陳雪梅 張曦 林建煒 薛禎智 劉韜

自然殺傷細(xì)胞（natural killer cell，NK細(xì)胞）是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分。其特異性分子標(biāo)記是CD3-CD16+CD56+。與T細(xì)胞相比，NK細(xì)胞具有主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC）非限制性殺傷的特點(diǎn)。NK細(xì)胞是駐留在黏膜系統(tǒng)和淋巴結(jié)等機(jī)體抵御病原體感染和惡性腫瘤第一道防線(xiàn)的重要免疫細(xì)胞。在感染和腫瘤發(fā)生早期起著重要的控制作用[1]。NK細(xì)胞可以識(shí)別并清除腫瘤細(xì)胞，無(wú)需預(yù)先抗原致敏[2]。它們對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別依賴(lài)于細(xì)胞表面活化性受體和抑制性受體之間的平衡[3]。NK細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞后，可通過(guò)釋放穿孔素和顆粒酶[4-5]、誘導(dǎo)凋亡、誘導(dǎo)腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）家族分子[6]的表達(dá)，亦可通過(guò)其表面CD16分子介導(dǎo)的抗體依賴(lài)性細(xì)胞毒性作用（antibody dependent cell cytotoxicity，ADCC）[7-8]，迅速破壞腫瘤細(xì)胞。

目前絕大多數(shù)臨床以及臨床前研究中所使用的NK細(xì)胞來(lái)源為人自體外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）。 由 于NK細(xì)胞在PBMC細(xì)胞中僅占5%～ 20%，且在體外的擴(kuò)增能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于T淋巴細(xì)胞，限制了其在臨床的大規(guī)模應(yīng)用[9-10]。因此，如何從PBMC誘導(dǎo)獲得大量的高活性NK細(xì)胞成為其應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵[11-12]。目前，NK細(xì)胞的體外擴(kuò)增培養(yǎng)方法主要有細(xì)胞因子組合誘導(dǎo)培養(yǎng)法[13-14]和滋養(yǎng)層細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)法[9,15-16]。其中滋養(yǎng)層細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)法在NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)和純度上要優(yōu)于細(xì)胞因子組合的擴(kuò)增方案，但仍具有很大的改進(jìn)空間[9,17]。

白介素（interleukin，IL）-15（IL-15）是維持NK細(xì)胞活性和功能的重要因子。IL-15與白介素2（IL-2）聯(lián)合使用，可維持NK細(xì)胞存活，促進(jìn)NK細(xì)胞擴(kuò)增[18]。此外，IL-15還可促進(jìn)NK細(xì)胞分泌 γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）[19]，促進(jìn) ADCC，大大提高NK細(xì)胞聯(lián)合單抗治療腫瘤的療效[20]。4-1BBL是Ⅱ型跨膜糖蛋白，屬于TNF超家族。4-1BB/4- 1BBL作為一對(duì)重要的協(xié)同刺激信號(hào)分子，可促進(jìn)NK細(xì)胞增殖、激活和分泌IFN-γ[21]，同時(shí)還可抑制NK細(xì)胞凋亡，提高NK細(xì)胞毒性，在NK細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答中起十分重要的調(diào)控作用[9]。

自剪切多肽P2A是由21個(gè)氨基酸構(gòu)成，來(lái)源于Ⅰ型豬腸病毒。其序列比內(nèi)核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（internal ribosome entry site，IRES）序列小很多。在2個(gè)目的蛋白之間插入P2A多肽序列，通過(guò)在2A序列的C端甘氨酸和脯氨酸間進(jìn)行共轉(zhuǎn)錄自剪切，產(chǎn)生獨(dú)立的2個(gè)目的蛋白，增加了共表達(dá)蛋白的產(chǎn)量[22-23]，同時(shí)實(shí)現(xiàn)同一個(gè)啟動(dòng)子控制下的兩蛋白共翻譯。基于上述原理，在IL-15和4-1BBL之間加入該序列將會(huì)增加這兩種因子在滋養(yǎng)層細(xì)胞表面的表達(dá)豐度。使用上述方法構(gòu)建的滋養(yǎng)層細(xì)胞將會(huì)進(jìn)一步提高NK細(xì)胞體外擴(kuò)增能力，提高NK細(xì)胞純度和細(xì)胞毒性。

材料與方法

一、材料

人慢性髓系白血病細(xì)胞K562、人胚胎腎細(xì)胞293T購(gòu)自北京北納生物公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、谷氨酰胺購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；EcoRⅠ、XhoⅠ限制性?xún)?nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs公司；pLVX-IRES-Puro、pLVX-IRES-ZsGreen1質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Clontech公司；pUC57-IL15-41BBL質(zhì)粒及相關(guān)引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；psPAX2、pMD.2G質(zhì)粒由哈爾濱工業(yè)大學(xué)胡穎教授贈(zèng)送；DH5α感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自上海生工生物公司；D2000 DNA Marker、無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒中量提取試劑盒購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自天津?yàn)笊锕?；NK細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基、DPBS由深圳默賽爾生物公司提供；人白介素2 （IL-2）購(gòu)自北京同立海源生物 公 司；LEGENDplex?Human Th Cytokine Panel（13- plex）、Intracellular Staining Permeabilization Wash Buffer （細(xì)胞內(nèi)染色滲透洗滌液）（×10）、PE-anti-human 4-1BBL、CD3-PerCP/Cy5.5、CD56-FITC、CD3-FITC、CD56-PE、IFN-γ-PE、TNF-α-APC流式抗體均購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司；嘌呤霉素購(gòu)自上海翊圣生物公司；乳酸脫氫酶 （lactate dehydrogenase，LDH）細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天生物公司。

二、方法

1.pUC57-IL15-41BBL質(zhì)粒的構(gòu)建和合成：從NCBI的基因庫(kù)中搜索目的基因IL-15和41BBL的cDNA序列，設(shè)計(jì)“CD8α信號(hào)肽-IL15-CD8α跨膜區(qū)-P2A-41BBL”全序列，序列結(jié)構(gòu)示意圖如圖1a所示，將該序列在合適的位點(diǎn)插入pUC53質(zhì)粒中，獲得pLVX-IL15-41BBL質(zhì)粒，質(zhì)粒圖譜如圖1b所示。將獲得的pUC57-IL15-41BBL質(zhì)粒全序列送交南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

2.pLVX-IL15-41BBL慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建：以pUC57-IL15-41BBL質(zhì)粒為模板，利用IL15-41BBL 擴(kuò) 增 引 物（Sense：CGGAATTCGCCA CCATGGCCTTACCAGTGACCGCC，Antisense：GCTCGA GCGGTTATTCCGACCTCG）將“CD8α信號(hào)肽-IL15-CD8α跨 膜區(qū)-P2A-41BBL”基 因片段（1474 bp）擴(kuò)增出來(lái)。pLVX-IRES-Puro質(zhì)粒用 EcoRⅠ、XhoⅠ酶切后，將“CD8α信號(hào)肽-IL15-CD8α跨膜區(qū)-P2A-41BBL”基因片段插入至pLVX-IRES-Puro質(zhì)粒中，經(jīng)過(guò)DNA連接，即合成慢病毒表達(dá)載體pLVX-IL15-41BBL質(zhì)粒。將pLVX-IL15-41BBL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)克隆PCR（引物CMV-F：CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG，IRES-R：CCTCA CATTG CCAAAAGACG）及電泳初步鑒定（PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度1757 bp）后，選取鑒定正確的轉(zhuǎn)化克隆大量擴(kuò)增，提取pLVX-IL15-41BBL質(zhì)粒進(jìn)行最終測(cè)序鑒定。

3.IL15-41BBL/ZsGreen1慢病毒的制備和濃縮：將pLVX-IL15-41BBL或pLVX-IRES-ZsGreen1質(zhì)粒與第二代慢病毒包裝質(zhì)粒psPAX2、pMD2.G用氯化鈣轉(zhuǎn)染法共同轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染6～12 h后更換新鮮的293T細(xì)胞完全培養(yǎng)基（高糖DMEM+10% FBS+ 1%谷氨酰胺）。轉(zhuǎn)染48 h和72 h后分別收獲1次病毒，200×g離心5 min后，上清液用0.45 μm濾器過(guò)濾后，轉(zhuǎn)移至超高速離心管中，4 ℃，72 000×g離心 2 h，棄去上清液后用適量DPBS重懸慢病毒沉淀，分裝后置于-80 ℃長(zhǎng)期保存，即為收獲的IL15-41BBL慢病毒或ZsGreen1慢病毒。

圖1 pLVX-IL15-41BBL慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

4.慢病毒的滴度檢測(cè)：第1天，將293T細(xì)胞消化計(jì)數(shù)后稀釋至2×105個(gè)/ml，加入12 孔板，1 ml/ 孔，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜；第2天，將上述制備的ZsGreen1慢病毒用293T細(xì)胞完全培養(yǎng)基進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)瑮壋?2孔板中的舊 培 養(yǎng) 基，用 1 ml未 稀 釋、1 : 10、1 : 102、1 : 103、1 : 104、1 : 105稀釋的 ZsGreen1 慢病毒（含 8 μg/ml Polybrene）感染 293T 細(xì)胞，置于 37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜后，更換新鮮的293T細(xì)胞完全培養(yǎng)基。慢病毒感染48 h后，消化293T細(xì)胞，DPBS重懸后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ZsGreen1+293T細(xì)胞比例。對(duì)細(xì)胞比例在10%～ 30%之間的孔進(jìn)行滴度計(jì)算。慢病毒的滴度計(jì)算公式如下：滴度（TU/ ml）=（接種細(xì)胞數(shù)×ZsGreen1+ 293T細(xì)胞百分比×1 000）/病毒原液體積（μl）。

5.K562-IL15-41BBL穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建：取1×106個(gè)K562細(xì)胞，參照Z(yǔ)sGreen1慢病毒的滴度檢測(cè)結(jié)果，以感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）= 30加入IL15-41BBL慢病毒，另外加入8 μg/ml Polybrene，37 ℃、5%CO2培 養(yǎng) 箱 培 養(yǎng)，6 h后離心換液，換成K562細(xì)胞完全培養(yǎng)基（RPMI 1640+10%FBS）；感染24 h后，重復(fù)感染1次；72 h后，加入5 μg/ml嘌呤霉素進(jìn)行篩選；24 h后換成不含嘌呤霉素的K562細(xì)胞完全培養(yǎng)基，48 h后加入 10 μg/ml嘌呤霉素，繼續(xù)篩選培養(yǎng)；K562細(xì)胞狀態(tài)生長(zhǎng)良好，有克隆團(tuán)后，取適量細(xì)胞懸液，以未感染慢病毒的K562細(xì)胞作為陰性對(duì)照，流式檢測(cè)IL15- 41BBL+ K562細(xì)胞的比例；根據(jù)流式檢測(cè)結(jié)果，加入IL15-41BBL慢病毒重復(fù)感染，再篩選，直至IL15-41BBL+ K562細(xì)胞比例達(dá)到95%以上。

6.NK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)：用密度梯度離心法從健康志愿者來(lái)源的肝素鈉抗凝外周血中分離PBMC細(xì)胞，將3×106個(gè)PBMC細(xì)胞和0.5×106個(gè)經(jīng)過(guò)輻照（100 Gy）的K562細(xì)胞或K562-IL15-41BBL細(xì)胞重懸在含10 U/ml IL-2的NK細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)基中，接種至24孔板中，置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。另外用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PBMC細(xì)胞中CD3-CD56+NK細(xì)胞比例。后續(xù)根據(jù)NK細(xì)胞生長(zhǎng)狀況用新鮮的NK細(xì)胞培養(yǎng)基進(jìn)行補(bǔ)液或半量換液。第16天：收獲NK細(xì)胞，血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3-CD56+NK細(xì)胞比例。陰性對(duì)照K562滋養(yǎng)層細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的NK細(xì)胞標(biāo)為NC-NK細(xì)胞，K562-IL15-41BBL滋養(yǎng)層細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)的NK細(xì)胞標(biāo)為KIB-NK細(xì)胞。

7.PBMC細(xì)胞和NK細(xì)胞表型的檢測(cè)：取1×106個(gè)PBMC細(xì)胞或1×106個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)16 d的NK細(xì)胞（NC-NK、KIB-NK），按照抗體使用說(shuō)明書(shū)用流式抗體CD3-FITC、CD56-PE進(jìn)行染色，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD3-CD56+NK細(xì)胞比例。

8.NK細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)：分別取1×106個(gè)滋養(yǎng)層細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)16 d的NC-NK細(xì)胞和KIB-NK細(xì)胞，按照抗體使用說(shuō)明書(shū)用流式抗體CD3-PerCP/Cy5.5、CD56-FITC進(jìn)行染色后，用4%多聚甲醛室溫固定，DPBS洗滌1次后，用細(xì)胞內(nèi)染色滲透洗滌液滌并重懸，加入IFN-γ-PE、TNF-α- APC 流式抗體，室溫避光孵育 15～20 min后，用細(xì)胞內(nèi)染色滲透洗滌液及DPBS各洗滌1次后，DPBS重懸細(xì)胞，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞因子IFN-γ、TNF-α表達(dá)陽(yáng)性的NK細(xì)胞比例。

9.NK細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的檢測(cè)：分別取滋養(yǎng)層細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)16 d的NC-NK細(xì)胞和KIB- NK細(xì)胞培養(yǎng)上清，按照LEGENDplex?Human Th Cytokine Panel （13-plex）試劑盒使用說(shuō)明處理上清樣本，流式細(xì)胞儀上樣檢測(cè)上清液中的IFN-γ和TNF-α兩種細(xì)胞因子。利用LEGENDplex V8.0軟件根據(jù)已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，從而推算出NC-NK細(xì)胞和KIB-NK細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ和TNF-α細(xì)胞因子的濃度。

10.NK細(xì)胞的細(xì)胞毒性檢測(cè) （LDH法）：以NC-NK細(xì)胞和KIB-NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，選取K562細(xì)胞系和人肺癌細(xì)胞系H520作為殺傷靶細(xì)胞。按照效應(yīng)細(xì)胞：靶細(xì)胞= 2.5 : 1的效靶比設(shè)置共培養(yǎng)反應(yīng)體系，同時(shí)設(shè)置無(wú)細(xì)胞的培養(yǎng)液孔 （扣除背景）、只有靶細(xì)胞的樣品對(duì)照孔以及只有靶細(xì)胞用于后續(xù)裂解的孔 （樣品最大酶活性孔）。37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)3 h后，在樣品最大酶活性孔加入總體積10%的LDH釋放試劑。共培養(yǎng)4 h后，將細(xì)胞培養(yǎng)板用多孔板離心機(jī)離心，分別取各孔的上清液120 μl，加入到一新的96孔板中，隨即進(jìn)行樣品測(cè)定；各孔分別加入60 μl LDH檢測(cè)工作液，充分混勻，室溫避光孵育30 min，于490 nm處測(cè)定吸光度。細(xì)胞毒性或死亡率計(jì)算公式如下：細(xì)胞毒性或死亡率 （%）= （實(shí)驗(yàn)組樣品吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度） / （樣品最大酶活性的吸光度-樣品對(duì)照孔吸光度）×100%。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用Graphpad prism 5.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以表示。培養(yǎng)至第16天的兩組NK細(xì)胞的總細(xì)胞數(shù)量、NK細(xì)胞增殖倍數(shù)、細(xì)胞因子分泌功能及細(xì)胞殺傷能力的比較采用兩樣本t檢驗(yàn)。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、 pLVX-IL15-41BBL慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建

將“CD8α信號(hào)肽-IL15-CD8α跨 膜 區(qū)-P2A-41BBL”基因片段插入至pLVX-IRES-Puro質(zhì)粒中獲得慢病毒表達(dá)載體pLVX-IL15-41BBL。pLVXIL15-41BBL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化克隆PCR鑒定電泳圖如圖2所示，挑取的8個(gè)轉(zhuǎn)化克隆PCR產(chǎn)物均在1.7～1.8 kb處有清晰的條帶，與預(yù)期目的片段大小一致。

圖2 pLVX-IL15-41BBL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化克隆PCR產(chǎn)物的電泳條帶

圖3 梯度稀釋的ZsGreen1慢病毒感染293T細(xì)胞的流式檢測(cè)

二、慢病毒的滴度檢測(cè)

用10倍梯度稀釋的ZsGreen1慢病毒感染293T細(xì)胞，感染48 h后，各組ZsGreen1+293T細(xì)胞流式檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。根據(jù)流式檢測(cè)結(jié)果，選取稀釋103倍的慢病毒感染組作為病毒滴度計(jì)算組。根據(jù)公式，計(jì)算本實(shí)驗(yàn)中制備的ZsGreen1慢病毒的滴度 =（2×105×0.1440×1 000）/1=2.88× 107T /ml。

三、K562-IL15-41BBL穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建

K562細(xì)胞系經(jīng)過(guò)IL15-41BBL慢病毒感染和嘌呤霉素篩選后，獲得穩(wěn)定表達(dá)IL15-41BBL蛋白的K562-IL15-41BBL穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。IL15和41BBL兩種蛋白在K562細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)P2A自剪切后，分別單獨(dú)表達(dá)在K562細(xì)胞膜上，如圖4所示。

圖4 K562細(xì)胞內(nèi)目的蛋白自剪切及跨膜表達(dá)

圖5 慢病毒感染前后IL15-41BBL+ K562細(xì)胞的流式檢測(cè)

第一輪病毒感染+嘌呤霉素篩選后IL15-41BBL+ K562細(xì)胞比例約為46.60%，經(jīng)過(guò)兩輪慢病毒感染和嘌呤霉素篩選后，IL15-41BBL+ K562細(xì)胞比例達(dá)到96.50%，感染前后IL15-41BBL+K562細(xì)胞的流式檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖5所示。

四、NK細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)

PBMC細(xì)胞經(jīng)過(guò)輻照的滋養(yǎng)層K562細(xì)胞或K562-IL15-41BBL細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)16 d后，分別獲得NC-NK細(xì)胞和KIB-NK細(xì)胞（圖 6）。

圖6 倒置顯微鏡下觀察經(jīng)滋養(yǎng)層細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)16 d后獲得的兩組自然殺傷細(xì)胞（明場(chǎng)，×100）

總細(xì)胞數(shù)量計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，NC-NK組總細(xì)胞數(shù)為（480.26±34.78）×106個(gè)，KIB-NK組總細(xì)胞數(shù)為（948.95±10.41）×106個(gè)，兩組數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。兩組細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)16 d的生長(zhǎng)曲線(xiàn)圖如圖7所示。

圖7 兩組自然殺傷細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)16 d的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

第0 天的PBMC細(xì)胞、誘導(dǎo)培養(yǎng)第16天的NC-NK細(xì)胞、KIB-NK細(xì)胞的細(xì)胞表型流式檢測(cè)散點(diǎn)圖 （圖8），CD3-CD56+NK細(xì)胞比例分別為8.70%、45.04%和94.79%。

根據(jù)總細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞表型檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算NC-NK組和KIB-NK組中CD3-CD56+NK細(xì)胞的增殖倍數(shù)（圖 9），分別為（1079.12±60.01）倍和（4480.43±37.80）倍，兩組數(shù)據(jù)的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01）。

五、NK細(xì)胞活性和功能檢測(cè)

用流式細(xì)胞法檢測(cè)誘導(dǎo)培養(yǎng)16 d的NC-NK細(xì)胞和KIB-NK細(xì)胞內(nèi)IFN-γ、TNF-α細(xì)胞因子的表達(dá)情況，流式散點(diǎn)檢測(cè)圖見(jiàn)圖10，詳細(xì)檢測(cè)結(jié)果如下：IFN-γ+NC-NK 細(xì)胞比例為（16.28±2.86）%，TNF-α+NC-NK 細(xì)胞比例為（14.53±1.15）%；IFN-γ+KIB-NK 細(xì) 胞 比 例 為（63.07±3.37）%，TNF-α+KIB-NK細(xì)胞比例為（54.85±2.04）%。KIB-NK細(xì)胞內(nèi)兩種細(xì)胞因子的表達(dá)均高于NC-NK細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01，圖 11）。

圖8 外周血單個(gè)核細(xì)胞及誘導(dǎo)培養(yǎng)16 d的兩組自然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞表型流式檢測(cè)

圖9 CD3- CD56+ 自然殺傷細(xì)胞的增殖倍數(shù)比較

用流式細(xì)胞熒光微球技術(shù)檢測(cè)誘導(dǎo)培養(yǎng)16 d的NC-NK細(xì)胞和KIB-NK細(xì)胞上清液中IFN-γ、TNF-α細(xì)胞因子的表達(dá)情況，流式檢測(cè)散點(diǎn)圖如圖12所示，詳細(xì)檢測(cè)結(jié)果如下：NC-NK細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ濃度為 （44.99±4.74）pg/ml，TNF-α濃度為 （11.09±2.45）pg/ml；KIB-NK細(xì)胞培養(yǎng)上清中IFN-γ濃度為 （111.39±6.95）pg/ml，TNF-α濃度為 （32.76±3.23）pg/ml。KIB-NK細(xì)胞培養(yǎng)上清中兩種細(xì)胞因子的含量均高于NC-NK細(xì)胞培養(yǎng)上清，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01，圖 13）。

用LDH法檢測(cè)誘導(dǎo)培養(yǎng)16 d的NC-NK細(xì)胞和KIB-NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞系K562和H520細(xì)胞的殺傷活性，結(jié)果如下：NC-NK對(duì)K562細(xì)胞的殺傷比例為（48.53±6.66）%，NC-NK對(duì)H520細(xì)胞的殺傷比例為（35.85±3.99）%；KIB-NK對(duì)K562細(xì)胞的殺傷比例為（78.52±7.36）%，KIB-NK對(duì)H520細(xì)胞的殺傷比例為（65.03±3.27）%。KIB-NK細(xì)胞對(duì)兩種腫瘤細(xì)胞的殺傷比例均高于NC-NK細(xì)胞，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.01，圖 14）。

討論

NK細(xì)胞在人體外周血內(nèi)存在的數(shù)量很少。腫瘤患者體內(nèi)NK細(xì)胞的數(shù)量及活性都發(fā)生了改變[24]。因此，體外擴(kuò)增出大量高活性、高殺傷能力的NK細(xì)胞，回輸?shù)饺梭w后可以提高機(jī)體免疫力，提高抗腫瘤、抗感染的能力。

目前，體外培養(yǎng)NK細(xì)胞的方法主要有以下2 種：（1）細(xì)胞因子組合法，如采用 IL-2、IL- 15、IL-18、IL-21等細(xì)胞因子誘導(dǎo)NK細(xì)胞體外擴(kuò)增。Torelli等[17]利用IL-2、IL-15誘導(dǎo)培養(yǎng)人 PBMC細(xì)胞，在第14 天 NK細(xì)胞群平均增殖了（15.7±4.7） 倍，存活率為（96±0.5）%；（2）滋養(yǎng)層細(xì)胞法，如采用基因修飾的K562細(xì)胞誘導(dǎo)NK細(xì)胞擴(kuò)增。Baek等[9]利用構(gòu)建的K562-mbIL15-41BBL滋養(yǎng)層細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)人PBMC細(xì)胞，經(jīng)過(guò)21 d的體外培養(yǎng)，NK細(xì)胞增殖倍數(shù)達(dá)到980倍。目前已有的研究顯示，采用滋養(yǎng)層細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)法在NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)和純度上要優(yōu)于細(xì)胞因子組合的擴(kuò)增方案，但仍具有很大的改進(jìn)空間。

圖10 兩組自然殺傷細(xì)胞內(nèi)γ-干擾素、α-干擾素細(xì)胞因子表達(dá)的流式散點(diǎn)檢測(cè)

圖11 兩組自然殺傷細(xì)胞內(nèi)γ-干擾素、α-干擾素細(xì)胞因子表達(dá)陽(yáng)性比例

本研究將IL-15和4-1BBL基因通過(guò)一種自剪切多肽P2A進(jìn)行連接，避免了多基因共表達(dá)時(shí)下游基因表達(dá)量低、蛋白活性低的缺陷。P2A連接的IL-15和4-1BBL基因通過(guò)慢病毒載體導(dǎo)入K562細(xì)胞中，經(jīng)過(guò)嘌呤霉素篩選后，獲得K562-IL15-41BBL穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。K562細(xì)胞表面穩(wěn)定表達(dá)的IL-15和4-1BBL分子均具有促進(jìn)NK細(xì)胞增殖，維持NK細(xì)胞活性的作用，與PBMC細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，可選擇性地激活并擴(kuò)增PBMC細(xì)胞中的NK細(xì)胞。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)過(guò)輻照的K562-IL15-41BBL細(xì)胞可在16 d內(nèi)使PBMC中的NK細(xì)胞純度達(dá)到94.79%，增殖倍數(shù)達(dá)到4 480倍，遠(yuǎn)高于野生型K562細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)組，且優(yōu)于Baek等[9]利用K562-mbIL15-41BBL滋養(yǎng)層細(xì)胞擴(kuò)增NK細(xì)胞的效果。IFN-γ和TNF-α是由活化的NK細(xì)胞釋放的細(xì)胞因子，可提高NK的殺傷功能，對(duì)于機(jī)體抵抗感染、抗腫瘤起著關(guān)鍵作用[25]。胞內(nèi)細(xì)胞因子流式檢測(cè)結(jié)果表明：KIB-NK組細(xì)胞內(nèi)表達(dá)IFN-γ和TNF- α的NK細(xì)胞比例均高于NC-NK組；細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子含量的流式檢測(cè)結(jié)果表明：KIB-NK細(xì)胞分泌的IFN-γ和TNF-α兩種細(xì)胞因子的濃度均高于NC-NK組；體外殺傷實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：KIB-NK細(xì)胞對(duì)K562細(xì)胞和H520細(xì)胞的細(xì)胞毒性均高于NC-NK細(xì)胞。

圖12 兩組自然殺傷細(xì)胞培養(yǎng)上清液中γ-干擾素、α-干擾素細(xì)胞因子的流式散點(diǎn)檢測(cè)

圖13 兩組自然殺傷細(xì)胞培養(yǎng)上清液中γ-干擾素、α-干擾素細(xì)胞因子濃度的比較

圖14 兩組自然殺傷細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞系K562和H520細(xì)胞的殺傷比例

綜上所述，本研究成功制備了穩(wěn)定高表達(dá)IL-15和4-1BBL的K562滋養(yǎng)層細(xì)胞。經(jīng)過(guò)輻照后，該穩(wěn)定細(xì)胞株在體外與PBMC細(xì)胞共培養(yǎng)可獲得高增殖倍數(shù)、高純度和高細(xì)胞毒性的人NK細(xì)胞。該研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于利用自剪切多肽P2A構(gòu)建穩(wěn)定高表達(dá)IL-15和4-1BBL的K562滋養(yǎng)層細(xì)胞株，提高了人PBMC細(xì)胞誘導(dǎo)的NK細(xì)胞增殖效率和細(xì)胞毒活性。跟目前已有技術(shù)相比，只需轉(zhuǎn)染一個(gè)目的蛋白，所表達(dá)蛋白在胞內(nèi)進(jìn)行自剪切，從而提高了IL-15和4-1BBL共同跨膜表達(dá)細(xì)胞的陽(yáng)性數(shù)量和比例；同時(shí)，該方法降低了兩種慢病毒感染滋養(yǎng)層細(xì)胞所導(dǎo)致的細(xì)胞毒性，提升了病毒感染效率，降低了成本。未來(lái)，NK細(xì)胞在治療腫瘤或感染性疾病方面的臨床使用安全性和有效性還需進(jìn)一步研究，隨著NK細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，NK細(xì)胞的臨床應(yīng)用會(huì)越來(lái)越廣泛。