徐秀紅，郭國錦，呂桂華，盧華兵

(浙江省東陽玉米研究所，浙江 東陽 322100)

植酸，又名肌醇六磷酸，是成熟作物種子中含磷最豐富的化合物，占種子干重的1%以上，總磷含量的65% ～85%［1］。是種子萌發(fā)和幼苗生長所需肌醇和磷酸等營養(yǎng)成分的貯藏庫，是玉米籽粒中廣泛存在的一種有機酸 (肌醇六磷酸)。植酸可與Zn2+、Fe3+、Ca2+等金屬陽離子螯合形成植酸鹽，難以被人和非反芻動物 (豬、雞、魚等)消化利用，降低了磷元素以及與之結合的微量金屬元素、蛋白質和淀粉的生物有效性，尤其在發(fā)展中國家植酸是造成微量營養(yǎng)元素缺乏的主要原因，被認為是一種抗營養(yǎng)因子［2］。鰲合形成的植酸鹽因為不能被吸收利用，隨著糞便排出體外，進入水體后造成水體富營養(yǎng)化，繼而引起水體環(huán)境污染。另外，土壤中因為缺乏分解微生物，難以分解這些植酸鹽，即使畜禽糞便作為有機肥還田，也難以被農(nóng)作物吸收利用;大量磷肥的使用，也造成了不可再生磷資源的浪費，人類將會面臨磷礦短缺的局面。

培育低植酸作物，能夠降低植酸抗營養(yǎng)性，提高微量元素營養(yǎng)成分的生物有效性，可減少磷對環(huán)境的污染和動物飼料中磷元素的添加，這些已成為育種學家、營養(yǎng)學家和環(huán)境學家關注的焦點之一［3］。因此，作物低植酸種質的創(chuàng)新和品種選育近年來已成為育種家們研究的熱點，并先后在玉米、大麥、水稻、小麥、大豆等作物中創(chuàng)造出低植酸突變體。本文綜述了迄今為止玉米低植酸突變種質創(chuàng)新、突變體植酸含量變化、農(nóng)藝性狀及種子特性、突變的遺傳學研究方面的研究進展，并對低植酸玉米的研究前景進行展望。

1 低植酸玉米突變體的選育

低植酸作物的選育開始于1992年，主要是應用化學誘變劑 (疊氮化鈉，EMS)或γ-射線誘變。低植酸玉米最早是Raboy等［4］在1996年采用EMS化學誘變劑對玉米花粉進行誘變，育成了2份玉米低植酸突變體lpa1-1和lpa2-1，植酸含量分別下降66%和30%。Pilu等［5］通過 EMS誘導玉米花粉，育成了一份低植酸玉米突變體lpa241，其植酸下降90%。隨后，Shi等［6-8］利用轉座子插入和基因沉默的方式育成了3份玉米低植酸突變體lpa2、lpa3和lpa1，植酸分別下降30%、50%和93%。在國內(nèi)，低植酸玉米研究稍晚，2006年浙江大學核農(nóng)所王雪艷等［9］開始了玉米低植酸突變體的初步篩選，獲得了6個低植酸突變體，植酸下降幅度在43.94%～79.09%。中國農(nóng)科院于2007年9月10日宣布了轉植酸酶基因玉米的問世，并在2009年獲得了農(nóng)業(yè)部頒發(fā)的轉基因生物安全證書，成為我國首例獲得安全證書的糧食作物。之后，劉欣芳等［10-11］也開展對轉植酸酶基因玉米的獲得及其后代的初步鑒定。

目前，選育低植酸玉米的主要方法是:用EMS處理玉米花粉或者γ-射線處理干種子，M1代自交獲得M2代種子，混收;M2按單株種植，套袋授粉自交，按株收獲種子，形成株系。每株系取成熟的8粒M3種子，按Chen等測定無機磷 (Pi)含量的方法進行無機磷檢測，如果檢測到1粒以上呈高無機磷 (HIP)種子的單株，此單株將被認為是可能的突變株，8粒全部呈HIP的單株視為可能的純合低植酸突變體，繼續(xù)種植檢測，若還為純合，則可確認為低植酸突變體。研究表明，低植酸突變體的植酸含量下降都伴隨著無機磷含量的成倍增加［8］，且正常玉米中無機磷的含量很低，在0.3～0.5 mg·g-1，因此，篩選低植酸突變體可以通過種子的無機磷檢測來間接選擇［12］。

2 低植酸玉米突變體的植酸含量及其他成分含量的變化

玉米種子中植酸含量在8.3～22.2 mg·g-1，占種子干重的0.69%～1.14%，占種子全磷量的75%～80%，植酸主要的沉積部位是盾片層(胚)，占90%，只有10%在糊粉層［13-14］。玉米種子中植酸的含量一般受品種、種子成熟度、栽培地點及土壤氣候條件等影響，主要由品種的遺傳特性和環(huán)境條件決定的［12］。

有關研究表明，玉米低植酸突變體植酸含量的降幅達30% ～93%。最早Raboy等發(fā)現(xiàn)的lpa1-1和lpa2-1 2個突變體植酸的降幅分別為66%和50%，lpa1-1在植酸下降的同時，其無機磷含量同等比例升高，但肌醇和低價肌醇磷酸鹽中間物沒有積累;lpa2-1植酸含量下降伴隨無機磷的升高，五價或更低價的肌醇磷酸鹽含量上升，野生型中卻未積累相關的成分。與野生型相比，以上2種低植酸突變體的總磷含量都保持不變［2，4］。Pilu 等［5］發(fā)現(xiàn)的lpa241突變體，其與lpa1-1等位，但植酸的降幅為90%。Shi等［7］發(fā)現(xiàn)一個低植酸突變體，與lpa1和lpa2不等位，命名為lpa3，其植酸的降幅是50%，其植酸含量下降的同時，無機磷和肌醇含量顯著增加，未積累低價肌醇磷酸鹽中間物，總磷含量也保持不變。Shi等發(fā)現(xiàn)的另外2個突變體，按照其他成分含量的變化，分別歸類于lpa2和lpa1。

迄今為止，發(fā)現(xiàn)的玉米低植酸突變體多數(shù)總磷含量基本不變，在正常的環(huán)境條件下均能自然發(fā)芽，是非致死型突變體，但Larson等［5，15］在低植酸玉米研究中發(fā)現(xiàn)了一類突變體，其在正常的栽培環(huán)境條件下純合的突變體種子不能發(fā)芽，低植酸性狀只能通過雜合的株加以保留;Pilu等［5］在玉米低植酸的研究中共篩選到29份低植酸突變體，發(fā)現(xiàn)有28份是致死型的，其中18份可能由于胚特異性致死，另外的10份可能由于胚乳引起。

3 玉米低植酸突變體的農(nóng)藝性狀及種子特性變化

植酸在種子的萌發(fā)和植物的生長發(fā)育過程中起著重要作用，因此，研究所發(fā)現(xiàn)的絕大多數(shù)玉米低植酸突變體隨著植酸含量的下降，一些農(nóng)藝性狀和種子的品質特性也出現(xiàn)了變化，與對照野生型相比，突變體的發(fā)芽率和成苗率降低，種子的干重下降，繼而產(chǎn)量下降，抗逆性變差，生育期延遲等。

Raboy等［4］在研究低植酸玉米時發(fā)現(xiàn)，與對照相比，lpa1-1雜合型的發(fā)芽、莖葉長度、種子成熟時的含水量以及花期等農(nóng)藝性狀都沒有顯著的差異，但其產(chǎn)量比對照減產(chǎn)8% ～23%，lpa2-1減產(chǎn)4%～16%。大部分低植酸突變體純合狀態(tài)下種子具有活力，包括一些植酸含量幾乎接近零的突變體，但其產(chǎn)量性狀都會變差，植酸含量下降小于75%時，與野生型相比，產(chǎn)量損失一般在5%～15%;當植酸含量下降幅度巨大，達到90%～98%時，突變體的生長發(fā)育就會受到嚴重的影響，甚至會死亡，這些都將導致產(chǎn)量嚴重下降［2］。Pilu等［5］在研究低植酸玉米突變體lpa241時發(fā)現(xiàn)，與對照相比，突變體的發(fā)芽率下降了30%，但其生長發(fā)育卻沒有受到顯著影響。

此外，還有一些研究表明，轉基因技術育成若干玉米低植酸突變體，其在農(nóng)藝性狀和種子的品質特性上與親本沒有顯著的區(qū)別。運用反向遺傳學方法，利用Mu轉座子插入和球蛋白的胚特異性啟動子構建的基因沉默載體，Shi等［12］獲得玉米低植酸突變體lpa3、lpa2和lpa1，突變并沒有影響一般田間條件下的種子發(fā)芽率，種子干重也沒有顯著下降。中國農(nóng)科院范云六等［11］自主研發(fā)的轉植酸酶基因玉米，是從曲霉屬的一種真菌中分離出能產(chǎn)生植酸酶的基因，并把它插入玉米基因組中而獲得的，這種轉植酸酶基因玉米在種子發(fā)芽率、生長速度和產(chǎn)量上都沒有受到影響。

4 玉米低植酸突變的遺傳學研究

4.1 遺傳模式

研究證實，目前所獲得的玉米低植酸突變均為隱性突變，共出現(xiàn)3類突變體，分別受1對非等位隱性基因控制，如純合的lpa1/lpa1和lpa2/lpa2雜交，后代植酸水平正常，說明這2個突變位點互不等位;而Shi等獲得的低植酸突變體與lpa1和lpa2雜交后，發(fā)現(xiàn)其與這2個突變位點互不等位，定為lpa3。這些突變體的雜合型后代分離比例基本符合，野生型∶雜合型∶低植酸基因型1∶2∶1，野生型∶低植酸型表現(xiàn)型為3∶1的遺傳模式。

研究中還發(fā)現(xiàn)，有些分離后代中純合單株的比例低于理論值，即在后代的分離群體中純合的低植酸植株較少，這可能與其發(fā)芽力下降有關系。

4.2 基因定位及克隆

在玉米中，已發(fā)現(xiàn)3類純合低植酸突變體lpa1、lpa2和lpa3，且都位于1S染色體上，其中l(wèi)pa1-1突變位點與RFLP分子標記umc157相連鎖，遺傳距離為7.7 cM［4］;lpa2-1突變位點則與RFLP分子標記umc167相連鎖，遺傳距離為10 cM［14］。另一個玉米低植酸突變體 lpa241，與lpa1等位，與RFLP分子標記umc1222相距大約9.2 cM［5］。

在種子的發(fā)育過程中，植酸合成途徑中任何一步的酶發(fā)生突變或植酸的運輸途徑受阻，就會造成植酸的合成或積累受抑制，引起種子植酸含量的下降，產(chǎn)生低植酸突變體［15］。一個突變體植酸含量的下降，可能是植酸合成的2個底物——肌醇和無機磷的合成或供應受阻導致，也可能是2個底物轉化成磷酸鹽的過程受阻，還有可能是植酸的運輸或者其他基因調控引起。因此，了解植酸的代謝途徑(圖1)，對研究低植酸突變體非常重要，圖1中與植酸代謝途徑相關的基因已經(jīng)相繼被克隆出來［16］。

迄今為止，作物中發(fā)現(xiàn)的低植酸突變基因有很多，大豆中發(fā)現(xiàn)的突變基因主要是肌醇磷酸合成酶(MIPS)基因［17-18］和抗藥相關蛋白 (MRP)基因［19］，擬南芥中發(fā)現(xiàn)的主要是肌醇磷酸激酶(AtIPK1和AtIPK2β)基因［20］，水稻中發(fā)現(xiàn)的有肌醇激酶 (MIK)基因［21］和 MRP 基因［22］，大麥中發(fā)現(xiàn)的有硫轉運蛋白 (HvST)基因［23］。在玉米中目前發(fā)現(xiàn)的3個低植酸突變的基因已經(jīng)被克隆出來，玉米 lpa1突變是由于1個 MRP基因(ZmMRP4)突變導致，它編碼一個MRP-ABC(ATP結合盒)轉運蛋白，構建基因沉默載體使其沉默后，產(chǎn)生了植酸含量下降無機磷升高的玉米低植酸突變體lpa1;玉米lpa2突變是由于一個肌醇磷酸激酶 (ZmIpk)基因序列的重排導致，在ZmIpk基因的編碼序列核苷酸158位置上，DNA序列發(fā)生由C到T突變，在開放閱讀框的N-末端產(chǎn)生一個終止密碼子，僅有34個氨基酸，蛋白翻譯終止，促使肌醇磷酸激酶活性下降，多磷酸肌醇的合成減少，突變體的植酸含量下降約30%，無機磷含量增加約3倍，肌醇和肌醇磷酸鹽IP3、IP4和IP5得到積累;玉米lpa3突變則是由于MIK基因發(fā)生突變引起，它使催化肌醇和磷酸生成肌醇-3-磷酸的步驟受抑，最終導致植酸含量的下降［12］。

圖1 植物體內(nèi)植酸的代謝途徑及引起植酸含量下降的已報道突變基因

5 展望

玉米是糧食、飼料和經(jīng)濟兼用型作物，玉米總產(chǎn)量的75%用于飼料加工，是飼料原料總量的60%。低植酸玉米直接作為飼料，可提高動物對微量金屬元素的吸收利用，提高其生物有效性，有效改善微量金屬元素缺乏癥，同時可減少其糞便中的磷含量，提高磷的利用率，減少環(huán)境中的磷污染，達到綠色環(huán)保的目的;或以低植酸玉米為原料生產(chǎn)飼料，在生產(chǎn)過程中可不加植酸酶或降低其使用量，從而降低生產(chǎn)成本，增加畜禽對飼料中的鈣、鐵、鋅等金屬微量營養(yǎng)元素的吸收和利用，提高其生物有效性。因此，低植酸玉米的研究應用前景廣闊。

研究表明，低植酸突變會使農(nóng)藝性狀變差，種子的品質和特性一定程度上變劣，這說明植酸含量的下降與產(chǎn)量的下降呈正相關［24］。產(chǎn)量性狀的下降表明，直接利用低植酸突變體育種存在一定難度，但對產(chǎn)量影響較小的突變也可用于育種，選擇不同的低植酸突變基因可減少農(nóng)藝性狀變差和種子品質變劣［25］。另外，還可以通過多次回交、雜交等改良低植酸品種的產(chǎn)量性狀。此外，研究結果表明，大多數(shù)轉基因玉米其農(nóng)藝性狀和種子特性沒有受到影響，這也給低植酸玉米育種帶來新手段。隨著低植酸玉米育種技術的不斷成熟，具有營養(yǎng)和環(huán)境雙重功能的低植酸玉米雜交種的選育將為改善動物和人類的營養(yǎng)、減少環(huán)境污染等作出巨大貢獻。

［1］ Raboy V.Accumulation and storage of phosphate and minerals［G］ //Larkins B A，Vasil I K.Cellular and Molecular Biology of Plant Seed Development. Dordrecht，the Netherlands:Kluwer Academic Publishers，1997:441-477.

［2］ Raboy V.Seeds for a better future:“l(fā)ow phytate”grains help to overcome malnutrition and reduce pollution ［J］.Trends in Plant Sci，2001，6(10):458-462.

［3］ Lott J N A，Ockenden I，Raboy V，et al.Phytic acid and phosphorus in crop seeds and fruits:a global estimate ［J］.Seed Sci Res，2000，10:11-33.

［4］ Raboy V，Gerbasi P F，Young K A，et al.Origin and seed phenotype of maize low phytic acid 1-1 and low phtic acid 2-1 ［J］.Plant Physiol，2000，124:355-368.

［5］ Pilu R，Panzeri D，Gavazzi G，et al.Phenotypic，genetic and molecular characterization of a maize low phytic acid mutant(lpa 241)［J］.Theor Appl Genet，2003，107:980-987.

［6］ Shi J R，Wang H Y，Wu Y S，et al.The maize low-phytic acid mutant lpa2 is caused by mutation in an inositol phosphate kinase gene ［J］.Plant Physiol，2003，131:507-515.

［7］ Shi J R，Wang H Y，Hazebroek J，et al.The maize lowphytic acid 3 encodes a myo-insitol kinase that plays a role in phytic acid biosynthesis in developing seeds ［J］.T Plant J，2005，42:708-719.

［8］ Shi J R，Wang H Y，Schellin K，et al.Embryo-specific silencing of a transporter reduces phytic acid content of maize and soybean seeds ［J］. NatBiotechnol， 2007， 25:930-937.

［9］ 王雪艷，王忠華，梅淑芳，等.高無機磷低植酸玉米突變體篩選初報［J］.核農(nóng)學報，2006，20(1):15-18.

［10］ 劉欣芳，高曉蓉，蘇喬，等.轉植酸酶基因玉米的獲得及其后代的初步鑒定 ［J］.玉米科學，2008，16(1):15-19.

［11］ 張琪，陳茹梅，楊文竹，等.組成型表達轉植酸酶基因(phyA2)玉米的獲得［J］.農(nóng)業(yè)生物技術學報，2010，18(4):623-639.

［12］ 徐秀紅.一個植酸代謝相關水稻基因的定位、克隆與特性研究［D］.杭州:浙江大學，2009.

［13］ Raboy V.Low-phytic-acid grains ［J］.Food Nutr Bull，2000，21:423-427.

［14］ Larson S R，Raboy V.Linkage mapping of maize and barley myo-inositol1 - phosphate synthase DNA sequences:correspondence with a low phytic acid mutation ［J］.Theor Appl Genet，1999，99:27-36.

［15］ RaboyV.The ABCsoflow-phytate crops ［J］.Nat Biotechnol，2007，25:874-5.

［16］ Raboy V.Forward Genetics Studies of Seed Phytic Acid ［J］.Israel Journal of Plant Sciences，2008，55:171-181.

［17］ Hitz W D，Carlson T J，Kerr P S，et al.Biochemical and molecular characterization of a mutation that confers a decreased raffinosaccharide and phytic acid phenotype on soybean seeds［J］.Plant Physiol，2002，128:650 –660.

［18］ Yuan F J，Zhao H J，Ren X L，et al.Generation and characterization of two novel low phytate mutations in soybean(Glycine max L.Merr) ［J］.Theor Appl Genet，2007，115:945-957.

［19］ Gillman J D，Pantalone V R，Bilyeu K.The low phytic acid phenotype in soybean line CX1834 is due to mutations in two homologs of the maize low phytic acid gene ［J］.Plant Genome，2009，2:179-190.

［20］ Stevenson-Paulik J， BastidasR J， Chiou S T， etal.Generation ofphytate-free seeds in Arabidopsis through disruption of inositol polyphosphate kinases［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2005，102:12612–12617.

［21］ Kim S I，Andaya C B，Newman J W，et al.Isolation and characterization of a low phytic acid rice mutant reveals a mutation in the rice orthologue of maize MIK ［J］.Theor Appl Genet，2008，117:1291-1301.

［22］ Xu X H，Zhao H J，Liu Q L，et al.Mutations of the multidrug resistance-associated protein ABC transporter gene 5 result in reduction of phytic acid in rice seeds［J］.Theor Appl Genet，2009，119:75-83.

［23］ Ye H X，Zhang Z Q，Broughton S，et al.A nonsense mutation in a putative sulphate transporter gene results in low phytic acid in barley ［J］.Funct Integr Genomics，2011，11:103-110.

［24］ Zhao H J，Liu Q L，HW F U，et al.Effect of non-lethal low phytic acid mutations on grain yield and seed viability in rice［J］.Field Crops Res，2008，108:206-211.

［25］ Yuan F J，Zhu D H，Deng B，et al.Effects of two low phytic acid mutations on seed quality and nutritional traits in soybean［J］.Agricultural and Food Chemistry，2009，57(9):3632-3638.