■冷向軍

(上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院，上海201306)

隨著全球水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的快速發(fā)展，魚粉等優(yōu)質動物蛋白資源的緊缺已成為制約水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要因素。開發(fā)新的飼料資源，提高現(xiàn)有飼料資源的利用率，是飼料行業(yè)所面臨的重大問題。近年來，許多動植物蛋白源被開發(fā)出來用以降低或取代魚粉的使用量，比如豆粕、菜粕、棉粕、肉骨粉、血粉等，其中植物蛋白源因其資源量大，價格低而廣泛應用于水產(chǎn)飼料中。然而與魚粉相比，這些植物蛋白源通常具有一種或多種方面的不足，如氨基酸組成不平衡，存在抗營養(yǎng)因子(植酸、非淀粉多糖等)、適口性較差、消化率較低等，限制了植物蛋白源在水產(chǎn)飼料中的大量使用。為提高植物蛋白源的利用率，一些營養(yǎng)策略與技術已被開發(fā)并應用于飼料工業(yè)中。利用發(fā)酵工程和基因工程等生物技術手段開發(fā)出的酶制劑，能夠提高飼料的利用率，在很大程度上緩解飼料資源緊缺的狀況。酶制劑因高效、安全、環(huán)保，符合資源節(jié)約型社會的要求而受到高度重視。

飼用酶制劑是從微生物、動物、植物中提取的具有酶特性的一類物質，其中微生物來源的酶制劑應用最為廣泛。飼用酶制劑的種類很多，按照動物自身能否合成，可分為消化酶和非消化酶。消化酶指動物體內(nèi)能夠合成并分泌到消化道進行消化的酶類，也稱內(nèi)源酶，主要包括淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶；非消化酶指動物體自身通常不能合成酶類，也稱外源酶，包括植酸酶、纖維素酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、果膠酶等。按照酶制劑的類型來分，可分為單一酶制劑和復合酶制劑。根據(jù)酶的作用底物，可分為蛋白酶、脂肪酶、碳水化合物酶、植酸酶等。

1 植酸酶

在植物性原料中，磷的主要存在形式是植酸磷，包括植酸及其鹽類，通常占總磷的70%左右，表1列出了幾種常用植物性原料中的植酸磷含量。

表1 幾種植物性原料中的植酸磷含量

對于養(yǎng)殖動物而言，其自身不能分泌植酸酶降解植酸磷，并且植酸磷還會結合其他營養(yǎng)素成分，如礦物質等，降低其利用率。Chowdhury等(2012)發(fā)現(xiàn)植酸磷可結合堿性氨基酸如組氨酸、賴氨酸、精氨酸等，從而降低整個氨基酸的利用效率。

植酸酶是催化植酸及植酸鹽水解成肌醇與磷酸(或磷酸鹽)的一類酶的總稱。目前，植酸酶在飼料工業(yè)中的應用已有20多年歷史，最早是應用于豬、禽動物飼料中，近些年，植酸酶在水產(chǎn)飼料中的使用正在不斷擴大。目前在水產(chǎn)飼料中使用的植酸酶主要來自于曲霉(Aspergillus)，根據(jù)其作用環(huán)境，可分為酸性植酸酶和中性植酸酶；根據(jù)其形態(tài)，有粉末、液體劑型，也有采用包被或微膠囊處理的方式，以增加其穩(wěn)定性。在使用方式上，可直接在飼料中添加，也有采用后噴涂和原料預處理的方法。

植酸(鹽)降解后，可釋放出肌醇、無機磷以及與植酸(鹽)相結合的營養(yǎng)素，從而提高其利用效率(Cheng等，2002)。Sajjadi等(2004)發(fā)現(xiàn)大西洋鮭飼料中添加植酸酶后，緩解了植酸對蛋白質消化帶來的負面影響；Liu等(2013)采用原料預處理和后噴涂的方法添加植酸酶，發(fā)現(xiàn)當植酸酶的添加量在1 000 U/kg時，草魚對粗蛋白質、粗脂肪、干物質、灰分、磷和鈣的消化率顯著提高。類似的結果也見于Zhu等(2015)對黃顙魚的報道。

飼料中添加植酸酶后，由于提高了磷的利用率，故可減少無機磷的添加，進而節(jié)約飼料成本，減少對環(huán)境的磷排放。Cheng等(2016)發(fā)現(xiàn)，黃顙魚飼料中50%的磷酸二氫鈉可以被植酸酶(1 000 IU/kg)取代，并且由于氮、磷利用率的提高，氮、磷排泄減少了25%和31%。Li等(2018)將羅非魚飼料中磷酸二氫鈣的添加量從1.8%(對照組)降為1.2%，同時補充中性植酸酶0.4 g/kg(2 000 U/g)，魚體增重和飼料系數(shù)與對照組沒有差異；在磷酸二氫鈣含量為1.0%的飼料中添加800 IU/kg中性植酸酶可促進異育銀鯽生長，提高干物質和磷的表觀消化率，800 IU/kg中性植酸酶在底物充足條件下可代替0.5%磷酸二氫鈣的添加(張曉清等，2016)。

目前，大部分商業(yè)植酸酶均為酸性植酸酶，其最適pH值為4.0～6.0，這就限制了此類植酸酶在無胃魚類和蝦類飼料中的應用。已有研究表明，在飼料中補充酸性植酸酶對斑節(jié)對蝦(Biswas等，2007)、日本對蝦(Bulbul等，2015)和南亞野鯪(Xavier等，2012)的生長性能并無影響，但補充中性植酸酶卻改善了異育銀鯽(Liu等，2012)的生長性能和營養(yǎng)物質消化率。故在植酸酶的選擇上需根據(jù)動物的消化道酸堿性確定。

2 碳水化合物酶

植物細胞和動物細胞的最大差異在于植物細胞具有細胞壁，這是影響植物性原料利用率的主要原因。細胞壁參與維持細胞的形態(tài)、增強細胞的機械強度，并與細胞的生理活動有關。細胞壁從結構上可以分為三層：胞間層、初生壁、次生壁。胞間層又稱中膠層，為兩相鄰細胞所共有的一層膜，主要成分為果膠質；初生壁是細胞分裂后，最初由原生質體分泌形成的細胞壁，主要成分為纖維素、半纖維素，并有結構蛋白存在；部分植物細胞在停止生長后，其初生壁內(nèi)側繼續(xù)積累形成次生壁，位于質膜和初生壁之間，主要成分為纖維素，并常有木質存在?？梢?，構成細胞壁的成分中，絕大部分是多糖，主要是纖維素、半纖維素和果膠類，由葡萄糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、半乳糖醛酸等聚合而成，另有少量蛋白質。這些細胞壁成分難以消化，在很大程度上阻止了細胞內(nèi)容物與消化酶的接觸，這是植物性原料消化率較低的重要原因。

從動物營養(yǎng)的角度出發(fā)，這些細胞壁多糖基本上屬于非淀粉多糖(NSP)；此外，在細胞內(nèi)容物中也含有NSP。植物性原料中的NSP含量較高，特別是餅粕類蛋白原料。表2列出了幾種常用植物性原料中的NSP含量。根據(jù)其溶解性，NSP可分為不溶性NSP（如纖維素）和可溶性NSP（如阿拉伯木聚糖）。近年來，可溶性NSP的抗營養(yǎng)作用日益受到關注。它們與水分子直接作用增加溶液黏度，多糖分子本身也纏繞成網(wǎng)狀結構，引起溶液黏度增加，甚至形成凝膠，使得食糜變黏，減少了酶與底物的接觸，阻止養(yǎng)分接近腸黏膜表面，從而降低養(yǎng)分消化率。動物消化道缺乏相應的內(nèi)源酶而難以將其降解。因此，降解NSP，一方面可解除植物細胞壁的屏蔽效應，另一方面可降低黏度，降低其抗營養(yǎng)作用，從而提高植物性原料的消化利用率。

表2 幾種植物性原料中的NSP含量

碳水化合物酶是能降解碳水化合物多聚體的一類酶的總稱。添加碳水化合物酶可提高生能營養(yǎng)素如淀粉、脂肪的消化率(Adeola，2004)；脂肪消化率的提高主要來于碳水化合物酶對NSP的降解，而NSP可以增加膽鹽的水解而降低脂肪的消化率(Vahjen等，2007)。此外，碳水化合物酶可以改善攝食高NSP飼料動物的腸道健康。NSP產(chǎn)生的高黏性降低了營養(yǎng)物質的擴散率，導至顆粒物質的積累，使得一些有害生物大量增殖(Vahjen等，1998)，通過降低食糜黏度，碳水化合物酶可以消除對腸道微生態(tài)平衡產(chǎn)生的不利影響。NSP水解后，產(chǎn)生的寡糖片段，可以為有益微生物利用，通過產(chǎn)生乳酸和有機酸，降低氨的產(chǎn)生(Kiarie等，2007)，增加揮發(fā)性脂肪酸的濃度(Hübener等，2002)，進而改善動物腸道健康和機體健康。

近年來，有關碳水化合物酶在水產(chǎn)營養(yǎng)中的研究開始增多。在草魚的研究表明，纖維素酶顯著提高了生長性能，促進了內(nèi)源性消化酶的分泌，腸道微生物組成也發(fā)生了相應變化(Zhou等，2013)；在小麥基礎飼料中分別添加不同水平木聚糖酶(0.05%、0.10%、0.15%)，顯著降低了尼羅羅非魚的腸道食糜黏度，中、后腸絨毛表面的黏附性顆粒數(shù)量減少,顆粒直徑減小，中、后腸微絨毛的密度和高度得到不同程度的改善(聶國興等，2007)；在以DDGS部分取代魚粉的飼料中補充木聚糖酶(20 g/t)和纖維素酶(300 g/t)，提高了大菱鲆幼魚對飼料的利用效果(隋仲敏等，2017)。然而，在以菜粕為主要植物蛋白原料的尼羅羅非魚飼料中添加纖維素酶，對生長和營養(yǎng)物質利用沒有改善(Yigit等，2011)；在含10%、20%豆粕的飼料中添加復合酶Superzyme CS(木聚糖酶、淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶和β-葡聚糖酶)，對虹鱒生長性能沒有影響，但降低了糞便黏性和沉降速度(Ogunkoya等，2006)。這些不同的研究結果與所添加酶的種類、數(shù)量、飼料組成等因素有關。

有關NSP和碳水化合物的作用機理，在畜禽動物上研究較多，而在水產(chǎn)動物上研究較少。由于生活環(huán)境和生理特點的不同，水產(chǎn)動物腸道中的水分含量較高(Refstie等，1999)，這使得其黏性較低(Sinha等，2011)，可能NSP產(chǎn)生的黏性抗營養(yǎng)作用，在水產(chǎn)動物中不如畜禽動物明顯。

目前市場上的主要碳水化合物酶產(chǎn)品是木聚糖酶、葡聚糖酶，占了全球碳水化合物酶市場的80%(Castillo等，2015)，其他的一些碳水化合物酶有α-淀粉酶、木聚糖酶、葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、果膠酶、纖維素酶等。

3 蛋白酶

蛋白酶是水解蛋白質產(chǎn)生小肽和氨基酸的一大類酶的總稱，蛋白酶的種類甚多，根據(jù)其作用環(huán)境，有酸性、中性、堿性蛋白酶之分，根據(jù)其成分，有單一蛋白酶和復合蛋白酶。目前的蛋白酶產(chǎn)品主要來自于細菌或真菌。飼料中補充蛋白酶，可以彌補動物自身蛋白酶的不足，促進大分子蛋白質降解，提高蛋白質消化利用率。

以植物蛋白原料取代魚粉后，通常會導致消化道蛋白酶活性的下降。Lin等(2011)以豆粕取代基礎飼料(含魚粉20%)中25%、50%、75%和100%的魚粉，發(fā)現(xiàn)隨豆粕用量的增加和魚粉用量的減少，羅非魚腸道和肝胰腺蛋白酶的活性極顯著下降，而淀粉酶的活性則無顯著變化。在凡納濱對蝦日糧中，隨大豆?jié)饪s蛋白替代魚粉比例的增加，肝胰腺蛋白酶活性也表現(xiàn)出下降的規(guī)律，脂肪酶、淀粉酶活性與對照組相比沒有顯著變化(Chen等，2017)；類似的報道也見于鯉魚(冷向軍等，2008)?？梢姡谥参锏鞍状罅繎煤汪~粉用量減少后，補充蛋白酶對于提高植物蛋白的消化利用率具有重要意義。

Drew等（2005）在菜粕-豌豆型飼料中添加250 mg/kg蛋白酶，顯著提高了虹鱒對粗蛋白質、脂肪、能量和干物質的消化率；在另一項虹鱒的試驗中，在豆粕型飼料中添加228 mg/kg蛋白酶(一種絲氨酸蛋白酶)顯著改善了營養(yǎng)物消化率，但在葵花籽粕、菜粕型飼料中補充蛋白酶則沒有觀察到改善效應(Dalsgaard等，2012)；在異育銀鯽的研究中，將魚粉含量從9%降到3%，同時在顆粒飼料中補充蛋白酶后，顯著改善了魚體生長性能，提高了營養(yǎng)物質消化率，但在膨化飼料中補充蛋白酶則對生長和飼料利用沒有影響，其原因可能在于膨化加工過程中的高溫高壓已使大部分蛋白酶失活，再者，飼料膨化后提高了營養(yǎng)物質的利用率，已經(jīng)能滿足魚體的營養(yǎng)需要，故補充蛋白酶后沒有觀察到改善效應(Shi等，2016)。在凡納濱對蝦(Li等，2016)、羅非魚(Li等，2018)上也有補充蛋白酶后改善了魚體生長性能和飼料利用的報道。然而，在羽扇豆(脫殼)型飼料中補充蛋白酶，對虹鱒生長性能并無改善(Farhangi等，2007)?？梢?，蛋白酶的作用效果與其底物密切相關。

此外，一些研究表明，在虹鱒(張娟娟等,2012)、羅非魚(Li等，2018)飼料中補充蛋白酶后，增加了腸絨毛的高度，改善了腸道組織結構。

4 脂肪酶

脂肪酶可將脂肪水解為甘油一酯、甘油二酯和游離脂肪酸，是動物體內(nèi)的一種重要消化酶。楊新文等(2010)在飼料中添加100、300 mg/kg脂肪酶，顯著降低了南方鲇的飼料系數(shù)，提高了粗脂肪消化率和蛋白質效率，增重率在數(shù)值上也有提高；在瓦氏黃顙魚飼料中添加300 mg/kg脂肪酶，提高了魚體增重率9.29%，降低了飼料系數(shù)6.35%(谷金皇等，2010)；在低蛋白質高脂肪飼料中添加脂肪酶提高了草魚的生長性能和腸道免疫力(Liu等，2016)。然而在花鱸的研究中，在低蛋白高脂飼料中補充100～800 mg/kg脂肪酶，對生長并無改善，甚至導致了一定程度下降，粗脂肪和部分脂肪酸的表觀消化率也下降，這可能是外源脂肪酶添加量過高導致內(nèi)源酶活性降低，以及脂肪酶水解產(chǎn)生的游離脂肪酸過多而影響了脂肪酸的消化吸收所致(王國霞等，2017)。

總體來看，與植酸酶、蛋白酶、碳水化合物酶相比，脂肪酶在水產(chǎn)上的研究應用比較少，這可能與其穩(wěn)定性較差、底物不溶于水、生產(chǎn)成本較高等原因有關。此外，除冷水性魚類和肉食性魚類外，水產(chǎn)飼料中的脂肪水平并不高，且水產(chǎn)動物對脂肪具有較高的吸收利用率，脂肪酶在水產(chǎn)飼料中的重要性似乎不及其他幾類酶制劑。

5 酶制劑使用中的問題與展望

5.1 酶的穩(wěn)定性與添加方式

酶制劑應用于飼料中，最大的關注點是其穩(wěn)定性，包括飼料加工中的溫度、水分、壓力對酶活性的影響，飼料貯存過程中酶活性的損失，酶進入動物消化道后，能否耐受胃酸的影響(有胃魚類)而到達小腸的作用部位。開發(fā)穩(wěn)定性的酶制劑一直是酶制劑工業(yè)努力的方向。可以采用穩(wěn)定化技術來提高酶的耐熱性，如物理包埋、化學修飾等方法；也可采用基因工程等生物技術手段，開發(fā)出穩(wěn)定的酶制劑，或在極端環(huán)境中尋求耐高溫微生物，產(chǎn)生耐高溫的酶。

根據(jù)酶制劑的穩(wěn)定性和飼料生產(chǎn)方式，酶制劑的添加主要有直接添加、制粒后添加和在原料中添加(原料預處理)三種方式。

直接添加：使用粉狀飼料時，可以直接添加酶制劑，混合均勻后進行飼喂。如是耐高溫的酶，也可以直接加到飼料中再制粒。

制粒后添加：為了避免調(diào)質、制粒過程中造成酶活性的損失，可采用制粒后噴酶技術，通常采用液體酶，通過噴霧系統(tǒng)，將酶均勻地噴涂到顆粒飼料表面。

原料中添加(原料預處理)：飼料原料在使用之前用酶制劑進行水解，可降解部分抗營養(yǎng)因子，提高飼料的營養(yǎng)價值。如使用纖維素酶、木聚糖酶等碳水化合物酶降解細胞壁和NSP，使用植酸酶降解植酸，使用蛋白酶降解大分子蛋白，這些酶解過程可單獨進行，也可復合進行，但前提是這些酶具有相近的水解條件。這些酶解技術，是生產(chǎn)酶解豆粕等原料的理論基礎。相比較而言，利用植酸酶對原料進行預處理的方式較為普遍。在大多數(shù)的研究中，植酸酶的作用溫度和pH值分別為50～55℃和5.0～5.5，也有少量報道為30～37℃溫度和微堿性pH值。

5.2 酶的作用環(huán)境

酶的水解作用，需要一個適宜的溫度、酸堿性和水分環(huán)境。大多數(shù)商業(yè)植酸酶的適宜水解溫度是40～60℃，顯然水產(chǎn)動物體內(nèi)無法提供如此高的溫度，特別是冷水性魚類的體溫更低。在水產(chǎn)動物消化道內(nèi)，酶的水解效果難以達到其最佳水平。開發(fā)作用溫度較低的酶類，以及研究在水產(chǎn)動物生理條件和溫度下酶的水解作用，是今后酶制劑研究和應用的一個方向。

魚類的消化道組成具有很大的多樣性，有的有胃，有的無胃；蝦類的消化道又具有與魚類不同的特點，比如蝦的胃主要進行機械性消化，其主要的消化吸收部位是肝胰腺。不同的消化道結構特點，使其酸堿性表現(xiàn)不一，因而在選擇酶制劑時，需注意酶的作用環(huán)境是酸性、堿性或中性，即選擇酸性、堿性或中性酶制劑。

5.3 酶的作用底物與基礎飼料組成

酶的作用具有高度專一性，只能作用于具有特定化學鍵的底物。飼料原料結構不同，酶作用的底物不同，因而效果不同。要充分發(fā)揮酶制劑的作用，應根據(jù)飼料組成而選擇相應的酶制劑。比如，在虹鱒的豆粕型飼料中添加蛋白酶顯著改善了營養(yǎng)物質的消化率，但在葵花籽粕、菜粕型飼料中補充同樣的蛋白酶，則沒有觀察到改善效應(Dalsgaard等，2012)；在選用碳水化合物酶降解NSP時，首先要清楚基礎配方中主要的NSP和水溶性NSP是什么，然后針對性的選擇木聚糖酶、甘露聚糖酶、葡聚糖酶等。

基礎配方的營養(yǎng)水平會對酶的作用效果會產(chǎn)生顯著影響。Kumar等(2006)發(fā)現(xiàn)，在粗蛋白質含量27%的飼料中補充α-淀粉酶，改善了南亞野鯪的生長和蛋白質利用，但在35%粗蛋白質飼料中補充則無改善效應；在含未糊化淀粉飼料中補充淀粉酶，觀察到了對生長的改善效應，但在含糊化淀粉飼料中補充則無改善；其原因可能與糊化淀粉易水解導致葡萄糖吸收過快而產(chǎn)生代謝應激有關。冷向軍等(2008)在魚粉含量10%的鯉魚飼料中補充蛋白酶顯著提高了魚體增重和飼料利用，但在魚粉含量15%、20%的飼料中補充蛋白酶則未對魚體增重和飼料利用產(chǎn)生顯著影響。可見，在營養(yǎng)水平較低的基礎飼料中補充酶制劑，才能產(chǎn)生較好的改善效果。

5.4 酶的復配

植物性原料中含有多種抗營養(yǎng)因子，單靠一種酶是難以降解的。以植物細胞壁為例，要實現(xiàn)其完全降解，需要纖維素酶、半纖維素酶(包括木聚糖酶、甘露聚糖酶等)、木質素酶、果膠酶四大系列酶類，在細胞內(nèi)容物暴露出來后，還需要NSP酶、植酸酶、蛋白酶等，顯然多種酶的復合，其效果優(yōu)于單一酶制劑。然而，多種酶復合后，并不是每一種酶都發(fā)揮著同等重要的作用。Tahir等(2008)評估了單獨或復合添加半纖維素酶、纖維素酶和果膠酶的作用效果，發(fā)現(xiàn)半纖維素的水解是整個酶解過程的限速步驟，這意味著纖維素酶和果膠酶在NSP降解方面發(fā)揮的作用較少。酶制劑的復配效果與飼料原料組成有關，今后應就酶制劑的單一添加和復合添加的效果進行比較研究。

多種酶制劑的復配，并不意味著要將植物細胞壁和NSP完全降解為單糖，實際上，細胞壁和NSP的部分降解已經(jīng)達到了破壞抗營養(yǎng)因子的目的，并且產(chǎn)生的寡糖片段具有益生元的功能，可促進腸道有益微生物的生長，改善腸道微生態(tài)平衡。

5.5 酶在飼料加工過程中的作用

傳統(tǒng)觀點認為，酶制劑在進入動物消化道后才開始發(fā)揮作用，但在生產(chǎn)中，一些酶制劑在調(diào)質、制粒、后熟化后，其活性已大部分消失，但飼養(yǎng)試驗的效果卻不錯，這表明，酶的作用不只局限在動物體內(nèi)，在飼料加工的過程中就已經(jīng)開始發(fā)揮作用了。Li等（2016）用試驗證明了在制粒和熟化過程中，蛋白酶已經(jīng)發(fā)揮了水解蛋白質的作用，該蛋白酶經(jīng)過制粒和后熟化過程后，活性可保留79.3%和67.5%。這提示我們，在飼料調(diào)質過程中，可以通過延長調(diào)質時間，適當降低調(diào)質溫度，從而更充分的發(fā)揮酶的水解作用，實際上，這也是原料預處理的一種方式。當然，這種方式的前提條件是所用酶制劑具有較高的耐溫性。

總體來看，酶制劑在水產(chǎn)飼料中的應用，已經(jīng)取得了一定成效。隨著穩(wěn)定性酶制劑和符合水產(chǎn)動物生理特點酶制劑的開發(fā)，酶制劑將在水產(chǎn)飼料中得到更多的應用，從而提高飼料利用率，節(jié)約飼料資源，促進水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的可持發(fā)展。