張達(dá) 杜艷輝 袁芳

子宮內(nèi)膜異位癥（endometriosis，EMT）是生活中常見的慢性女性疾病，是子宮內(nèi)膜細(xì)胞游離到子宮外的其他地方并依附生長的現(xiàn)象[1]。全世界平均每年新增幾千萬子宮內(nèi)膜異位患者，且不斷呈上升趨勢[2]。子宮內(nèi)膜異位多出現(xiàn)在年輕女性人群中，隨著雌激素的減少，該病會(huì)逐漸好轉(zhuǎn)，直至消失。子宮內(nèi)膜異位臨床表現(xiàn)多樣，通常有月經(jīng)不規(guī)則、經(jīng)期疼痛等癥狀。甚至?xí)绊懪陨?，造成不孕不育，研究顯示，五成左右的不孕不育患者合并該病癥[3]。目前，認(rèn)為腹腔鏡手術(shù)可明確改善患者的不良情況，減輕子宮內(nèi)膜異位癥給患者帶來的心理壓力及不良情緒[4]。Th17及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）細(xì)胞是兩種重要的CD4+效應(yīng)T細(xì)胞，淋巴介導(dǎo)的細(xì)胞免疫是人體免疫的重要步驟，與自身免疫關(guān)系密切[8]。Th17及Treg能分泌參與人體各項(xiàng)機(jī)能反應(yīng)的炎性因子，其中Th17分泌IL-17、IL-22等，Treg分泌IL-10、TGF-β等[9]。Th17及Treg不僅通過分泌炎性因子參與機(jī)體適應(yīng)性免疫反應(yīng)，還通過其特異轉(zhuǎn)錄因子參與人體各項(xiàng)活動(dòng)，Th17特異轉(zhuǎn)錄因子為ROR-γt，Treg特異轉(zhuǎn)錄因子為FoxP3。在人體中，Treg的異常表達(dá)能誘導(dǎo)免疫性疾病的發(fā)生[10]。研究表明，Treg在多種腫瘤中數(shù)量增多，Treg的過表達(dá)會(huì)降低腫瘤患者的生存率[11]。子宮內(nèi)膜異位患者出現(xiàn)Treg功能紊亂，因此，本篇文章通過流式細(xì)胞儀、HE染色法、qRT-PCR法、ELISA法分析EMT組和NM組患者Th17、Treg細(xì)胞所占比例、子宮內(nèi)膜組織病變情況、ROR-γt、Foxp3 mRNA表達(dá)含量的差異性來探究腹腔鏡手術(shù)與子宮內(nèi)膜異位者體內(nèi)Th17、Treg細(xì)胞的關(guān)系。

資料與方法

一、資料

1.一般資料：選取2017年1月至2018年12月青島大學(xué)附屬醫(yī)院收治的子宮內(nèi)膜異位癥患者 56 例，為子宮內(nèi)膜異位組（EMT 組），年齡 21 ～40 （29.68±3.68）歲。選取同一時(shí)期在醫(yī)院因不孕不育進(jìn)行腹腔鏡檢查的患者56例，為正常組（NM組），年齡20～39 （30.69±4.85）歲。EMT組和NM組患者在一般資料上無差異。此次實(shí)驗(yàn)符合醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：18-126/1709）。

2.納入和排除標(biāo)準(zhǔn)：納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）月經(jīng)規(guī)律；（2）術(shù)前3個(gè)月未進(jìn)行其他方式治療子宮內(nèi)膜異位癥；（3）未患有其他重大疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有痛經(jīng)史及月經(jīng)異常史；（2）調(diào)查期間無故退出活動(dòng)；（3）臨床資料收集不完整。

3.實(shí)驗(yàn)儀器及試劑：ELISA試劑盒（美國R&D systems公司）；染色緩沖液（美國BD Pharmingen 公司）；恒溫?fù)u床（成都蘇凈器材公司）。

二、方法

1.流式細(xì)胞儀檢測Th17、Treg細(xì)胞比例：采集患者外周肘靜脈血3 ml，加入T細(xì)胞抗人抗體10 μl，孵育 20 min，溶解紅細(xì)胞，固定，加 IL-17、Treg 抗體 10 μl，孵育 50 min，洗滌，重懸，檢測比例。

2.檢測EMT組和NM組患者血清中炎性因子水平：采用ELISA法檢測EMT組和NM組患者血清中 IL-17、TGF-β、IL-22、IL-10的水平，本實(shí)驗(yàn)要求在2 min內(nèi)完成并取平均值。

3.HE染色法檢測子宮內(nèi)膜組織病變情況：腹腔鏡術(shù)中取EMT組、NM組患者子宮內(nèi)膜組織。取出的內(nèi)膜組織固定15 min,將內(nèi)膜組織用石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，用山羊血清進(jìn)行封閉處理，蘇木精和伊紅染色液復(fù)染分別為6～8 min和10 s，顯微鏡下觀察異位內(nèi)膜組織形態(tài)。

4.qRT-PCR法檢測子宮內(nèi)膜組織中ROR-γt、Foxp3 mRNA的表達(dá)含量：在子宮內(nèi)膜組織中加入氯仿，搖蕩，離心，使溶液呈乳白狀，4 ℃ 1 200×g離心10 min，加異丙醇，離心，加75%乙醇離心，干燥，-80℃保存。反轉(zhuǎn)錄體系：94℃15 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 34 s，72 ℃ 10 min，重復(fù) 40 次反轉(zhuǎn)錄體系。最后計(jì)算。（表1）

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，通過觀察EMT組和NM組患者的子宮內(nèi)膜組織病變情況、炎性因子、子宮內(nèi)膜組織中 ROR-γt、Foxp3 mRNA 表達(dá)含量用表示，組間差異采用獨(dú)立t檢驗(yàn)，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物序列

結(jié)果

一、流式細(xì)胞儀檢測Th17、Treg細(xì)胞所占比例

EMT組和NM組相比較，EMT組Th17所占比例比NM組高，EMT組患者Treg所占比例比NM組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 7.869，3.015，P=0.014，0.026）。（圖 1，表2）

圖1 EMT組和NM組Th17、Treg細(xì)胞所占比例

表2 EMT組和NM組患者Th17、Treg細(xì)胞所占比例（± s）

表2 EMT組和NM組患者Th17、Treg細(xì)胞所占比例（± s）

分組 例數(shù) Th17細(xì)胞 Treg細(xì)胞EMT 組 56 5.48±2.81 4.22±1.04 NM組 56 2.34±1.01 6.14±1.52 t 值 7.869 3.015 P值 0.014 0.026

二、EMT組和NM組患者血清中Th17分泌IL- 17、IL-22水平

結(jié)果顯示，EMT組和NM組相比較，EMT組IL- 17、IL-22均比NM組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （t=9.944，4.689，P= 0.008，0.017。（圖 2，表3）

圖2 EMT組和NM組血清中IL-17、IL-22水平比較

表3 EMT組和NM組患者血清中Th17分泌IL-17、IL-22水平比較（pg/ml，± s）

表3 EMT組和NM組患者血清中Th17分泌IL-17、IL-22水平比較（pg/ml，± s）

分組 例數(shù) IL-17 IL-22 EMT 組 56 256.38±34.15 67.48±10.89 NM組 56 198.04±27.59 43.78± 6.92 t 值 9.944 4.689 P值 0.008 0.017

三、EMT組和NM組患者血清中Treg分泌IL- 10、TGF-β 水平

結(jié)果顯示，EMT組和NM組相比較，EMT組IL-10比NM組低，TGF-β比NM組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 9.491，2.849，P= 0.012，0.034。（圖 3，表4）

表4 EMT組和NM組患者血清中Treg分泌IL-10、TGF-β水平比較（pg/ml，± s）

表4 EMT組和NM組患者血清中Treg分泌IL-10、TGF-β水平比較（pg/ml，± s）

分組 例數(shù) IL-10 TGF-β EMT 組 56 18.56±4.77 148.28±40.52 NM組 56 28.35±6.07 204.78±19.87 t 值 9.491 2.849 P值 0.012 0.034

圖3 EMT組和NM組血清中IL-10、TGF-β水平比較

四、HE染色法檢測子宮內(nèi)膜組織病變情況

由圖可知，EMT組患者子宮內(nèi)膜組織形態(tài)不規(guī)則，多數(shù)細(xì)胞不完整，破損或缺失，且炎性細(xì)胞增多，在其周圍聚集。NM組患者子宮內(nèi)膜組織形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞沒有明顯破損或缺失，未見細(xì)胞周圍炎性因子增多（圖 4）。

五、qRT-PCR法檢測子宮內(nèi)膜組織中ROR-γt、Foxp3 mRNA的表達(dá)含量

qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，EMT組Foxp3 mRNA的表達(dá)含量比NM組低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 10.996，6.759，P= 0.006，0.011）。（圖 5，表5）。

表5 EMT組和NM組患者子宮內(nèi)膜組織中ROR-γt、Foxp3 mRNA的表達(dá)含量（± s）

表5 EMT組和NM組患者子宮內(nèi)膜組織中ROR-γt、Foxp3 mRNA的表達(dá)含量（± s）

分組 例數(shù) ROR-γ mRNA Foxp3 mRNA EMT 組 56 2.89±0.76 2.25±0.34 NM組 56 1.71±0.26 1.13±0.18 t 值 10.996 6.759 P值 0.006 0.011

討論

子宮內(nèi)膜異位癥為子宮內(nèi)膜細(xì)胞游離到子宮外的其他地方并依附生長的現(xiàn)象[12]。子宮內(nèi)膜異位多發(fā)生在患者的卵巢、直腸等離子宮較近的部位。在病理組織學(xué)中，該病屬于良性范圍，但同時(shí)有增殖、遷移等轉(zhuǎn)移癥狀，應(yīng)予以重視[13]。該病對(duì)患者的生活造成較大的影響，因此，需要盡早進(jìn)行診斷與治療。子宮內(nèi)膜異位癥由于存在個(gè)體差異且形態(tài)多種多樣，因此，術(shù)中正確的分辨病灶對(duì)于手術(shù)切除效率有重要影響。

圖4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察EMT組和NM組子宮內(nèi)膜組織病變情況（HE染色，×400）

圖5 EMT組和NM組子宮內(nèi)膜組織中ROR-γt、Foxp3 mRNA的表達(dá)含量

本文研究結(jié)果顯示，EMT組和NM組相比較，EMT組患者體內(nèi)血清Th17所占比例、炎性因子水平高于NM組，但Treg比例卻與Th17相反。qRT- PCR檢測結(jié)果顯示，ROR-γ mRNA EMT組比NM組高，F(xiàn)oxp3 mRNA EMT組比NM組低。同時(shí)，通過染色觀察到EMT組患者子宮內(nèi)膜組織形態(tài)不規(guī)則，多數(shù)細(xì)胞不完整，破損或缺失，NM組患者子宮內(nèi)膜組織形態(tài)規(guī)則，細(xì)胞沒有明顯破損或缺失。研究顯示，在人體中，Th17、Treg細(xì)胞是CD4+T淋巴細(xì)胞中的2個(gè)主要因子，他們?cè)谌梭w內(nèi)部的所有生理反應(yīng)中都占有重要地位，同時(shí)也是腫瘤發(fā)生過程中、炎性因子形成中的重要參與因子[15]。其中，Th17細(xì)胞發(fā)揮生理作用主要是通過分泌IL-17、IL-22應(yīng)對(duì)人體中出現(xiàn)的機(jī)理病變。Treg細(xì)胞發(fā)揮生理作用主要是通過分泌IL-10、TGF-β等抑制性細(xì)胞因子，在人體的免疫系統(tǒng)及炎癥反應(yīng)中占重要地位[16]。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，當(dāng)有病原入侵或自身有炎癥時(shí)，人體免疫系統(tǒng)就將Treg細(xì)胞聚集到病灶處，用于消滅或清除病灶或炎癥，同時(shí)，促炎因子通過上調(diào)內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)一步聚集Th17細(xì)胞，Th17細(xì)胞增多能夠促進(jìn)子宮內(nèi)膜異位癥病情的進(jìn)一步發(fā)展，加重患者的癥狀[17]。外國學(xué)者研究證實(shí)，內(nèi)異癥患者腹腔液中存在大量的Th17細(xì)胞，該細(xì)胞能夠快速促進(jìn)內(nèi)膜病變組織的增殖、遷移，從而使患者病情加重，促進(jìn)病情發(fā)展[18]。通過病例對(duì)照的方法，相關(guān)學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，患有子宮內(nèi)膜異位癥的患者其自身的Treg細(xì)胞分布雜亂無章[19]。其患者的腹腔液中及血清中Treg細(xì)胞出現(xiàn)不同，患者腹腔液中Treg分泌細(xì)胞因子濃度明顯升高，從而進(jìn)一步誘導(dǎo)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)。因此，Th17、Treg在子宮內(nèi)膜異位癥中發(fā)揮重要作用，它們之間相互影響，可作為判斷機(jī)體細(xì)胞免疫能力的指標(biāo)[20]。本篇文章所得結(jié)果與上述學(xué)者研究一致。

綜上所述，子宮內(nèi)膜異位癥患者外周血免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞Th17/Treg平衡失調(diào)，免疫調(diào)節(jié)紊亂與子宮內(nèi)膜異位發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。