楊國(guó)新 陳夏琴 余輝 黃洪祥 金東偉 程元榮 黃捷

(福建省微生物研究所，福建省新藥(微生物)篩選重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福州 350007)

西羅莫司(也稱雷帕霉素)是一個(gè)多用途的藥物。吸水鏈霉菌FC904[1-3](Streptomyces hygroscopicusFC904)在發(fā)酵過程中除產(chǎn)生主產(chǎn)物西羅莫司外，同時(shí)還合成一些西羅莫司同系物。由于西羅莫司同系物結(jié)構(gòu)與西羅莫司類似，在生產(chǎn)中不易分離，因此成為西羅莫司成品中雜質(zhì)的主要來源。通過分離純化獲得這些西羅莫司同系物，確定它們的化學(xué)結(jié)構(gòu)，一方面將有助于通過優(yōu)化發(fā)酵工藝，降低它們?cè)诎l(fā)酵液中的含量，減少后續(xù)分離純化的成本；另一方面，通過對(duì)這些有關(guān)物質(zhì)的控制，也可降低西羅莫司成品中雜質(zhì)的含量，以便進(jìn)一步提高西羅莫司產(chǎn)品質(zhì)量。在前期研究中，我們已經(jīng)陸續(xù)分離并鑒定了一些西羅莫司同系物[4-7]。本文報(bào)道另一個(gè)西羅莫司同系物FIM-R85的分離純化和結(jié)構(gòu)鑒定。

1 儀器設(shè)備與材料

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

制備型液相色譜儀LC-20(日本島津公司)；高效液相色譜儀LC-2010CHT(日本島津公司)；核磁共振儀Bruker AM-500；Agilent 1100 series LC/MSD Trap；Bruker APEX Ⅲ7.0 TESLAFIMS高分辨質(zhì)譜分析儀。

1.2 材料

西羅莫司發(fā)酵液粗提物(福建科瑞藥業(yè)有限公司提供)；200～300目硅膠(青島永海硅膠有限公司)；乙腈(色譜純)；甲醇(色譜純)；去離子水(本實(shí)驗(yàn)室自制)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 HPLC分析方法

色譜柱：Kromasil C18(5μm, 4.6mm×250mm)；流動(dòng)相：甲醇∶乙腈∶水(70:15:30,V/V/V)；流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：277nm；柱溫：40℃。

2.2 FIM-R85的富集

西羅莫司發(fā)酵粗提液中FIM-R85含量低， HPLC分析其只占1.1%，且出峰時(shí)間與西羅莫司接近(圖1)。為便于FIM-R85的分離純化，首先進(jìn)行FIM-R85的富集。取西羅莫司的發(fā)酵液粗提物30g溶解于二氯甲烷，經(jīng)硅膠(200～300目)柱層析(5cm×60cm)，二氯甲烷：無水乙醇(40:1,V/V)混合溶劑洗脫，分部收集，用高效液相跟蹤檢測(cè)。將分離得到的含F(xiàn)IM-R85的洗脫液減壓濃縮，得到黃色粉末。經(jīng)HPLC檢測(cè)，該黃色粉末中FIM-R85占比提高至29.4%(圖2)。

2.3 FIM-R85的純化

圖1 粗提物的HPLC圖譜Fig. 1 HPLC analysis of crude extract

圖2 黃色粉末的HPLC圖譜Fig. 2 HPLC analysis of the yellow powder

稱取200mg上述含F(xiàn)IM-R85的黃色粉末，將其溶解于少量乙腈中，制備型液相色譜儀LC-20(日本島津公司)進(jìn)行分離。分離柱(2cm×25cm)：ODS C18，10μm；流動(dòng)相：乙腈:水(60:40,V/V)；檢測(cè)波長(zhǎng)：277nm；柱溫：25℃；流速：6mL/min。分段收集，HPLC檢測(cè)。將分離得到的目標(biāo)組分減壓濃縮去除乙腈和甲醇后用等體積的二氯甲烷分別萃取兩次，合并二氯甲烷層，減壓濃縮除去二氯甲烷獲得FIM-R85類白色粉末。HPLC分析表明，其純度為98.7%(圖3)。

2.4 結(jié)構(gòu)解析

FIM-R85的紫外圖譜(圖4)中可以看出其紫外吸收特征峰與西羅莫司相同，溶解度也與西羅莫司類似；IR譜見圖5，其理化性質(zhì)見表1。

由HRMS測(cè)定值顯示FIM-R85的分子式為C50H77NO13，分子量為899，比西羅莫司少14；FIM-R85的13C NMR譜(圖6)譜線絕大多數(shù)呈成對(duì)出現(xiàn)，且是一強(qiáng)一弱，從1H NMR譜(圖7)中可計(jì)算出強(qiáng)弱比例約為9:1，該現(xiàn)象表明：由于結(jié)構(gòu)中酰胺鍵的旋轉(zhuǎn)受阻，導(dǎo)致該化合物在溶劑d6-DMSO中存在構(gòu)象異構(gòu)現(xiàn)象[8]。結(jié)合DEPT譜(圖8)，并從FIM-R85主要構(gòu)象體的碳譜可以看出，該化合物分子所含有50個(gè)碳原子中，季碳3個(gè)，羰基碳5個(gè)，次甲基碳20個(gè)，亞甲基碳13個(gè)及甲基碳9個(gè)， 比西羅莫司少1個(gè)甲基碳。

圖3 FIM-R85的HPLC圖譜Fig. 3 HPLC analysis of FIM-R85

圖4 FIM-R85的UV圖譜Fig. 4 UV analysis of FIM-R85

表2列出了FIM-R85與西羅莫司主要構(gòu)型的NMR光譜數(shù)據(jù)對(duì)比。與西羅莫司相比，在西羅莫司碳譜中存在的一個(gè)甲氧基的碳信號(hào)(δ56.89ppm)在FIM-R85的碳譜中消失；相對(duì)應(yīng)的氫譜中西羅莫司具強(qiáng)吸收甲氧基的H信號(hào)(3.16ppm)，在FIM-R85的1H NMR譜中也消失。與該甲氧基相關(guān)的29位碳的位移也發(fā)生變化，由85.49ppm(西羅莫司)移到75.81ppm(FIM-R85)；而29位碳上的氫的位移則由3.93ppm(西羅莫司)移到4.32ppm(FIM-R85)。此外，在FIM-R85的氫譜中，在4.81ppm的位置，多了一個(gè)氫信號(hào)，經(jīng)指認(rèn)，該信號(hào)由29位碳相連的羥基氫引起，說明該化合物比西羅莫司少了一個(gè)CH2，與其HRMS測(cè)定值相吻合。結(jié)合其它譜圖和理化性質(zhì)，數(shù)據(jù)表明FIM-R85是西羅莫司的類似物，其結(jié)構(gòu)為29-O-去甲基雷帕霉素(圖9)。

圖5 FIM-R85的IR圖譜Fig. 5 IR analysis of FIM-R85

表1 FIM-R85的理化性質(zhì)Tab. 1 Physico-chemical properties of FIM-R85

圖6 FIM-R85的13C NMR譜Fig. 6 13C NMR spectrum of FIM-R85

圖7 FIM-R85的1H NMR譜Fig. 7 1H NMR spectrum of FIM-R85

圖8 FIM-85的DEPT135譜Fig. 8 DEPT135 spectrum of FIM-R85

3 結(jié)論與討論

表2 FIM-R85與西羅莫司主要構(gòu)型的NMR光譜數(shù)據(jù)對(duì)比a(d6-DMSO)Tab. 2 NMR spectroscopic data for major conformer of sirolimus and FIM-R85a (in d6-DMSO)

續(xù)表2

圖9 西羅莫司和FIM-R85的結(jié)構(gòu)Fig. 9 The structures of sirolimus and FIM-R85

FIM-R85在西羅莫司發(fā)酵液粗提物中含量?jī)H1.1%，采用以硅膠為固定相，二氯甲烷：無水乙醇(40:1)混合溶劑為洗脫劑的富集方法，獲得幾乎不含西羅莫司而目標(biāo)物占29.4%的黃色粉末，目標(biāo)物的比例得到很大的提高。應(yīng)用制備型液相色譜儀進(jìn)一步純化，得到HPLC純度為98.7%的FIM-R85純品。理化性質(zhì)研究和NMR譜分析表明，F(xiàn)IM-R85結(jié)構(gòu)與西羅莫司類似，分子量比西羅莫司少14，與29-O-去甲基雷帕霉素同質(zhì)。西羅莫司產(chǎn)生菌在生物合成西羅莫司過程中，由聚酮合酶和非核糖體肽合成酶首先合成西羅莫司骨架—前西羅莫司(prorapamycin)，其C-29位為羥基。然后，由甲基轉(zhuǎn)移酶將甲硫氨酸的甲基轉(zhuǎn)移到前西羅莫司的C-29位的羥基上[9]。因此，西羅莫司發(fā)酵液中的29-O-去甲基雷帕霉素是西羅莫司產(chǎn)生菌合成的西羅莫司中間產(chǎn)物。Nishida等[10]曾報(bào)道在培養(yǎng)基中添加L-哌可酸，從西羅莫司產(chǎn)生菌游動(dòng)放線菌(Actinoplanessp.)N902-109的發(fā)酵產(chǎn)物中分離得到該化合物；而胡方劍等[11]則通過對(duì)西羅莫司進(jìn)行化學(xué)半合成的方法也獲得該化合物。