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人體皮膚成纖維細胞的快速分離及多向分化能力鑒定

2019-11-26 05:41:36魏傳飛王偉劉延明段婧蘆現(xiàn)杰王琰張男李孟鵬陳超章陽佟加貝韓發(fā)彬
關鍵詞:孔板成骨纖維細胞

魏傳飛 王偉 劉延明 段婧 蘆現(xiàn)杰 王琰 張男 李孟鵬陳超 章陽 佟加貝 韓發(fā)彬,3

目前,許多疾病如帕金森氏病、阿爾茲海默病和軟骨缺損等是由于組織或器官中的細胞丟失或損傷所引起的[1-3],而通過移植類似細胞來替代行使功能,可以達到更為有效的治療效果[4]。近年研究表明,成纖維細胞可以重編程為誘導多能干細胞[5],然后分化為神經(jīng)細胞、心肌細胞和造血干細胞等[6-11],也可以由成纖維直接重編程為神經(jīng)細胞、心肌細胞等[12-17]。研究者期望采用這種方式產(chǎn)生功能細胞用于移植治療多種疾病。但功能細胞的產(chǎn)生需要大量的種子細胞作支撐,由于成纖維細胞具有易獲取、易培養(yǎng)、增殖快和性狀穩(wěn)定等特點[18-19],因此成纖維細胞成為理想的種子細胞。成纖維細胞經(jīng)誘導分化產(chǎn)生功能細胞后,用于自體移植可避開免疫排斥問題,因此成纖維細胞逐漸被視為個體化細胞移植治療疾病的首選種子細胞。本研究中,通過組織塊培養(yǎng)法分離獲得人皮膚成纖維細胞系并進行鑒定,然后探討了成纖維細胞成脂、成骨、成軟骨和成神經(jīng)的多向分化潛能,為細胞移植修復骨損傷、軟骨損傷及神經(jīng)退行性疾病的臨床應用提供了充足的種子細胞來源以及初步的研究依據(jù)。

材料與方法

一、材料

1.樣品:皮膚組織采集自健康捐獻者(30 ~60 歲)。捐獻者簽署了相關的知情同意書。該實驗符合聊城市人民醫(yī)院倫理委員會的規(guī)定并得到批準。

2.主要儀器:臺式離心機(德國Eppendorf公司),熒光顯微鏡(日本尼康公司),細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司),倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司),染色體分析系統(tǒng)(日本尼康公司),流式細胞儀(美國BD公司)。

3.主要的試劑:D-MEM基礎培養(yǎng)基 (美國Invitrogen公司),F(xiàn)BS (美國Sciencell公司),DMEM/F12、L-Glutamine、非必需氨基酸、胎牛血清 (FBS)、成纖維細胞生長因子 (f i broblast growth factor,bFGF)、TrypLE(美 國 Invitrogen 公 司),Vimentin鼠源單克隆抗體 (上海碧云天公司),線粒體染料MitoTracker?Deep Red FM (美國Invitrogen公司),TUJ1鼠源單克隆抗體、茜素紅染料、阿利新藍染料、油紅O染料(美國Sigma-Aldrich公司)。

二、方法

(一)人體成纖維細胞的分離培養(yǎng)

采集人體皮膚組織,并培養(yǎng)原代細胞。該實驗符合聊城市人民醫(yī)院倫理委員會的規(guī)定并得到批準。在局部麻醉的條件下利用電動牙鉆,采集皮膚組織(厚2~3 mm,直徑6 mm),并放入含青霉素/鏈霉素(P/S)的無菌DMEM培養(yǎng)液中洗滌1次,再用磷酸緩沖液(DPBS)洗滌2次。漂洗完后的組織在無菌條件下先去除皮下脂肪,再用眼科剪剪成近1 mm2×1 mm2的組織塊。然后轉至25 mm的細胞培養(yǎng)皿中培養(yǎng),加入MEF培養(yǎng)基(DMEM,10%胎牛血清(FBS),1%非必需氨基酸,1%青霉素/鏈霉素(P/S)。置于37 ℃,體積分數(shù)為5%的CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在培養(yǎng)大約1~2周后,通過鏡檢發(fā)現(xiàn)組織塊周圍開始爬出原代纖維細胞,待培養(yǎng)皿中的細胞整體匯合度達到85%以上時,即可進行傳代培養(yǎng),每周傳代1次,以1 : 3的比例進行傳代至T25細胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。待4~6 d細胞匯合度再次達到85%以上即可繼續(xù)以1 : 3比例傳代。將培養(yǎng)的前5代細胞,每代都進行凍存保存,并保留部分繼續(xù)傳代培養(yǎng)。將分離獲得的成纖維細胞株進行編號,本研究選取編號為NCF1,NCF2兩株成纖維細胞株進行后續(xù)研究。

(二)細胞形態(tài)學觀察及鑒定

1.形態(tài)學觀察:利用光學顯微鏡觀察從組織塊爬出的原代成纖維細胞及傳代培養(yǎng)后的細胞,拍照并記錄成細胞形態(tài)特征。

2.流式分析鑒定:選取2株分離出的成纖維細胞,利用BD FACS AriaII fl ow cytometer(BD Biosciences)進行流式分析。取對數(shù)生長期的成纖維細胞制備細胞懸液,離心機201×g離心5 min后,棄去培養(yǎng)基。加入2 ml DPBS,渦旋混勻。離心機805×g離心5 min,棄上清。加入適量DPBS,調整細胞濃度為1×107個/ml。取100 μl細胞懸液(1×106個細胞),轉移至流式上樣管。加入 50 μl人血清,渦旋混勻,室溫封閉15 min。然后DPBS洗滌細胞,200×g離心5 min。細胞沉淀用50 μl DPBS重懸,分別加入 2 μl相應抗體 FITC-CD90,PE-CD73和PE-CD34,相應同型對照抗體分別為FITC-IgG1,PE-IgG1和PE-IgG1。渦旋混勻,室溫避光孵育45 min。加入2 ml DPBS,渦旋混勻,室溫201×g離心 5 min;棄上清,加入 400 μl DPBS,渦旋混勻,上機用流式分選儀分析。

3.波形蛋白表達分析:將分離的成纖維細胞以1×105個/孔種于6孔板中,第2天更換新鮮的MEF液。第3天將細胞培養(yǎng)液去除,加入DPBS漂洗3次,用DPBS沖洗后,用4%多聚甲醛(paraformaldehyde,PFA)固 定 15 min。 用 含有 0.2%Triton X-100,10%正常羊血清(NGS),1×PBS封閉緩沖液進行封閉45 min。加小鼠波形蛋白(Vimentin)抗體(一抗,1 : 500)4℃孵育過夜。PBS沖洗3遍后,加入熒光標記二抗(1 : 1 000)室溫孵育2 h。Hoechst(1 : 10 000)核染5 min,在熒光顯微鏡下觀察分析。

4.細胞生長曲線測定:利用同一細胞系第5代和第10代的成纖維細胞,按照細胞量為2×104個/ 孔,等量接種到24孔板中,每天計數(shù)3個孔,計算平均數(shù),共計數(shù)7 d。最后統(tǒng)計數(shù)據(jù),培養(yǎng)時間為橫坐標,細胞數(shù)目為縱坐標,繪制生長曲線。

5.線粒體染色:將細胞培養(yǎng)蓋玻片放置于24 孔板中,分離的成纖維細胞以2×104細胞/孔種于24孔板中,第2天更換新鮮的MEF液。第3天將細胞培養(yǎng)液去除,加入MitoTracker?Deep Red FM線粒體染料,避光培養(yǎng)20 min;然后DPBS漂洗3次,用冰甲醇固定5 min,PBS漂洗3次后進行封片,在激光共聚焦顯微鏡490 nm處觀察。參考Land的線粒體統(tǒng)計方法[20],對線粒體相對量熒光強度的變化進行分析。

6.核型分析:取分離出的成纖維細胞種于T25中,在細胞處于生長對數(shù)期時,在處理細胞前2 h加入終濃度為0.1 μg/ml的秋水仙堿。離心:將成纖維細胞消化,收集201×g離心10 min (升降速調為零),棄上清,用DPBS洗滌沉淀1次。低滲:利用37 ℃預熱的0.075 mol/L氯化鉀溶液約8 ml處理細胞,輕輕吹打,37 ℃溫浴20 min。預固定:再加入現(xiàn)配的甲醇、冰醋酸固定液 (3 : 1)1 ml左右,輕輕混勻,室溫下10 min后201×g離心10 min,棄上清,留沉淀。固定:沿管壁緩慢加入現(xiàn)配的固定液約8 ml,輕輕混勻,靜置25 min,然后201×g離心10 min,棄上清。制片:固定液重懸細胞沉淀,冰片上滴片,然后60 ℃烘干3 h,胰酶消化,用0.85%NaCl漂洗后進行吉姆薩染色,晾干后即可在顯微鏡下觀察。

(三)分離細胞的多向誘導分化

1.成骨分化:選取生長狀況良好的P3代成纖維細胞進行培養(yǎng),待細胞匯合度到達80%~ 90%時,進行消化、離心收集,按1×105個/孔接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。待6孔板中的細胞匯合度增至75%~ 85%時,更換成骨誘導培養(yǎng)基(成分包括:DMEM,10% FBS,100 nmol/L Dexamethasone、10 mmol/L β-glycerol phosphate、50 μmol/L L-Ascorbic acid 2-phosphate、50 nmol/L Vitamin D3),誘導成纖維細胞成骨分化。持續(xù)誘導3周后,除去誘導培養(yǎng)液,DPBS洗滌3次,然后4%甲醛固定誘導的細胞,利用0.1%的茜素紅(pH值為4.2)室溫孵育染色30%min,去離子水洗去染料,然后鏡檢拍照。

2.成軟骨分化:選取生長狀況良好的P3代成纖維細胞進行培養(yǎng),待細胞匯合度到達80%~ 90%時,進行消化、離心收集,按1×105個/孔接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。待6孔板中的細胞匯合度增至75%~ 85%時,更換成軟骨誘導培養(yǎng)基(成分包括:DMEM,10%FBS,10 ng/ml TGF-β3、50 μmol/L L-Ascorbic acid 2-phosphate、10 μg/ml insulin),誘導成纖維細胞成骨分化。持續(xù)誘導3周后,除去誘導培養(yǎng)液,DPBS洗滌3次,然后4%甲醛固定誘導的細胞,阿利新藍染色20 min后,去離子水洗去染料,然后鏡檢拍照。

3.成脂分化:選取生長狀況良好的P3代成纖維細胞進行培養(yǎng),待細胞匯合度到達80%~ 90%時,進行消化、離心收集,按1×105個/孔接種于6 孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。待6孔板中的細胞匯合度增至75%~ 85%時,更換成脂誘導培養(yǎng)基(成分包括:1 μmol/L Dexamethasone、10 μg/ml bovine insulin、60 μmol/L indomethacin、500 μmol/L 3-isobutyl-1-methylxanthine),誘導成纖維細胞成骨分化。持續(xù)誘導3周后,除去誘導培養(yǎng)液,DPBS洗滌3次,然后4%甲醛固定誘導的細胞,利用油紅O染色10~20 min,用75%的乙醇洗去染料,然后鏡檢拍照。

4.成神經(jīng)分化:參考以往文獻[21]誘導成纖維細胞成神經(jīng)分化,分為2階段法,共計21 d。選取生長狀況良好的P3代成纖維細胞進行培養(yǎng),待細胞匯合度到達80%~ 90%時,進行消化、離心收集,按1×105個/孔接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)。待6孔板中的細胞匯合度增至75%~ 85%時,更換成神經(jīng)誘導培養(yǎng)基[DMEM/F12:Neurobasal(1 : 1),加入 0.5%N-2,1% B-27,100 mmol/L cAMP,20 ng/ ml bFGF,P/S雙抗及小分子化合物0.5 mmol/ L VPA;3 μmol/L CHIR99021;1 μmol/L Repsox;10 μmol/L Forskolin;10 μmol/L SP600125;10 μmol/L GO6983;5 μmol/L Y-27632] 誘 導 培養(yǎng)8 d后改為神經(jīng)成熟培養(yǎng)基[DMEM/ F12:Neurobasal (1 : 1),加入0.5% N-2,1% B-27,100 mmol/L cAMP, 20 ng/ml bFGF,20 ng/ml BDNF,20 ng/ml GDNF,20 ng/ml NT3,P/S 雙抗及小分子化合物 3 μmol/ L CHIR99021;10 μmol/L Forskolin;1 μmol/ L Dorsomorphin]誘導成纖維細胞成神經(jīng)分化。

持續(xù)誘導3周后,免疫熒光染色分析結果。除去誘導培養(yǎng)液,DPBS洗滌3次,4%甲醛固定細胞15 min。用含有0.2%Triton X-100,10%正常羊血清 (NGS),1×PBS封閉緩沖液進行封閉45 min。加封閉液1 : 500稀釋神經(jīng)元標記物TUJ1抗體(一抗)4 ℃過夜,DPBS洗3遍;用熒光標記的二抗反應 2 h,DPBS洗 3遍;核染料 Hoechst(1 : 1 000)染色5 min,然后在熒光顯微鏡下觀察分析誘導細胞神經(jīng)元標記物的表達情況。

三、統(tǒng)計學分析方法

應用分析軟件Graphpad Prism 6.0,成纖維細胞計數(shù)值用表示,兩代細胞增殖速度及線料體相對量比較采用t檢驗統(tǒng)計分析,以P< 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結果

一、人體皮膚成纖維細胞的分離與鑒定

1.形態(tài)學分析:通過組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)4周即可獲得原代成纖維細胞,并進行傳代及凍存。組織塊培養(yǎng)1~2周后周圍已爬出原代成纖維細胞,此時原代細胞呈緊密多邊形,更外圈的細胞由于空間的擴大,細胞伸展開,胞體飽滿并呈典型梭狀或者扁平星狀,細胞核呈橢圓。細胞的活性較強,增殖速度較快,4~5 d進行傳代1次,并且在凍存復蘇傳至第10代后,細胞形態(tài)仍然為典型成纖維細胞梭狀形態(tài)(圖 1)。

圖1 光學顯微鏡下分離皮膚成纖維細胞的形態(tài)(×100)

2.皮膚成纖維細胞的流式分析:分別對編號為NCF-1,NCF-2的成纖維細胞進行了流式分析,通過檢測細胞表面抗原表達來鑒定獲得的細胞系。分析結果表明成纖維細胞均表達表面標志物CD90(NCF1,NCF2占比分別為99.9%,98.7%),CD73(NCF1,NCF2占比分別為98.2%,85.6%),但極少表達造血干細胞標記物CD34(NCF1,NCF2占比分別為1.8%,2.6%)(圖2)。

3.Vimentin表達分析:利用成纖維細胞特異標志物Vimentin蛋白抗體對分離的細胞進行免疫熒光染色,結果顯示,分離細胞的Vimentin表達呈陽性,統(tǒng)計結果陽性率為100%(圖3)。

4.細胞生長曲線分析:分別測定分離細胞的P5代及經(jīng)歷凍存、傳代后P10代細胞7 d的生長曲線,比較不同代次細胞間的增殖速度變化情況。生長曲線結果表明,P5代細胞與P10代細胞增殖速度均為正常。其中,生長曲線中第0~2天為潛伏期、第3~5天指數(shù)生長期、第5~7天為平臺期。數(shù)據(jù)表明,潛伏期時,第1天細胞統(tǒng)計量較接種量有所減少,原因可能是貼壁細胞在自身和環(huán)境因素影響下,增殖速度較慢,并且有極少量的細胞未貼壁。對比結果表明分離的同一株細胞系的P5代與經(jīng)歷凍存、傳代后P10代的細胞增殖速度仍無明顯改變,差異無統(tǒng)計學意義(t= 1.586,P= 0.1567,圖 4)。

圖2 分離皮膚成纖維細胞的流式分析

圖3 熒光顯微鏡下分離皮膚成纖維細胞鑒定(Vimentin熒光染色,×100)

圖4 分離皮膚成纖維細胞生長曲線分析

5.細胞線粒體分析:線粒體染料對分離細胞的P5代及P10代細胞進行染色后,激光共聚焦顯微鏡下發(fā)現(xiàn),P5與P10代次的成纖維細胞的線粒體均主要分布于核周圍中,部分線粒體成短線狀且圍繞著核可呈現(xiàn)出基本細胞核輪廓,多數(shù)細胞呈線粒體核周分布類型(圖5)而且線粒體相對熒光強度顯示在傳代前后細胞的線粒體相對量差異無統(tǒng)計學意義(t =0.664,P =0.543,圖 6)。

6.核型分析:對分離細胞的P5代及P10代細胞進行核型分析。結果表明,分離培養(yǎng)的成纖維細胞在傳代第5代和第10代后,細胞的染色體均顯示出了G帶,并且數(shù)目為46條。提示分離的成纖維細胞P5代和P10代染色體核型均為含46條染色體正常的二倍體,數(shù)目和形態(tài)無明顯差異(圖7)。

(二)皮膚成纖維細胞的多向分化能力鑒定

1.成骨分化:利用成骨誘導培養(yǎng)基培養(yǎng)21 d后,誘導后細胞進行茜素紅染色,發(fā)現(xiàn)有鈣鹽沉積,胞外基質產(chǎn)生大量的鈣結節(jié)(圖8a)。

2.成軟骨分化:利用成軟骨誘導培養(yǎng)基誘導培養(yǎng)21 d后,誘導后細胞進行阿利新藍染色,染色結果呈陽性(圖 8b)。

3.成脂分化:利用成脂誘導培養(yǎng)基進行成纖維細胞的成脂分化誘導,成脂分化誘導1周左右,培養(yǎng)基明顯變粘稠,21 d后,通過油紅O染色,發(fā)現(xiàn)成纖維細胞能夠分化成脂肪細胞,且細胞內含有脂滴聚集(圖 8c)。

圖5 熒光顯微鏡下皮膚成纖維細胞線粒分析(線粒體活體染色,×100)

4.成神經(jīng)誘導分化:將皮膚成纖維細胞向神經(jīng)細胞誘導,發(fā)現(xiàn)7~14 d細胞形態(tài)發(fā)生改變,變成神經(jīng)元樣細胞形態(tài),經(jīng)誘導分化21 d后,經(jīng)免疫熒光表達分析神經(jīng)細胞標志物TUJ1表達呈陽性(圖8d)。

圖6 同一株人體皮膚成纖維細胞不同代次P5,P10代細胞線粒體相對熒光強度值

討論

2007年Yamanaka等[22]將4個轉錄因子基因Oct3/4,Sox2,c-Myc,Klf4轉入成體人成纖維細胞,直接將成纖維細胞重編程為誘導多能干細胞。隨后,研究人員將誘導多能干細胞分化成多種細胞,神經(jīng)細胞(包括神經(jīng)膠質細胞、神經(jīng)元細胞)、視網(wǎng)膜色素上皮細胞、造血祖細胞和心肌細胞等[9,23-28],為干細胞的臨床應用開辟了廣闊前景[29]。另外,近年來建立的直接重編程新技術,利用特定轉錄因子或者小分子化合物組合誘導,可以將成纖維細胞直接重編程為多種細胞。獲取患者的自體成纖維細胞,在不經(jīng)過誘導多能干細胞階段直接將其轉化為將來可用于自體移植患者的各種成熟細胞。這種直接重編程獲得的細胞,既可以避免異源異體細胞移植后產(chǎn)生的免疫排斥反應,也避開了帶有干性細胞移植后的成瘤性問題。以上兩種策略極大地拓展了成纖維細胞的應用范圍,使得普通的成纖維細胞在細胞治療的臨床研究及應用中發(fā)揮了重要的支撐作用。

本研究為了獲得生長狀態(tài)良好的人體皮膚成纖維細胞,在分離細胞時,將組織塊剪碎成小塊,然后加入培養(yǎng)基直接培養(yǎng)組織塊。這樣既減少對采集皮膚組織的處理時間,也避免胰酶消化組織塊時對成纖維細胞的損傷。流式分析發(fā)現(xiàn),分離的細胞高表達CD90、CD73、極低表達CD34,這與有關文獻[30-32]關于成纖維細胞表面標志物的研究結果是一致的。成纖維特異性標志物Vimentin的表達呈陽性,提示分離的細胞為成纖維細胞。而通過對比成纖維細胞不同代次間的增殖能力,線粒體的分布情況,染色體核型,結果表明,分離的成纖維細胞經(jīng)過一定傳代次數(shù)后仍具有相似的增殖速度,典型線粒體核周分布類型及數(shù)量,同時染色體數(shù)目及形態(tài)并也未發(fā)生無明顯變化。

過去研究表明成纖維細胞在特定的情況下可沿著不同的間充質譜系分化[33]。利用分離的成纖維細胞探討了其在成骨、成軟骨、成脂、成神經(jīng)方向的分化。茜素紅染色表明部分細胞經(jīng)誘導后,分化為骨細胞;阿斯利藍染色呈陽性表面部分細胞經(jīng)誘導分化后可向軟骨細胞分化,油紅O染色表明部分細胞在誘導后有在胞內形成大量脂滴,提示成纖維細胞可以向脂肪細胞分化。成神經(jīng)誘導中,細胞形態(tài)明顯向類神經(jīng)元形態(tài)發(fā)生改變,且免疫熒光染色表明部分細胞表達神經(jīng)元標記物TUJ1。

圖8 熒光顯微鏡下分離皮膚成纖維細胞多向誘導分化后免疫熒光染色鑒定(×200)

體細胞重編程和直接重編程技術在不斷地被優(yōu)化[34-35],但轉化效率較低,因此需要充足的起始細胞做支撐。由于成纖維細胞具有良好的增殖能力、易于培養(yǎng)、可短時間獲得大量性狀穩(wěn)定的細胞等特點,成纖維細胞作為重編程的起始細胞具有更加明顯的優(yōu)勢。同時經(jīng)過對成纖維細胞多向分化的探討,提示成纖維細胞在細胞移植治療骨損傷,軟骨損傷及神經(jīng)退行性疾病方面具有重要的臨床應用價值。因此,本實驗分離的成纖維細胞通過誘導可以向成骨、成軟骨、成脂和成神經(jīng)的分化,但各方向的分化效率有待于優(yōu)化,而且誘導細胞的成熟度有也待于提高。未來將會繼續(xù)優(yōu)化誘導條件,利用基因轉導結合小分子誘導技術,來提高誘導分化效率和誘導細胞成熟度,以便發(fā)揮成纖維細胞作為細胞移植治療應用中起始細胞的潛在價值。

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