的侵入。

大多數(shù)情況下細胞自噬是為了維持細胞穩(wěn)態(tài)，而應激誘導的自噬則是為了維持生存而采用的適應性和保護性策略。在代謝應激刺激下，細胞自噬產(chǎn)生氨基酸和脂類以供蛋白和腺苷三磷酸 （adenosine triphosphate，ATP）的合成。自噬可以清除蛋白聚合物、受損的細胞器和細胞內(nèi)的病原體。自噬也減少了DNA損傷和染色體不穩(wěn)定性。盡管自噬對細胞具有保護作用，但自噬也可能導致細胞死亡。然而，自噬并不是在生理或病理條件下直接殺死細胞[9]，雖然過度自噬會導致細胞器大量降解，從而造成損害[10]。

自噬與細胞死亡、生存的關(guān)系非常復雜[11]。自噬與凋亡并不是對立的，反而共用很多相同的調(diào)節(jié)因子。因此自噬與凋亡可以拮抗、合作甚至互相促進，從而調(diào)節(jié)細胞的生存。自噬是否促進細胞死亡仍存在爭議（自噬性細胞死亡）。因為“自噬性細胞死亡”的定義尚未明確，現(xiàn)在認為該定義需滿足以下條件：（1）當細胞死亡時，caspase（半胱天冬氨酸蛋白酶）未被激活；（2）在死亡細胞中自噬過程增加，而不僅是自噬標記物升高；（3）抑制自噬能夠防止細胞死亡。在哺乳動物中[12]，使用多種自噬相關(guān)基因（ATGs）被敲除或更改的小鼠模型，都沒有明確的證據(jù)表明在生理條件下存在自噬性細胞死亡。大多數(shù)實驗顯示，哺乳動物細胞的自噬性細胞死亡需要在體外培養(yǎng)的條件下，并且伴有細胞凋亡缺陷如Bax-/-Bak-/-雙基因敲除[13]。這提示在未經(jīng)基因修飾的哺乳動物細胞中，生理條件下的死亡是伴有自噬而非由自噬引起。

自噬參與動物發(fā)育和細胞分化[14]。值得注意的是，細胞自噬參與了大量疾病的病理生理過程，包括神經(jīng)退行性疾病，癌癥，老化，傳染病和炎癥性疾病，心血管疾病，代謝性疾病，肺部疾病和腎臟疾病[15-16]。

二、受損腎臟中自噬的作用

（一）缺血再灌注損傷

缺血再灌注損傷中存在由冷保存誘導激活的自噬。氧化應激可以上調(diào)自噬調(diào)控因子的表達，包括LC3和Beclin1，并促進LC3依賴ATG-4的磷脂化，使自噬體成熟。利用3-甲基腺嘌呤抑制自噬可以增加小鼠的缺血再灌注損傷，說明自噬可能具有保護作用[17]。腎小管細胞近端和遠端的Atg5缺陷可以導致腎功能受損，并使腎臟更易受到缺血損害，使得線粒體受損累積以及腎小管細胞凋亡和增殖[18-19]。這些結(jié)果在敲除了腎小管ATG7基因的小鼠中得到了證實，該小鼠比野生型小鼠對腎缺血再灌注損傷更敏感[20]?？偟膩碚f，自噬在缺血再灌注損傷中可以維持腎小管上皮細胞的完整性。

（二）缺血應激下的非常規(guī)蛋白分泌

現(xiàn)有的證據(jù)表明，自噬參與細胞間通訊網(wǎng)絡(luò)的建立，特別是在細胞凋亡過程中，自噬調(diào)節(jié)細胞死亡的微環(huán)境和結(jié)果。在應激條件下（如饑餓）常規(guī)的分泌受到抑制（分泌蛋白質(zhì)的經(jīng)典途徑需要N-末端的信號肽，它允許多肽在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)經(jīng)過翻譯后進行逆向易位、折疊和質(zhì)量控制、運輸?shù)礁郀柣w，從而以囊泡形式轉(zhuǎn)運到細胞膜、融合并分泌），而非常規(guī)分泌途徑可能被激活，并成為細胞間通訊的主要模式。目前并不清楚這些非常規(guī)分泌的蛋白和免疫分子是如何釋放到細胞外的。參與自噬的成分，包括LC3，ATG16L1和溶酶體相關(guān)膜蛋白，也可能來自營養(yǎng)缺乏的、自噬體積聚的內(nèi)皮細胞[21]。這個過程依賴于caspase激活，表明細胞凋亡可以促進自噬。人血管內(nèi)皮細胞饑餓條件下釋放的囊泡已被確定與凋亡和自噬有關(guān)[22]。這些囊泡不同于經(jīng)典的凋亡小體，因為它們不含有細胞核成分，并且不依賴Rho關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋蛋白激酶（Rock）1的活化。它們反而含有不同成熟階段的自噬體以及線粒體。這些囊泡也富含危險分子信號、ATP，可能在缺血條件刺激下參與先天免疫的調(diào)節(jié)。

（三）自噬作為缺血再灌注損傷的治療靶點

設(shè)計具有調(diào)節(jié)自噬功能的藥物、并在臨床上用于預防缺血再灌注損傷的最大挑戰(zhàn)是生物靶向藥物的特異性。迄今為止最好的成功藥物是西羅莫司，通過抑制mTORC1來誘導細胞自噬，但是實驗室和臨床證據(jù)表明它會阻礙腎臟功能恢復[23-24]。事實上，移植腎功能延遲恢復與急性腎小管壞死有關(guān)，決定于受損的腎小管上皮細胞進入細胞周期和增殖的能力，而mTOR抑制劑可以抑制細胞的生長，因此降低了細胞的增殖能力[23,25]。其他調(diào)節(jié)自噬藥物也存在同樣的問題，如巴弗洛霉素，氯喹或3-甲基腺嘌呤，它們具有廣泛的生物學效應，不僅調(diào)控自噬，而且也可以加重組織損傷。比如3-甲基腺嘌呤通過抑制I類PI3K信號通路誘導細胞死亡，又能通過抑制Ⅲ類PI3K誘導自噬，進而抑制細胞死亡。故而需要更精確的途徑來微調(diào)自噬。比如多肽類的Tat-beclin1，是自噬蛋白Beclin1的一部分，可以與HIV-1的Nef結(jié)合，可以強效誘導自噬[2]。Tat是種來源于HIV的、輔助病毒進入細胞的蛋白質(zhì)。當與Beclin1融合后，Tat可以使Beclin1不需要經(jīng)過轉(zhuǎn)染即可進入細胞。這種多肽能特異性激活自噬，從而清除蛋白質(zhì)聚合物和病毒，但沒有其他自噬方面的副作用。

三、自噬與免疫抑制藥物

（一）環(huán)孢素A的腎毒性

環(huán)孢素可以誘導腎小管上皮細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[26]。受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激影響的細胞會激活未折疊的蛋白質(zhì)，以減少蛋白負荷并增加初期蛋白折疊，促進細胞保護[27]。最近的證據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可以啟動自噬，具體機制可能包括蛋白激酶RNA樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶和真核起動因子2α，從而調(diào)節(jié)自噬的表達、隔離膜的形成和IRE1激活（JNK和XBP1可能調(diào)節(jié)細胞自噬）。特別是在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激條件下，自噬已被證明能夠減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激和減少細胞死亡[28]。環(huán)孢素誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激可以調(diào)節(jié)自噬。在體外培養(yǎng)的人上皮細胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通過激活自噬以抵抗環(huán)孢素的傷害。如果特異性敲除Beclin1來抑制自噬，那么環(huán)孢素誘導的腎小管細胞的細胞毒性會增強，這表明了自噬可以減輕環(huán)孢素的毒性[29]。大鼠環(huán)孢素腎毒性模型同樣證實，環(huán)孢素增加了腎臟中LC3-Ⅱ和Beclin1的表達，且與劑量相關(guān)。相較于環(huán)孢素組，使用環(huán)孢素聯(lián)合普伐他汀或N-乙酰半胱氨酸降低了尿中8-羥基-2'-脫氧鳥苷濃度，繼而降低了LC3-Ⅱ表達和p62陽性的細胞數(shù)，表明環(huán)孢素A誘導的氧化應激可以激活細胞自噬[30]。

（二）西羅莫司的副作用

西羅莫司用于預防急性排斥反應。西羅莫司通過抑制mTOR信號通路以誘導細胞自噬。西羅莫司不抑制鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶，因此，它缺乏鈣調(diào)磷酸酶抑制劑類的腎毒性資料。在臨床實踐中，西羅莫司最初是作為鈣調(diào)磷酸酶抑制劑的輔助用藥，而現(xiàn)在常用于低腎毒性的藥物方案中。但西羅莫司有一系列的不良事件，包括蛋白尿、系統(tǒng)性炎癥、水腫、皮膚疹、口瘡、肺炎、血脂異常和糖尿病[31]。雖然大部分西羅莫司導致的副作用被認為與抑制mTOR相關(guān)，但確切的機制尚不清楚，自噬對其他mTOR相關(guān)的生物效應（如翻譯的起始和延伸）的影響也不明確。沒有明確的證據(jù)證實自噬導致了這些副作用，但是鑒于mTOR和自噬在足細胞的抵抗應激[32-33]和在調(diào)節(jié)免疫反應[34-35]中的重要地位，可以猜測，通過抑制mTOR通路介導的自噬與這些副作用有關(guān)。但目前證據(jù)并不多。在西羅莫司引起的副作用中，西羅莫司誘導的β細胞損傷可能涉及細胞自噬[36]。這項研究利用了胰島移植小鼠模型，在西羅莫司治療后出現(xiàn)明顯增強的細胞自噬，導致了胰島β細胞受損，使得胰島移植手術(shù)后移植物失功。這些結(jié)果還表明，3-甲基腺嘌呤改善了體外和體內(nèi)的西羅莫司相關(guān)的β細胞失功。雖然這只是初步的、未涉及腎臟移植的研究，仍然可以推測自噬可能直接參與西羅莫司的副作用。

四、自噬和免疫調(diào)節(jié)

自噬調(diào)節(jié)先天免疫和獲得性免疫，并具有明顯相反的調(diào)節(jié)結(jié)果。自噬可以減輕炎癥，自噬能降解蛋白聚合物和變性的線粒體，而這兩者可以加劇氧化應激、激活炎癥[5,37]，同時自噬可以調(diào)節(jié)細胞因子的非常規(guī)分泌；但它又促進T細胞的克隆增殖（為這一過程提供營養(yǎng)），促進胸腺孵育，提供MHC Ⅰ類和Ⅱ類抗原呈遞（以及交叉呈遞）的多肽[38-39]?？偟膩碚f，自噬促進細胞內(nèi)病原體清除。此外，許多觸發(fā)免疫反應的物質(zhì)可以激活細胞自噬，如Toll樣或nod樣受體配體或者炎性細胞因子[37,40]。

自噬在調(diào)控先天性或獲得性免疫功能方面的復雜機制尚未被研究透徹，而這些機制與移植和自身免疫病相關(guān)。最近，自噬在腎移植中的免疫調(diào)節(jié)作用出現(xiàn)爭議[19,41]。比如，ATG5缺陷的小鼠腎臟腎小管，受到缺血再灌注損傷時，與同窩小鼠相比其巨噬細胞浸潤相對較少[19]。這表明，自噬可能抑制無菌性炎癥反應，但不知道這是不是死亡細胞（可以釋放能激活危險受體的細胞內(nèi)容物）減少所致，或者是不是自噬對炎癥的特異性表現(xiàn)。后者這一假說可以由以下觀察到的結(jié)果證實：ATG-5缺陷的腎小管中大量累積變性的線粒體，形成強大的促炎劑[19]。除了缺血性應激，細胞因子的刺激也可以激活腎臟細胞的自噬。干擾素γ是移植腎穩(wěn)態(tài)平衡的主要調(diào)控因子。干擾素γ在炎癥過程中有重要的作用，使得它也與移植特別相關(guān)，影響移植物的存活[42]。自噬和干擾素γ相互作用。干擾素γ通過Beclin1機制在小鼠的免疫和非免疫細胞中促進自噬，而干擾素γ介導的抗菌效果需要自噬參與[43-44]。人腎小管上皮細胞中干擾素γ激活了自噬。干擾素γ誘導色氨酸代謝，從而激活組蛋白乙?；负铣赏ㄓ每刂频鞍?激酶，導致自噬激活劑eIF2a的磷酸化[41]。自噬在干擾素γ作用下會減少分泌炎性細胞因子，這與以前的發(fā)現(xiàn)相一致，即自噬減少了IL-1β的產(chǎn)生，繼而影響了炎癥小體和變性的線粒體的破壞作用[45]。

五、自噬與腎臟移植缺血/再灌注損傷（ischemiareperfusion injury，I/R）

腎臟I/R常常發(fā)生于腎移植手術(shù)及嚴重創(chuàng)傷以后，是腎移植手術(shù)過程中一種常見的臨床病理、生理現(xiàn)象，并成為影響腎移植術(shù)后患者康復及生存率的重要因素[46]?，F(xiàn)已證實，全身組織器官很多都存在I/R現(xiàn)象，而在腎臟移植I/R過程中，腎小管細胞自噬存在的調(diào)控機制有哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信號通路、氧化應激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激、缺氧誘導因子-1α（HIF-1α）及其轉(zhuǎn)錄目標促凋亡線粒體蛋白（BNIP3）、腫瘤抑制基因P53、Unc-51樣自噬激活激酶1 （ULK1）、B淋巴細胞瘤-2基因（Bcl-2）家族蛋白。自噬中的 3 種關(guān)鍵的蛋白復合體，即 mTORC1、ULK1 及 Beclin-1/PI3KⅢ型蛋白復合體調(diào)節(jié)此過程。自噬啟動后，由兩類不同的泛素樣蛋白系統(tǒng)執(zhí)行著自噬體的延長，包括ATG5-ATG12通路和泛素樣微管相關(guān)蛋白1 輕鏈3 （LC3，ATG8）結(jié)合系統(tǒng)。腎臟中的足細胞及近端小管特異性缺失 Atg5或Atg7的小鼠表現(xiàn)出累積錯誤折疊的蛋白質(zhì)和變形的細胞器，說明腎臟中的足細胞及近端小管易被I/R。腎臟I/R 的大鼠實驗模型中顯示受損的腎小管中Beclin-1和LC3的表達升高，缺血的情況下，如果Bcl-2過度表達，自噬將會下降，腎臟受損情況好轉(zhuǎn)；并有研究對GPF-LC3的轉(zhuǎn)基因小鼠進行I/R處理，自噬發(fā)生的同時，腎小管也隨之出現(xiàn)了形態(tài)學的破壞；而對于Bcl-2/GFP-LC3的雙轉(zhuǎn)基因小鼠，自噬的發(fā)生及腎小管形態(tài)學破壞程度均減少[47]。

現(xiàn)已被證實可作為自噬標記物有兩種，Beclin-1是促進自噬發(fā)生的始動因子，LC3-Ⅱ是位于自噬體上的唯一蛋白[48]。研究發(fā)現(xiàn)，丙酮酸乙酯可以抑制I/R，其過程是通過抑制Beclin-1和LC3的表達，減弱自噬的強度，以達到抑制I/ R 的作用[49]。并有研究表示，可溶性晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（sRAGE）作為內(nèi)源性保護物質(zhì)，可抑制I/R引起自噬。亦有研究顯示，靜脈注射飽和氫氣生理鹽水可通過抑制自噬減少I/R[50]。

缺血預處理的過程中，許多內(nèi)源性機制介導保護著腎臟，以免腎臟遭到 I/R，而其機制有抑制細胞凋亡、儲存 ATP、產(chǎn)生促存活細胞因子及抗炎因子。在這期間可誘導自噬發(fā)生，通過促進細胞內(nèi) ATP 形成，以減輕炎癥反應來獲取細胞生存。

六、展望

在移植免疫相關(guān)的細胞自噬資料非常少，但它可以幫助理解免疫相關(guān)過程是如何調(diào)節(jié)的。有很多值得研究的途徑，可以將自噬整合于危險模型，這一模型可以將無菌性炎癥（如I/R）與獲得性免疫聯(lián)系起來。再如，線粒體產(chǎn)生的ATP是一種危險信號，可以激活樹突狀細胞表面的嘌呤受體，且已證實早期凋亡細胞在膜通透性改變之前，需要自噬參與才能釋放ATP[51]。其他還有自噬小體中大分子物質(zhì)如何被處理、消化，抗原呈遞細胞如何修飾免疫多肽，以及修飾后多肽的作用[52]。除了炎癥，自噬在調(diào)節(jié)組織穩(wěn)態(tài)的其它生物學功能也剛剛開始研究，比如纖維化，這是移植腎發(fā)生組織學改變最重要的特征[53]。

如何在臨床實踐中監(jiān)測（診斷和治療）自噬仍有待解決。到目前為止，在人體組織中利用免疫組化方法檢測細胞自噬能力的結(jié)果仍不一致，而且可行性也較差[54]。由于自噬是一個動態(tài)變化的過程，所以必須通過“通量（f l ux）”來計算，并且需要藥物來抑制自噬小體降解，而這種通量幾乎不可能在活檢標本中檢測，因為標本是靜態(tài)的。細胞中出現(xiàn)大量的自噬體不代表自噬體的生物合成被激活，因為溶酶體的降解作用可以被抑制，也會產(chǎn)生大量自噬體。研究自噬機制的最大挑戰(zhàn)是它不是通過轉(zhuǎn)錄來調(diào)控，也沒有直接可用的標記物。潛在可用的標記物，如P62，可以在自噬過程中定量調(diào)節(jié)，但其表達缺乏特異性，除了自噬還有氧化應激等也可以調(diào)節(jié)其表達。