丁銳 陳旭輝 李炳學(xué)

（1. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)土地與環(huán)境學(xué)院，沈陽 110866；2. 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，沈陽 110866）

磷是植物生長發(fā)育必需的營養(yǎng)元素，同時(shí)也是許多國家農(nóng)業(yè)生產(chǎn)重要的限制因素。從世界范圍來看，土壤中的總磷含量較豐富，但95%以上都以無效磷的形式存在而不能被植物吸收利用，因此施加外源磷肥一直被作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中維持作物產(chǎn)量的重要手段［1］。然而，作物對磷肥的利用率較低，大部分磷肥施用后會(huì)迅速與土壤中的物質(zhì)發(fā)生磷的固定，形成難溶性的磷酸鹽而累積在土壤中［2］。長期持續(xù)施用磷肥不但會(huì)造成磷礦資源的巨大浪費(fèi)，同時(shí)也容易引起土壤板結(jié)、酸化、面源污染及水體污染等一系列生態(tài)問題［3］。要想解決土壤中磷素的限制問題，根源在于解決磷的利用問題，提高土壤中磷素的利用率對可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展具有戰(zhàn)略意義［4］。

植酸是土壤有機(jī)磷的主要形態(tài)，也是植物生長所需磷素的重要供給源之一［5-7］。植酸中固定的磷不能被植物直接利用，需要降解為無機(jī)磷酸根后才能被植物吸收。土壤中植酸的降解屬于酶促反應(yīng)，主要依靠土壤微生物產(chǎn)生植酸酶，因此植酸酶在自然界磷素循環(huán)中起著重要作用。目前，關(guān)于飼用植酸酶已有深入研究并得到了廣泛應(yīng)用，而有關(guān)土壤植酸酶及其對土壤有機(jī)磷轉(zhuǎn)化作用的研究相對較少，其作為土壤改良劑的應(yīng)用潛力也有待深入發(fā)掘。

目前，高通量的宏基因組技術(shù)在發(fā)掘自然環(huán)境中潛在的微生物資源和新型功能基因方面展現(xiàn)出巨大潛力，其優(yōu)點(diǎn)是不需要進(jìn)行微生物的純培養(yǎng)，而是直接從環(huán)境樣品中提取微生物總基因組DNA即可進(jìn)行研究［8］?；蚪M技術(shù)的應(yīng)用標(biāo)志著植酸酶研究進(jìn)入一個(gè)新時(shí)代。本文擬對植酸酶的研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，以及在基因組時(shí)代下土壤植酸酶在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用前景與面臨的挑戰(zhàn)進(jìn)行分析與展望。

1 植酸酶的分類及性質(zhì)

植酸酶屬于磷酸單脂水解酶類，可以催化植酸水解脫掉磷酸基團(tuán)，是一種胞外酶。植酸酶廣泛分布于自然界中，在動(dòng)物、植物和微生物中都有發(fā)現(xiàn)［9-11］，土壤中的植酸酶主要由土壤微生物分泌產(chǎn)生。植酸酶種類豐富，其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)差異較大，催化機(jī)理也各不相同。根據(jù)植酸酶的最適pH可將其分為堿性植酸酶和酸性植酸酶，真菌以及絕大多數(shù)的細(xì)菌和植物可分泌酸性植酸酶，而少部分細(xì)菌和植物能產(chǎn)生中性或偏堿性植酸酶［12］。根據(jù)植酸酶催化機(jī)理的不同可將其分為4類［13］，一是組氨酸酸性植酸酶（Histidine acid phosphatase，HAP），是多數(shù)真菌和腸桿菌來源的植酸酶，目前應(yīng)用較廣泛；二是β-螺旋植酸酶（β-propeller phytases，BPP），該類植酸酶主要來源于芽孢桿菌并具有較好的熱穩(wěn)定性；三是半胱氨酸植酸酶（Cysteine phosphatase，CP），目前僅在瘤胃微生物中發(fā)現(xiàn)；四是紫色酸性植酸酶（Purple acid phosphatase，PAP），在哺乳動(dòng)物、植物、真菌和細(xì)菌中廣泛分布。

植酸酶的活性受環(huán)境pH、溫度等因素影響。研究發(fā)現(xiàn)，不同來源植酸酶的最適pH差異較大，細(xì)菌植酸酶最適pH一般為中性或偏酸性，而真菌植酸酶一般為2.5-7.0，大部分植酸酶的最適pH在4.0-7.5之間，在pH＜ 3.0時(shí)植酸酶活性顯著下降甚至完全失活［9，13-14］。一般來說，植酸酶在50-70℃的范圍內(nèi)都具有高活性，多數(shù)情況下其活性在45-60℃范圍內(nèi)較穩(wěn)定，更高溫度下容易失活。

2 植酸酶基因多樣性

植酸酶基因主要分為動(dòng)物、植物和微生物3種不同來源，已被研究的植酸酶大多數(shù)來源于微生物，如大腸桿菌、假單胞桿菌、枯草芽孢桿菌等細(xì)菌以及酵母屬、曲霉屬、梨形毛霉、少孢根霉和枝孢霉屬等真菌［15-16］。迄今為止，被分離并克隆的植酸酶基因已經(jīng)達(dá)到了幾十種，有相當(dāng)一部分實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)并進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)檢測［17-20］，其中來源于微生物的植酸酶基因主要包括：來源于真菌的phyA（B）基因、來源于芽孢桿菌的phyC（L）基因、來源于大腸桿菌的appA基因。

研究表明，植酸酶基因的同源性越高，其序列相似性往往也越高。Mukhametzynova等［13］比較了NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的所有芽孢桿菌phyC基因，發(fā)現(xiàn)其序列相似性極高，該結(jié)果同時(shí)也在曲霉屬真菌不同物種的phyA基因中被證實(shí)，曲霉屬的phyA基因無論在核苷酸來源、編碼的氨基酸序列等基因結(jié)構(gòu)上，還是在基因產(chǎn)物的酶學(xué)特性上均具有較高的相似性。與真菌來源的植酸酶相比，來源于細(xì)菌的植酸酶的編碼基因較短，編碼蛋白的分子量也較小，與來自真菌的植酸酶基因幾乎沒有同源性［13，21］。此外，細(xì)菌來源的植酸酶通常具有較高的酶活性，但其熱穩(wěn)定性和pH耐受性相對較差［21］。

隨著研究的不斷深入，近年來已有越來越多的新型植酸酶基因被克隆和鑒定［22-26］，為發(fā)掘和利用自然界潛在的植酸酶資源以及研究新型功能基因奠定了基礎(chǔ)，其中高熱穩(wěn)定性、高耐酸性植酸酶基因是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。利用基因工程手段定點(diǎn)突變植酸酶基因使其定向進(jìn)化，也是一種獲得高穩(wěn)定性植酸酶的方法。通過對影響植酸酶熱穩(wěn)定性、最適pH、活性氨基酸殘基進(jìn)行研究，并通過基因工程改造獲得優(yōu)良的植酸酶是該領(lǐng)域研究的發(fā)展趨勢［27］。

3 植酸酶的獲取技術(shù)

為了獲取在某個(gè)特定領(lǐng)域有應(yīng)用價(jià)值的植酸酶，最初人們通過原酶的蛋白純化進(jìn)而研究酶的性質(zhì)［28］。隨著宏基因組技術(shù)的廣泛應(yīng)用，酶的分子生物學(xué)研究有了很大進(jìn)展，植酸酶基因的分子克隆變得越來越容易［29］。Huang等［30］利用宏基因組技術(shù)發(fā)現(xiàn)草魚腸道內(nèi)具有很高的植酸酶基因多樣性，其中β-螺旋植酸酶是草魚腸道環(huán)境的優(yōu)勢植酸酶，且該酶基因大部分都來自于不可培養(yǎng)的細(xì)菌類群。Huang等［31］通過構(gòu)建波爾山羊和荷蘭牛瘤胃微生物的宏基因組文庫，研究了瘤胃植酸酶基因的豐度、多樣性及酶特性，共得到101個(gè)半胱氨酸植酸酶基因并篩選出一個(gè)具有植酸降解能力的新型基因。Tan等［25］構(gòu)建了農(nóng)田土壤的宏基因組文庫，利用功能基因篩選的方法獲得了兩個(gè)新型植酸酶基因，其中一個(gè)植酸酶的編碼基因?qū)儆诮M氨酸酸性植酸酶家族，而另一個(gè)植酸酶則由多個(gè)開放閱讀框共同編碼，不同于目前已知的所有植酸酶家族，該植酸酶展現(xiàn)了較強(qiáng)的植酸降解能力，其作用機(jī)制及應(yīng)用潛力有待深入研究。Farias等［32］通過構(gòu)建紅米秸稈殘留物和蓖麻餅的宏基因組文庫并采用功能基因篩選的方法獲得了一個(gè)新型β-螺旋植酸酶基因，該重組植酸酶在中性pH條件下具有較強(qiáng)的催化活性，揭示了其在飼料添加工業(yè)中具有潛在應(yīng)用價(jià)值。Zhang等［26］利用宏基因組技術(shù)研究了深圳灣紅樹林根圍沉淀物的細(xì)菌群落多樣性，從中分離獲得29個(gè)產(chǎn)植酸酶的可培養(yǎng)菌株，分析了它們的植酸降解能力和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，并篩選獲得一個(gè)具有較強(qiáng)植酸降解能力的菌株。

4 提高植酸酶產(chǎn)率的策略

植酸酶的生產(chǎn)目前主要采用微生物發(fā)酵的方法，但原產(chǎn)植酸酶的微生物大多數(shù)不適合大規(guī)模發(fā)酵培養(yǎng)，因此，通過基因工程技術(shù)手段將植酸酶基因轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)木N使其高效表達(dá)，從而構(gòu)建植酸酶高產(chǎn)菌株已成為植酸酶研究的發(fā)展趨勢，在合適的宿主中克隆和表達(dá)植酸酶基因可以進(jìn)一步提高植酸酶產(chǎn)量［33］。目前，植酸酶基因已經(jīng)在多種表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)，如大腸桿菌和巨大芽孢桿菌的原核表達(dá)系統(tǒng)［26，30，34］、巴斯德畢赤酵母的真核表達(dá)系統(tǒng)以及玉米、擬南芥、水稻、煙草等植物表達(dá)系統(tǒng)［34-37］。例如，姚斌等［34］將從Bacillus subtilis中分離出的中性植酸酶基因克隆入大腸桿菌，IPTG誘導(dǎo)獲得了高效表達(dá)的植酸酶。Ushasree等［18］成功克隆了Aspergillus niger中的植酸酶基因并將其在大腸桿菌中進(jìn)行共表達(dá)。Chen等［35］將大腸桿菌的植酸酶基因appA融合AOX1啟動(dòng)子，在巴斯德畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，高密度培養(yǎng)后胞外植酸酶的產(chǎn)量達(dá)到5000 U/mL。Hong等［36］發(fā)現(xiàn)大腸桿菌的植酸酶基因可以在萌發(fā)的水稻種子中表達(dá)，酶活性比原菌株提高60倍，且對水稻植株的生長沒有任何影響。

此外，天然植酸酶的一些性質(zhì)可能不完全適合實(shí)際生產(chǎn)的要求，如抗逆性、有效性等，特別是植酸酶的熱穩(wěn)定性，而利用基因工程技術(shù)手段在分子水平上對基因進(jìn)行遺傳改造，則有望使這些性質(zhì)得到改善［37-38］。在技術(shù)上，通常采用點(diǎn)飽和突變技術(shù)對植酸酶編碼基因進(jìn)行改造，誘使其定向進(jìn)化，從而在短時(shí)間內(nèi)獲取大量突變子，并篩選符合生產(chǎn)需求的植酸酶［39］。目前已經(jīng)產(chǎn)業(yè)化的植酸酶大多是通過這種方式獲得，然而由于該方面的研究僅僅針對極少數(shù)的原酶基因展開，大大限制了植酸酶產(chǎn)業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，今后有必要加強(qiáng)對更多的植酸酶基因進(jìn)行相關(guān)研究，擴(kuò)大植酸酶基因的選擇范圍。隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，構(gòu)建高產(chǎn)、高活性及高穩(wěn)定性的產(chǎn)植酸酶基因工程菌株，植酸酶的應(yīng)用必將越來越廣泛。

5 植酸酶在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用

目前植酸酶主要應(yīng)用于飼料加工業(yè)，作為一種高效、無毒副作用和環(huán)保型的“綠色”飼料添加劑使用［9］。此外，植酸酶也可以應(yīng)用在食品工業(yè)及農(nóng)業(yè)領(lǐng)域［40］。相比較而言，植酸酶在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的研究略顯薄弱，研究內(nèi)容主要集中在兩個(gè)方面。

一方面是向土壤中施加外源植酸酶或可產(chǎn)生植酸酶的菌種作為土壤改良劑，研究其對土壤有機(jī)磷轉(zhuǎn)化及植物生長發(fā)育的影響［41］。例如，Gujar等［42］研究發(fā)現(xiàn)，植酸酶的施加可以減少土壤中大約30%的植酸，使有效磷含量提高1.18倍，且施加植酸酶土壤中水稻的生長狀況優(yōu)于對照組。蘇毅等［43］研究發(fā)現(xiàn)，施加外源植酸酶能夠顯著增加黃瓜苗的株高、玉米苗的干重和株高以及茼蒿苗的葉綠素含量，且3種植物幼苗的生長狀況與植酸酶的添加量呈顯著正相關(guān)。曲博等［44］研究了施加外源植酸酶對濕地土壤有機(jī)磷組分含量變化的影響及各組分隨時(shí)間的變化規(guī)律，發(fā)現(xiàn)添加外源植酸酶可以在短期內(nèi)提高土壤有機(jī)磷的有效性，促進(jìn)穩(wěn)定性有機(jī)磷向活性有機(jī)磷轉(zhuǎn)化，其作用效果與植酸酶添加量及培養(yǎng)時(shí)間呈顯著正相關(guān)。類似的研究報(bào)道還有很多，從這些研究結(jié)果可以看出，外源植酸酶在大多數(shù)情況下可以促進(jìn)磷的轉(zhuǎn)化，且作用效果主要受到植酸酶添加量的影響［45-47］。與此同時(shí)，植酸酶的作用效果同時(shí)也會(huì)受到植酸酶種類的影響［14］。自然界植酸酶類型多樣，催化機(jī)理各不相同，不同種類的植酸酶的作用效果可能會(huì)有很大差異。此外，目前的研究中所施加的外源植酸酶大多來源于通過基因工程技術(shù)定向改造的適用于動(dòng)物飼料加工產(chǎn)業(yè)的植酸酶產(chǎn)品，其在土壤環(huán)境條件下能否發(fā)揮最大效能并不可知，若僅僅依靠增加添加劑量來提高作用效果勢必會(huì)造成使用成本的極大提高。

另一方面是將植酸酶基因轉(zhuǎn)入植物體內(nèi)構(gòu)成轉(zhuǎn)基因植株，研究其對土壤磷素轉(zhuǎn)化的影響。目前該方面的研究在玉米［48-49］、擬南芥［50］、棉花［51］、煙草［52］及豆科某些植物［53-54］中進(jìn)行。研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)入植酸酶基因的玉米可顯著提高根際土壤植酸酶活性，增加植株對土壤有機(jī)磷的吸收，提高磷素利用率［49］，而植株分泌的外源植酸酶可能是提高土壤磷素利用率的主要因素［55］。但轉(zhuǎn)植酸酶基因作物的安全性問題一直是植酸酶植物基因工程面臨的重要問題，將來能否用轉(zhuǎn)基因植物大規(guī)模生產(chǎn)植酸酶，還取決于人們對轉(zhuǎn)基因植物的認(rèn)可以及產(chǎn)品的成本。

6 展望

植酸酶作為植酸降解過程中的關(guān)鍵酶，已被廣泛應(yīng)用于經(jīng)濟(jì)動(dòng)物的飼料添加及人類的食品加工等領(lǐng)域，能夠顯著提高動(dòng)物對植酸磷及礦質(zhì)元素的吸收效率，降低排泄物中的磷含量從而降低自然生態(tài)系統(tǒng)中的磷污染。然而，植酸酶作為土壤酶肥料的研究及在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后。植酸酶在土壤磷素循環(huán)中起著重要的生物催化劑的作用，研究表明向土壤中添加外源植酸酶可以顯著提高土壤磷的利用率，并顯著影響土壤穩(wěn)定性。因此，在磷肥全球需求不斷增長的大環(huán)境下，發(fā)掘自然界蘊(yùn)藏的豐富的植酸酶資源，合理利用其作為環(huán)境友好型的酶制劑對減少土壤磷肥的施用量將具有戰(zhàn)略意義。

植酸酶在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有極大的應(yīng)用潛力，然而迄今為止，農(nóng)用型的植酸酶產(chǎn)品的深度開發(fā)還是空白，市場上還沒有植酸酶相關(guān)的土壤改良制劑或生物肥料，人們對植酸酶在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用還需要一個(gè)逐漸認(rèn)識(shí)的過程。已有研究表明，土壤中含有豐富的植酸酶基因資源，然而目前有關(guān)土壤植酸酶資源發(fā)掘及利用的研究較少［24-26］。土壤中植酸酶的有效性和穩(wěn)定性可能受到土壤理化性質(zhì)及土壤微生物類群等多種因素影響，然而目前對這方面的認(rèn)識(shí)還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠［40］。鑒于此，今后的研究可以集中在以下幾個(gè)方面：（1）利用高通量的宏基因組技術(shù)開展我國土壤植酸酶的種類、多樣性及酶學(xué)性質(zhì)研究，發(fā)掘其作為土壤改良劑的應(yīng)用潛力；（2）優(yōu)選高活性的植酸酶菌種或重組載體，檢測其在土壤中的有效性、穩(wěn)定性及影響因素；（3）對具有開發(fā)潛力的植酸酶基因進(jìn)行基因組分析和遺傳分子改造［56］，提高植酸酶工程菌的發(fā)酵產(chǎn)量，選育適合土壤環(huán)境的性質(zhì)優(yōu)良的植酸酶工程菌株；（4）適合土壤環(huán)境的植酸酶菌制劑的開發(fā)和研制。